Name: Kwantificering van dsDNA het gebruik van de Hitachi F-7000 fluorescentie Spectrophotometer en PicoGreen Dye (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-05T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Leer de kwantificering van dubbelstrengs DNA met PicoGreen kleurstof en de Hitachi F-7000 fluorescentiespectrofotometer. Deze methode genereert een lineaire kalibratiecurve voor nauwkeurige DNA-bepaling in biologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Instrument Setup <ol><li> Zet de spectrofluorometer en laat opwarmen gedurende 1 uur. </li><li> Met behulp van Excel een bestand met de normen en Sample data, zoals weergegeven in figuur 1 en sla het op in gescheiden door komma&#39;s waarden &quot;csv&quot; formaat. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig1.jpg" alt="Figuur 1" /> Figuur 1. Standaarden en monsters gegevens. </li><li> Stel fluorometer als volgt: <ol><li> Klik op de <img src="/files/ftp_upload/2465/2465icon1.jpg" alt="Icoon 1" /> drukt, wordt dit open de analysemethode venster, zoals getoond in fig. 2. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig2.jpg" alt="Figuur 2" /> Figuur 2. Methode Window, tabblad Algemeen. Maak de volgende selecties: <ul><li> In de &quot;meting&quot; veld selecteert u Fotometrie uit het pull-down menu. </li><li> In &quot;Operator&quot; veld, voert u de juiste operator naam. </li><li> Het is niet nodig om informatie in te voeren in het &quot;Instrument&quot; veld. Dit wordt automatisch geselecteerd door de software. </li><li> De &quot;Sampling&quot; veld is niet actief bij het gebruik van de microplaat lezer. </li><li> Voer eventueel opmerkingen die je misschien wilt opnemen in het rapport in de &quot;Opmerkingen&quot; veld. </li><li> In de &quot;Accessoire&quot; veld, voert u informatie over de accessoires die voor deze test. </li><li> Let op de knoppen aan de rechterkant van het venster. </li><li> De &quot;Load&quot; knop maakt het mogelijk het laden van eerder opgeslagen analysemethoden. </li><li> De &quot;opslaan&quot; knop laat het bijwerken van een reeks van te testen parameters of Analysis Method eerder opgeslagen en geladen, met dezelfde naam. </li><li> De &quot;Save As&quot; knop kunt u een nieuwe reeks van te testen parameters of Analysis Method onder een gewenste naam. </li></ul> Klik nu op de &quot;Kwantificering&quot; tab, zie figuur 3 en de volgende selecties. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig3.jpg" alt="Figuur 3" /> Figuur 3. Methode Window, Kwantificering tabblad. <ul><li> In de &quot;Kwantificering type&quot; veld selecteert u Golflengte. Dit geeft aan dat de fluorescentie lezing zal worden gemaakt met behulp van de geselecteerde golflengte. </li><li> In het &quot;Kalibratie type&quot; veld selecteert u een st bestellen. </li><li> In het &quot;Aantal golflengten&quot; de optie 1. </li><li> In de &quot;concentratie-eenheid&quot; veld ng / mL. </li><li> Laat ongeselecteerde de vakjes voor &quot;Manual Kalibratie&quot; en &quot;Force curve door nul&quot;. </li><li> In de &quot;Digit na komma&quot; de optie 2. </li><li> In de &quot;lagere concentratie limit&quot; veld, voert u 0. </li><li> In de &quot;Upper concentratiegrens veld 10000. </li></ul> Klik nu op de &quot;Instrument&quot; tab en voer de volgende selecties. