Kwantificering van dsDNA het gebruik van de Hitachi F-7000 fluorescentie Spectrophotometer en PicoGreen Dye
5 november 2010
Demonstratie van kwantificering van dsDNA met behulp van Molecular Probes PicoGreen kleurstof en Hitachi F-7000 fluorescentie Spectrofotometer uitgerust met een microplaat reader accessoire.
Het algemene doel van deze procedure is om de capaciteit van de F 7, 000 fluorescente spectrofotometer met Microplate-lezer aan te tonen om twee strengen DNA-kwantificering uit te voeren met behulp van Pico groen kleurstof. Dit wordt bereikt door eerst de monsters en reagentia voor te bereiden. De tweede stap van de procedure is het instellen van het instrument.
De derde stap van de procedure is het laden van monsters in de Microplate-lezer. De laatste stap van de procedure is het uitvoeren van de meting van standaarden en monsters. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die een lineaire calibratiecurve laten zien, die kan worden gebruikt voor dubbelstrengs DNA-kwantificering van onbekende monsters.
Schakel de Hitachi F 7, 000 Spectra Fluorimeter in om de Xenon-lamp één uur te laten opwarmen in Excel. Maak een bestand met de standaard- en monstergegevens en sla het op in komma-gescheiden waarden of CSV-indeling. Om de fluorimeter eerst in te stellen, klikt u op de methodeknop die het analysemethodevenster opent.
Selecteer in het meetveld fotometrie uit het vervolgkeuzemenu. Klik nu op het tabblad kwantificeren. Selecteer in het veld kwantificeringstype golflengte om aan te geven dat de fluorescentiemeting wordt gedaan met een opgegeven golflengte.
Selecteer voor het kalibratietype eerst orde en selecteer voor het aantal golflengten één. Voer nanogram per milliliter in voor de concentratie-eenheid. Zorg ervoor dat handmatige kalibratie en force curve through zero niet zijn aangevinkt voor digit Na de komma, selecteer twee, voer nul in voor de onderste concentratielimiet en 10.000 voor het veld met de bovenste concentratielimiet.
Klik vervolgens op het tabblad instrument en selecteer in het veld gegevensmodus fluorescentie. Controleer of het veld haaksnelheid inactief is, omdat het alleen wordt gebruikt voor fosforescentiemetingen. Selecteer in het veld golflengtemodus beide WL vast in het veld ex WL één, voer 480 nanometer in het veld EM WL één in.
Voer 520 nanometer in. Laat alle andere velden onder EX en EM inactief. Stel zowel de ex-slet als de EM-slet op 5,0 nanometer.
Gebruik de vervolgkeuzemenu's, laat het vak voor het PMT-voltage één tot 1000 volt veld ongeselecteerd. Selecteer voor het PMT-voltage 700 volt uit het vervolgkeuzemenu. Selecteer ook twee voor automatische statistische berekening nummer één voor replica's 0,1 seconden voor integratietijd en nul voor vertraging.
Open nu het monitortabblad en stel het veld why axis max in op 10.000 en why axis min op nul. Selecteer vervolgens het vak links van de open gegevensverwerking na gegevensverwerving en, indien nodig, het vak links van de afdrukrapport na gegevensverwerving voor een rapport dat automatisch wordt afgedrukt na voltooiing van de metingen. Klik ten slotte op het tabblad algemeen om alle geselecteerde parameters in de verschillende tabbladen van het analysemethodevenster op te slaan en sla ze op onder een nieuwe bestandsnaam op een opgegeven locatie.
Klik op de knop oké om dit venster te sluiten. Dit voltooit het instellen van de instrumenttestparameters. Om de microplate-lezer in te stellen, klikt u op de MPR-knop om het MPR-instellingenvenster naar de voorgrond te brengen.
Selecteer eerst putjes voor de standaarden. Klik bijvoorbeeld op de A één-positie en sleep de muis naar E één. Klik vervolgens op de knop standaardset.
Dit zal de posities selecteren die worden gebruikt voor de standaarden, zoals gemarkeerd in groen. Selecteer vervolgens posities voor de monsters. Klik en sleep de muis op dezelfde manier over de overeenkomstige posities op de plaat en klik vervolgens op de knop monsterset, die de geselecteerde posities automatisch in het geel zal markeren.
Herhaal dezelfde handeling voor de posities van de gewenste monstermetingen. Om de standaard- en monsterinformatie op het eerder voorbereide komma-gescheiden variabelenbestand te laden. Klik op het tabblad putinformatie van het MPR-instellingenvenster.
Selecteer de knop putinformatie laden en er wordt een Windows Explorer-venster geopend om het putinformatie dot csv-bestand te identificeren. Na het laden van de informatie, zou het venster als een tabel moeten worden weergegeven. Om een werkoplossing van Pico groen reagens voor te bereiden, voegt u 50 microliter 200 X pico groen reagens toe aan 9,95 milliliter TE-buffer.
