Organotypische hippocampus Slice culturen

Het algemene doel van deze procedure is het kweken van organotypische hippocampuscoupes. Dit wordt bereikt door eerst de hippocampus te dissekeren. De tweede stap van de procedure is het snijden van de hippocampus.

De derde stap van de procedure is het scheiden en sorteren van de hippocampale plakken. De laatste stap van de procedure is het kweken van de hippocampale plakken. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die gezonde organische hippocampale plakken tonen via visualisatie met een dissectiescoop of een microscoop.

Hallo, mijn naam is Jimena Opitz en ik ben een onderzoeker in het laboratorium van Dr. Andres bar aan de University of Washington in Seattle. Ik zal de procedure voor de organotypische kweek van hippocampus-plakjes demonstreren. Over het algemeen hebben mensen die nieuw zijn met deze methode moeite met de noodzaak om de hippocampus snel te dissekeren en in plakjes te snijden, en om contaminatie te voorkomen, is een steriele dissectie-oplossing en plakjeskweek essentieel.

Media kunnen tot drie weken van tevoren worden bereid en bewaard bij vier graden Celsius, zoals beschreven in het schriftelijke protocol. Voordat de hippocampale coupes worden gemaakt, kunnen de culturen worden voorbereid. Het is noodzakelijk om zowel de weefselkweekkast als de apparatuur die bij de dissectie wordt gebruikt, correct te steriliseren.

Veeg eerst het binnenoppervlak van de weefselkweekkast af met 70% ethanol. Plaats vervolgens de dissectiemicroscoop en alle dissectie-instrumenten in de kast. Bereid de weefselsnijder voor door een schoon stuk Teflon-vel op de tafel te plaatsen en een nieuw mesje te monteren.

Plaats de weefselsnijder in de weefselkweekkap en steriliseer alle oppervlakken en apparatuur gedurende 15 minuten met behulp van UV-licht. Schakel het licht uit zodra het UV-sterilisatieproces is voltooid. Werk vervolgens in de weefselkweekkap.

Bereid eerst de zes-well weefselkweekplaten voor die worden gebruikt voor het kweken van de hippocampale coupes. Pipetteer 750 µL SEM in elke well van de zes-well plaat. Plaats vervolgens met een steriele pincet een cellculture-insert in elke well van de weefselkweekplaat.

Zorg ervoor dat er geen luchtbellen onder de insert worden ingesloten. Het is belangrijk dat het membraan van elke celkweekinsert is bevochtigd met slice-kweekmedium. Als het membraan droog is, controleer dan of er geen luchtbellen aanwezig zijn.

Als het membraan boven de meniscus van het SCM ligt, kan er meer medium aan het welltje worden toegevoegd. Plaats de voorbereide kweekplaten in een weefselkweekincubator. Stel deze in op 35 °C met 5% koolstofdioxide tot ze nodig zijn.

Vul tot slot een ijsemmer met een ijs-zoutmengsel en plaats deze naast het onthoofdingsgebied in de zuurkast. Vul een bekerglas van 100 milliliter met dissectieoplossing. Zet het bekerglas in het ijs-zoutmengsel en belucht de oplossing gedurende 10 tot 20 minuten met 5% carbon dioxide en 95% oxygen totdat de kleur verandert van roze naar oranje.

En de dissectie-oplossing vormt een slurry-mengsel van bevroren en vloeibare oplossing. Nu zijn de dissectie-omgeving en de weefselkweekplaten klaar voor dissectie. P3 tot P7 wrap.

Voor deze procedure worden pups gebruikt. Slice-culturen kunnen worden voorbereid van maximaal drie pups tegelijk. Deze procedure wordt geïllustreerd aan de hand van één pup.

Oogst snel de hersenen uit de gedecapiteerde wrap-pop en plaats deze gedurende één minuut in het bekerglas van 100 milliliter met de dissectie-oplossing Slurry Chill. Bereid tijdens deze tijd een dissectieschaal voor door ongeveer 10 milliliter ijskoude dissectie-oplossing toe te voegen aan de bodem van een weefkweekschaal van 60 millimeter. Gebruik een ronde lepel of microspatel om de hersenen vanuit het bekerglas van 100 milliliter over te brengen naar de schaal van 60 millimeter die gevuld is met koud dissectiemedium. Zorg ervoor dat de hersenen volledig bedekt zijn door de dissectie-oplossing.