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig4.jpg" alt="Figuur 4" /> Figuur 4. Methode venster, Instrument tabblad <ul><li> In de &quot;Data mode:&quot; veld selecteert u Fluorescentie. </li><li> De &quot;Hakken snelheid&quot; veld is niet actief op dit moment is het alleen wordt gebruikt voor fosforescentie metingen. </li><li> In de &quot;Wavelength mode&quot; veld, selecteert u zowel WL vast. </li><li> In de &quot;EX / WL1&quot; veld 480Nm. </li><li> In het &quot;EM / WL1&quot; veld 520nm. </li><li> Alle andere velden onder EX en de EM zijn niet actief op dit moment. </li><li> In de &quot;EX gleuf&quot; veld te selecteren 5.0nm uit het pull-down menu. </li><li> In de &quot;EM gleuf&quot; veld te selecteren 5.0nm uit het pull-down menu. </li><li> Laat ongeselecteerde de box voor de &quot;PMT Voltage 1-1000V&quot; veld. </li><li> In de &quot;PMT Voltage&quot; de optie 700V uit het pull-down menu. </li><li> In de &quot;Auto statistiek calc. Number&quot; veld te selecteren 2. </li><li> In het &#39;dupliceert &quot;veld te selecteren 1. </li><li> In de &quot;Integratie tijd&quot; veld te selecteren 0,1 s. &lt;/ Li&gt; <li> In de &quot;vertraging&quot; veld of selecteer 0s. </li></ul> Klik op het tabblad &quot;Beeldscherm&quot;. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig5.jpg" alt="Figuur 5" /> Figuur 5. Methode venster, tabblad Beeldscherm. <ul><li> In de &quot;Y-as&quot;, &quot;Max:&quot; veld selecteert u 10000 </li><li> In de &quot;Y-as&quot;, &quot;Min:&quot; veld selecteert u 0. </li><li> Selecteert u het vakje aan de linkerkant van het &quot;Open data verwerking na de data-acquisitie&quot;. </li><li> Laat niet-geselecteerde het vak aan de linkerkant van de &quot;Print rapport na data-acquisitie&quot;, tenzij u een rapport automatisch afgedrukt nadat de metingen zijn voltooid. </li></ul> Klik op de &quot;Report&quot; tab, zie Figuur 6. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig6.jpg" alt="Figuur 6" /> Figuur 6. Methode venster, Rapport Tab. <ul><li> In het veld &quot;Output&quot;, selecteert u Afdrukken Verslag van de pull-down menu. Je kon ook kiezen voor &quot;Use Microsoft Excel&quot; als je wilt dat de gegevens geëxporteerd naar Excel, of &quot;Gebruik Print Generator Sheet&quot; Als u de optionele add-on programma Report Generator waardoor het genereren van op maat gemaakte rapporten. </li><li> Klik op de vakjes voor de items die u wilt worden opgenomen in het rapport. </li><li> Voor het opslaan van alle geselecteerde parameters in de verschillende tabbladen van de &quot;Analyse Methode&quot; venster, klikt u nogmaals op het tabblad &quot;Algemeen&quot; en deze opslaan onder een bestandsnaam en een locatie waar je ze kunt vinden voor toekomstig gebruik, en klik op de &quot; OK &quot;knop om dit venster te sluiten. </li><li> Hiermee is het opzetten van het instrument te testen parameters. </li><li> Nu zullen we het opzetten van de microplaat lezer. </li><li> Klik op de <img src="/files/ftp_upload/2465/2465icon2.jpg" alt="Icoon 2" /> knop, die de MPR Setup venster zal brengen op de top. </li></ul> Selecteer putten voor de standaarden en monsters in de MPR Setup venster / tabblad Plate, zoals weergegeven in figuur 7. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig7.jpg" alt="Figuur 7" /> Figuur 7. MPR Setup venster, Plate tabblad. <ul><li> Klik op de A1 positie en sleep de muis naar E1, klik dan op de <img src="/files/ftp_upload/2465/2465icon3.jpg" alt="Icoon 3" /> knop te drukken. Hierdoor wordt de standpunten die worden gebruikt voor de normen. Deze posities worden gemarkeerd in groene kleur. </li><li> Nu moeten we posities F1 te selecteren H3 voor de monsters. Klik en sleep de muis vanaf positie F1, tot H3 positie en klik dan op de <img src="/files/ftp_upload/2465/2465icon4.jpg" alt="Icoon 4" /> drukt, wordt dit hoogtepunt die posities in de gele kleur. </li><li> Herhaal dezelfde handeling voor posities A2 naar E3, die posities voor sample metingen te selecteren. </li><li> Laten we nu laad het bestand Comma Separated Variable (csv-bestand) van tevoren voorbereid met de standaarden en Sample informatie. </li></ul> Klik op de &quot;Well informatie&quot; tabblad van de &quot;MPR Setup venster&quot;, zoals weergegeven in figuur 8. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig8.jpg" alt="Figuur 8" /> Figuur 8. MPR Setup-venster, Well tabblad Informatie. <ul><li> Klik dan op de <img src="/files/ftp_upload/2465/2465icon5.jpg" alt="Icoon 5" /> knop te drukken. Een Windows Verkenner-venster geopend, die zoals weergegeven in figuur 9, waardoor het lokaliseren van de &quot;Nou information.csv&quot; bestand en het laden. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig9.jpg" alt="Figuur 9" /> Figuur 9. Het laden van goed sample informatie. Na het laden van de &quot;Well informatie&quot; file, zal de &quot;Well informatie&quot; zoals weergegeven in Figuur 10 kijken <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig10.jpg" alt="Figuur 10" /> Figuur 10. Geladen monster goed informatie. </li></ul></li></ol></li></ol> 2. Picogreen Assay Monstervoorbereiding <ol><li> Bereid 1X TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA) door het toevoegen van 1 ml van 20 X TE-buffertot 19 ml dI H 2 O. </li><li> Bereid PicoGreen reagensoplossing door toevoeging van 50 pi 200 X PicoGreen Reagens tot 9,95 ml 1 x TE-buffer. </li><li> Bereid normen (Lambda dsDNA) door het maken van seriële verdunningen van voorraad dsDNA (100 ug / ml). Eerst een oplossing van 50 ug / ml dsDNA door toevoeging van 25 pi van de voorraad dsDNA (100 ug / ml) en 25 il 1 x TE-buffer. Maak vervolgens de standaardoplossingen door de toevoeging van de aangegeven volumes van dsDNA en buffer zoals vermeld in de onderstaande tabel: <table border="1"><tbody><tr><td> Concentratie van dsDNA </td><td> Volume van dsDNA </td><td> Volume van de buffer </td></tr><tr><td> 1 ug / ml </td><td> 20 pi van 50 ug / ml dsDNA </td><td> 980 pi 1 X TE-buffer </td></tr><tr><td> 0,1 ug / ml </td><td> 100 ul van 1 ug / ml dsDNA </td><td> 900 pi 1 X TE-buffer </td></tr><tr><td> 0,01 microgram / ml </td><td> 100 pi van 0,1 ug / ml dsDNA </td><td> 900 pi 1 X TE-buffer </td></tr><tr><td> 0.001 ug / ml </td><td> 100 pi van 0,01 ug / ml dsDNA </td><td> 900 pi 1 X TE-buffer </td></tr></tbody></table></li></ol> 3. Meting van Normen en Sample Fluorescentie <ol><li> Pipetteer 150 ul van elke standaard in putten A1-E1 van een 96 wells-plaat, per figuur 7, en volgens de volgende tabel: <table border="1"><tbody><tr><td> Goed </td><td> Standaard </td></tr><tr><td> A1 </td><td> 1 ug / ml </td></tr><tr><td> B1 </td><td> 0,1 ug / ml </td></tr><tr><td> C1 </td><td> 0,01 microgram / ml </td></tr><tr><td> D1 </td><td> 0.001 ug / ml </td></tr><tr><td> E1 </td><td> 1 X TE-buffer </td></tr></tbody></table></li><li> Pipetteer 150 ul onbekende monsters in putten F1 tot H3, afgebeeld in figuur 7 </li><li> Giet PicoGreen bereide oplossing in stap 1.2 in een goot is ontworpen voor multi-channel pipet te gebruiken. Gebruik een multi-channel pipet tot 150 pi PicoGreen oplossing voor de putten A1-H3 te leveren. Meng oplossing en normen voorzichtig met pipet. </li><li> Laat de plaat in een donkere omgeving en wacht 2-5 minuten voor de reactie te ontwikkelen. </li></ol> 4. Representatieve resultaten Een goede kalibreringskromme wordt geëvalueerd aan de hand van de verschillende parameters die door de F-7000-software op de meting van de normen en de berekening van de ijklijn door de software. De bepaling coëfficiënt geeft de goodness of fit van de gemeten normen en de berekende kalibratiecurve. Hoe dichter deze waarde op &quot;1&quot;, hoe beter de pasvorm van de gemeten waarde en de kalibratiecurve. Als de waarde is verre van &quot;1&quot;, moeten de normen opnieuw te worden gemeten, opnieuw bereid, of de geschiktheid van de kalibratiecurve veranderd. Figuur 11 toont een voorbeeld van een kalibratie-curve met een berekende vastberaden coëfficiënt = 0,99993, verkregen voor de kwantificering van dsDNA met behulp van PicoGreen kleurstof. <img src="/files/ftp_upload/2465/2465fig11.jpg" alt="Figuur 11" /> Figuur 11. Voorbeeld van dsDNA kalibratiecurve.