Voor de standaardcurve bereidt u seriële verdunningen van Lambda dubbelstrengs DNA in TE-buffer voor de uiteindelijke concentraties, variërend van één tot 100 nanogram per milliliter. Pipetteer 150 microliter van elke standaard in aangewezen putjes van een 96-well plate plaat. Pipetteer vervolgens 150 microliter van elk testmonster in de overeenkomstige aangewezen putjes van de plaat. Voeg nu met behulp van een multipipet 150 microliter Pico groen-oplossing toe aan elke put en meng de oplossing en DNA-monsters.
Incubeer de plaat voorzichtig in een donker gebied gedurende twee tot vijf minuten om de reactie te ontwikkelen. Klik op de knop MPR-displayscherm om het MPR-instellingenvenster bovenop het scherm te brengen en klik op de knop positie wijzigen. Het houderplatform van de microplaat zal naar de voorkant van het instrument bewegen, open de deur van de microplate-lezer en plaats de 96-well plate op het houderplatform met de A één-put naar de voorkant en sluit de deur van de Microplate-lezer.
Klik op de knop initiële positie om positie A één van de microplaat in de meetpositie te plaatsen. Klik op de knop monitorweergave om het meetvenster bovenop het scherm te brengen. Klik op de knop meten om de standaarden en onbekende monsters te meten.
Een goede calibratiecurve wordt geëvalueerd met behulp van de verschillende parameters die worden geleverd door de F 7, 000 software. Deze ideale calibratiecurve die is verkregen voor kwantificering van dubbelstrengs DNA met behulp van Pico groen kleurstof heeft een berekende determinatiecoëfficiënt van 0,99993. Het beschreven hoge doorvoersysteem is een seriële assemblage van technologieën, waaronder Pico Green Dye, een Hitachi F 7, 00
Overzicht
Dit artikel demonstreert de kwantificering van dubbelstrengs DNA (dsDNA) met behulp van PicoGreen-kleurstof en de Hitachi F-7000 fluorescentiespectrofotometer met een microplate-lezer. De procedure beschrijft de voorbereiding van monsters, de instelling van het instrument en de meetprocessen om een lineaire kalibratiecurve voor de kwantificering van dsDNA te verkrijgen.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschapsgebied
- Fluorescentiespectroscopie
- DNA-kwantificatie
- Microplate-reader-technologie
Achtergrond
- PicoGreen-kleurstof is een gevoelige fluorescerende kleurstof die wordt gebruikt voor het kwantificeren van dsDNA.
- De Hitachi F-7000 is een veelzijdige fluorescentiespectrofotometer.
- Nauwkeurige DNA-kwantificering is essentieel voor diverse biologische experimenten.
- High-throughput-systemen vergemakkelijken de gelijktijdige analyse van meerdere monsters.
Doel van de studie
- Om de capaciteit van de F-7000 spectrofotometer aan te tonen voor de kwantificering van dsDNA.
- Om een betrouwbare methode vast te stellen voor het meten van onbekende DNA-monsters.
- Om een lineaire kalibratiecurve op te stellen voor een nauwkeurige kwantificering.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van het PicoGreen-reagens en DNA-standaarden.
- Instellen van de parameters van de Hitachi F-7000 spectrofotometer.
- Laden van monsters in de microplaatlezer.
- Meting van fluorescentie om een kalibratiecurve te genereren.
Belangrijkste resultaten
- Er werd een lineaire kalibratiecurve vastgesteld voor de kwantificering van dsDNA.
- De methode vertoonde een hoge gevoeligheid en nauwkeurigheid.
- De resultaten lieten een determinatiecoëfficiënt van 0,99993 zien.
- Het systeem analyseerde kleine hoeveelheden dsDNA effectief.
Conclusies
- De combinatie van PicoGreen-kleurstof en de F-7000 spectrofotometer biedt een robuuste methode voor DNA-kwantificatie.
- Deze high-throughput aanpak voldoet aan de eisen voor nauwkeurige analyse in biologisch onderzoek.
- De methode kan worden toegepast in diverse studies waarbij precieze DNA-metingen vereist zijn.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
Nauwkeurige kwantificering van dubbelstrengs DNA is een fundamentele vereiste voor targetvalidatie, assayontwikkeling en het genereren van preklinische modellen in biofarmaceutische R&D. De Hitachi F-7000 fluorescentiespectrofotometer met PicoGreen-kleurstof maakt hooggevoelige high-throughput meting van dsDNA mogelijk, wat bijdraagt aan het betrouwbaar genereren van standaardcurves voor downstream toepassingen. Deze methode biedt voorspellende zekerheid bij de kwantificering van nucleïnezuren, waardoor de variabiliteit in vroege discovery-workflows wordt verminderd en schaalbare, reproduceerbare datagenerering mogelijk wordt gemaakt bij compound-screening en biomarkerstudies.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt nauwkeurige meting van dsDNA-concentraties mogelijk voor klonering, transfectie en PCR-gebaseerde assays voor targetvalidatie.