Plaats de schaal met de hersenen onder de dissectiemicroscoop. Kijk door de dissectiemicroscoop en lokaliseer de hersenen. Gebruik steriele dissectie-pincetten om de hersenen naar het midden van het gezichtsveld te verplaatsen.

Houd de hersenen in de middellijn door de dissectiepen tegen de bodem van de schaal te drukken. Gebruik het dissectie-instrument voor de hippocampus om de corticale hemisferen voorzichtig van de middenhersenen weg te pellen terwijl de middenhersenen op hun plaats blijven; bij voorkeur zonder de corticale hemisferen los te maken van de rest van de hersenen, waardoor de hippocampus nu bloot komt te liggen. Gebruik het dissectie-instrument voor de hippocampus om de hippocampus uit één hemisfeer uit te scheppen.

Gebruik vervolgens de dissectienaald om zoveel mogelijk niet-hippocampaal weefsel te verwijderen. Zodra de eerste hippocampus is geïsoleerd en gereinigd, wordt dit proces herhaald voor de tweede hippocampus uit de andere hemisfeer. Gebruik daarna een steriele schaar om de punt van een P 1000 filterpipetpunt af te knippen.

Plaats de pipetpunt op een steriele P 1000 pipet. Aspireer voorzichtig één hippocampus en pipetteer deze op het Teflon-vel op de weefselsnijder. Plaats vervolgens op dezelfde wijze de tweede hippocampus op de snijder.

Plaats de hippocampuushalven op hun concave zijden en richt ze loodrecht op het mes; aspireer overtollig vloeistof van het Teflon-vel. Zet de micrometer op de nulpositie. Snijd de hippocampi in secties van 400 micrometer.

Bereid een andere afgeknipte P 1000 filtertip voor en bevestig deze op een steriele P 1000 pipette. Giet ongeveer 10 milliliters koud SCM in een steriele weefselkweekschaal van 60 millimeter. Voeg met de pipette wat medium toe en breng de hippocampale coupes van de slicer over naar de schaal.

Voorkom het ontstaan van luchtbellen nadat het overdrachtsproces voor alle plakjes is herhaald en plaats de schaal onder de dissectiemicroscoop. Scheid vervolgens de plakjes voorzichtig van elkaar met behulp van een irisspatel en een rechte spatel.

Scheid de goed gedefinieerde en onbeschadigde coupes van eventuele beschadigde coupes. De goed gedefinieerde hippocampale coupes zijn nu klaar om te worden gekweekt. Haal de eerder voorbereide zes-wells tissue culture-platen met SCM en celkweekinserts uit de incubator en breng met een P 1000 met een afgeknipt breed boar-tip vier tot vijf individuele coupes per membraan over.

Gebruik indien nodig de irisspatel om de plakjes te scheiden. Let erop dat de plakjes niet te dicht bij de wand van de insert of te dicht bij elkaar worden geplaatst. Aspireer voorzichtig het overtollige medium van het bovenoppervlak van de celcultuur, zonder de plakjes aan te raken.

Plaats het membraan. Plaats tenslotte de plaat, die nu de hippocampaal-snede-culturen bevat, terug in de weefselkweekincubator. Stel deze in op 35 °C en 5% koolstofdioxide.

Haal na 48 uur de plaat uit de incubator terwijl u in de weefselkweekkap werkt. Aspireer het medium met een posterior pipette. Voeg 750 µL vers voorverwarmd SCM per put toe.

Zorg er opnieuw voor dat er geen luchtbellen zijn ontstaan onder het membraan van de celkweekinsert. Dit is een voorbeeld van een gezonde hippocampale slice die klaar is om gekweekt te worden. De regio's van de hippocampus, CA1, CA3 en de gyrus dentatus, zijn duidelijk zichtbaar en onbeschadigd.

Hier wordt een beschadigde hippocampussnede getoond die niet voor cultuur is gebruikt. Ten slotte is dit een voorbeeld van een gezonde hippocampussnede na vier dagen in cultuur. Let erop dat de snede er wit uitziet onder de dissectiemicroscoop en dat het oppervlak van de snede schoon is.

De CA1, CA3 en gyrus dentatus, regio's van de hippocampus, zijn duidelijk zichtbaar en onbeschadigd. Zodra u dit beheerst, kan deze techniek in ongeveer een uur worden uitgevoerd als deze correct wordt uitgevoerd.

Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het zeer belangrijk om rekening te houden met passende steriele technieken en voorzichtig met het weefsel om te gaan. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u organotypische hippocampaal lysis kunt kweken.

Bedankt en veel succes met uw experimenten.