<ol><li>Singer, V. L., Jones, L. J., Yue, S. T., Haugland, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+PicoGreen+reagent+and+development+of+a+fluorescence-based+solution+assay+for+double-stranded+DNA+quantitation%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Characterization of PicoGreen reagent and development of a fluorescence-based solution assay for double-stranded DNA quantitation.</a> Analytical Biochemistry. 249 (2), 228-238 (1997).</li>
</ol>

Luis A. Moreno en Kendra L. Cox in dienst zijn van Hitachi High Technologies Amerika, die het instrument gebruikt in dit artikel oplevert.

Zorgvuldige pipetteren tijdens de monstervoorbereiding, alsmede het gebruik van een stabiele en gevoelige fluorescentie spectrofotometer is essentieel voor het verkrijgen van goede en reproduceerbare resultaten. In het geval van de fluorescentie spectrofotometer wordt gebruikt voor deze test wordt voorgesteld met behulp van 300 uL uiteindelijke steekproef volume in de microplaat lezer. Lager volume vermindert de gevoeligheid en een groter volume kan leiden tot kruisbesmetting tussen de putten.

<table><tbody><tr><td>Gedestilleerd H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Reagens</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT Picogreen dsDNA Assay Kit van Invitrogen</td><td>Reagens</td><td></td><td>P7589</td><td></td></tr><tr><td>Nalge Nunc fluorescentie microplaten p/n 237108</td><td>Benodigdheden</td><td></td><td>237108</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf micropipet met 12 kanalen</td><td>Benodigdheden</td><td></td><td>3516677</td><td></td></tr><tr><td>1000 &amp;mu;L Eppendorf pipet</td><td>Benodigdheden</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;mu;L Eppendorf pipet</td><td>Benodigdheden</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mL serologische pipet</td><td>Benodigdheden</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aluminiumfolie</td><td>Benodigdheden</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetpunten</td><td>Benodigdheden</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hitachi F-7000 fluorescentiespectrofotometer met FL Solutions 2.1</td><td>Apparatuur</td><td></td><td>5J1-0003</td><td></td></tr><tr><td>Microplaatlezer accessoire voor F-7000</td><td>Apparatuur</td><td></td><td>5J0-0139</td><td></td></tr></tbody></table>

kwantificering van dsdna het gebruik van de hitachi f-7000 fluorescentie spectrophotometer en picogreen dye

Quantification of dsDNA using the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer and PicoGreen Dye

Kwantificering van DNA, vooral in kleine concentraties, is een belangrijke taak met een breed scala van biologische toepassingen, waaronder standaard moleculaire biologie assays, zoals de synthese en zuivering van DNA, diagnostische toepassingen zoals kwantificering van DNA-amplificatie producten, en detectie van DNA-moleculen in drugs preparaten. Tijdens deze video demonstreren we de mogelijkheden van de Hitachi F-7000 fluorescentie Spectrofotometer uitgerust met een Micro Plate Reader accessoire voor dsDNA kwantificeren met behulp van Molecular Probes Quant-it PicoGreen kleurstof reagens kit uit te voeren. De F-7000 fluorescentie Spectrophotometer biedt een hoge gevoeligheid en hoge snelheid metingen. Het is een zeer flexibel systeem geschikt voor het meten fluorescentie, luminescentie, en fosforescentie. Het meten van verschillende modi beschikbaar, waaronder golflengte scan, tijd scan, fotometrie en 3-D scan meting. De spectrofotometer heeft gevoeligheid in het bereik van 50 picomol van fluoresceïne bij het gebruik van een 300 il monster volume in de microplaat, en is geschikt voor het meten scansnelheden van 60.000 nm / minuut. Het heeft ook een breed dynamisch bereik van maximaal vijf ordes van grootte die het mogelijk maakt voor het gebruik van de kalibratie krommen over een breed scala aan concentraties. Het optische systeem maakt gebruik van alle reflecterende optiek voor maximale energie en gevoeligheid. De standaard golflengte is 200 tot 750 nm, en kan worden uitgebreid tot 900 nm bij het gebruik van een van de optionele nabij-infrarode fotomultiplicatoren. Het systeem maakt het mogelijk optionele temperatuurregeling voor de plaat lezer 5 tot 60 graden Celsius met behulp van een optionele externe temperatuur gecontroleerde vloeistof circulator. De microplaat lezer maakt het gebruik van de 96 goed microplaten, en het meten van snelheid voor 96 wells is minder dan 60 seconden bij gebruik van de kinetiek mode. Software controles voor de F-7000 en Microplate Reader zijn ook zeer flexibel. Monsters kunnen ingesteld worden op het kolom of rij-formaten, en een combinatie van bronnen kan worden gekozen voor monster metingen. Dit zorgt voor een optimale benutting van de microplaat. Daarnaast is de software maakt het importeren van micro plaat monster configuraties gemaakt in Excel en opgeslagen in door komma&#39;s gescheiden waarden, of &quot;csv&quot; formaat. Microplaat het meten van configuraties kunnen worden opgeslagen en opgeroepen door de software voor het gemak en verbeterde productiviteit. Gegevens resultaten kunnen naar een standaard rapport, naar Excel, of op een optionele Report Generator Program.