- Operationele waarde: Ondersteunt reproduceerbare monstervoorbereiding en kwantificering, waardoor technische variabiliteit in hypothese-gestuurde experimenten wordt verminderd.
- Voorspellende waarde: Genereert lineaire kalibratiecurves met hoge determinatiecoëfficiënten (R² > 0,999), wat zorgt voor een nauwkeurige kwantificering van onbekende monsters in studies naar target-interactie.
Screening & assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Biedt kwantitatieve fluorescentie-uitlezingen die compatibel zijn met 96-well formats voor assay-standaardisatie en reagentia-titratie.
- Operationele waarde: Maakt snelle meting van 96 wells in minder dan 60 seconden mogelijk met behulp van de kinetiekmodus, wat de gereedheid voor high-throughput screening ondersteunt.
- Schaalbaarheid: De software maakt het mogelijk om microplaatconfiguraties op te slaan en terug te halen, wat een consistente assay-opzet tussen teams en projecten faciliteert.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele Continuïteit: Levert betrouwbare dsDNA-kwantificering voor biomarkeranalyse, PCR-validatie en vectorproductie in preklinische modellen.
- Risicobeheersing: Een hoge gevoeligheid (50 picomol fluoresceïne-equivalent) en een breed dynamisch bereik (5 grootteordes) maken nauwkeurige kwantificering over verdunningsreeksen mogelijk, waardoor fout-negatieve resultaten bij targets met een lage abundantie worden verminderd.
- Workflow-integratie: Exporteert gegevens naar Excel of rapportformaten, wat een naadloze overdracht naar bio-informatica- en analytische pipelines mogelijk maakt.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm, van vroege targetvalidatie via lead-identificatie tot preklinische ontwikkeling, waarbij een nauwkeurige kwantificering van nucleïnezuren essentieel is voor de reproduceerbaarheid van experimenten en de integriteit van de gegevens.
- Discoverybiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing door nauwkeurige dsDNA-meting mogelijk te maken voor kloidningefficiëntie, genexpressieanalyse en mutagenesestudies.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve fluorescentie-outputs die de robuustheid van assays en de normalisatie van verbindingenbibliotheken ondersteunen.
- Analytiek: Genereert lineaire kalibratiecurven en determinatiecoëfficiënten (R²) die vergelijking tussen experimenten en kwaliteitscontrole mogelijk maken.
- Translationeel onderzoek: Verbindt met preklinische continuïteit via betrouwbare kwantificering van DNA in geneesmiddelformuleringen, virale vectoren en biomarker-assays.
- Bedrijfsvoorzieningen en hergebruik: Configureerbare software en gestandaardiseerde protocollen maken hergebruik tussen afdelingen mogelijk, waardoor de herontwikkeling van methoden wordt verminderd en de operationele efficiëntie toeneemt.
Operationele en bedrijfsmatige impact
- Wetenschappelijke waarde: Hoge sensitiviteit en specificiteit voor dsDNA verminderen valse signalen en verbeteren de betrouwbaarheid van de gegevens in moleculaire assays.
- Operationele waarde: Geautomatiseerde gegevensverzameling, opslag en presentatie via software minimaliseren handmatige handelingen en transcriptiefouten.
- Strategische waarde: Betrouwbare kwantificering ondersteunt go/no-go-beslissingen bij lead-optimalisatie door nauwkeurige dosering en normalisatie in functionele assays te garanderen.
- Impact op portfolio: Maakt risicogebaseerde prioritering mogelijk door betrouwbare nucleïnezuurgegevens te leveren voor kandidaatselectie en formulatiestudies.
Overwegingen voor implementatie
- Kennis van fluorescentiespectroscopie en het bedienen van een microplate-lezer is vereist.
- Toegang tot een Hitachi F-7000 spectrophotometer met microplate-lezer accessoire en compatibele software is noodzakelijk.
- Gestandaardiseerde reagenspreparatie (verdunning van PicoGreen in TE-buffer) en monsterbehandeling zijn vereist om fluorescence quenching te voorkomen.
- Omvat optimalisatie van de incubatietijd (2–5 minuten in het donker) en golflengte-instellingen (Ex 480 nm, Em 520 nm) voor een consistente signaalwaarde.
- Omvat praktische beperkingen zoals de noodzaak voor incubatie in het donker en mogelijke interferentie door contaminanten of organische oplosmiddelen.