Demonstratie van kwantificering van dsDNA met behulp van Molecular Probes PicoGreen kleurstof en Hitachi F-7000 fluorescentie Spectrofotometer uitgerust met een microplaat reader accessoire.

Kwantificering van dsDNA het gebruik van de Hitachi F-7000 fluorescentie Spectrophotometer en PicoGreen Dye

Kwantificering van DNA, in het bijzonder bij lage concentraties, is een belangrijke taak met een breed scala aan biologische toepassingen, waaronder standaard moleculaire ...

Het algemene doel van deze procedure is om de capaciteit van de F 7, 000 fluorescentie-spectrofotometer met microplaatlezer aan te tonen voor het kwantificeren van dubbelstrengs DNA met behulp van Pico green-kleurstof. Dit wordt bereikt door eerst de monsters en reagentia voor te bereiden. De tweede stap van de procedure is het instellen van het instrument.De derde stap van de procedure is het laden van de monsters in de microplatereader. De laatste stap van de procedure is het uitvoeren van de meting van de standaarden en monsters. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die een lineaire kalibratiecurve tonen, welke kan worden gebruikt voor de kwantificering van dubbelstrengs DNA van onbekende monsters.Zet de Hitachi F 7, 000 Spectra Fluorimeter aan zodat de Xenonlamp een uur kan opwarmen in Excel. Maak een bestand aan met de standaarden en monstergegevens en sla dit op in het formaat komma-gescheiden waarden of CSV. Klik om de fluorimeter in te stellen eerst op de methodeknop die het venster met de analysemethode opent.Selecteer in het meetveld fotometrie in het uitklapmenu. Klik nu op het tabblad kwantificering. Selecteer in het veld kwantificeringstype golflengte om aan te geven dat de fluorescentiemeting zal worden uitgevoerd met een gespecificeerde golflengte.Selecteer voor het kalibratietype 'first order' en selecteer voor het aantal golflengten 'one'. Voer nanogram per milliliter in als concentratie-eenheid. Zorg ervoor dat de selectievakjes voor 'manual calibration' en 'force curve through zero' niet zijn aangevinkt. Selecteer voor 'digit After decimal point' de waarde twee, voer nul in voor het veld 'lower concentration limit' en 10 000 voor het veld 'upper concentration limit'.Klik vervolgens op het tabblad instrument en selecteer fluorescentie in het veld datamodus. Controleer of het veld chopsnelheid inactief is, aangezien dit alleen wordt gebruikt voor fosforescentiemetingen. Selecteer in het veld golflengtemodus beide WL fixed in het veld ex WL en voer 480 nanometer in het veld EM WL in.Voer 520 nanometers in. Laat alle overige velden onder EX en EM inactief. Stel zowel de ex-spleet als de EM-spleet in op 5,0 nanometers.Laat via de vervolgkeuzemenu's het selectievak vóór het veld PMT-voltage één tot 1000 volt leeg. Selecteer voor het PMT-voltage 700 volt in het vervolgkeuzemenu. Selecteer daarnaast twee voor het aantal automatische statistische berekeningen, één voor de herhalingen, 0.1 seconds voor de integratietijd en nul voor de vertraging.Open nu het tabblad 'monitor' en stel het veld 'why axis max' in op 10 000 en 'why axis min' op nul. Selecteer vervolgens het vakje links van 'open data processing after data acquisition' en, indien gewenst, het vakje links van 'print report after data acquisition' voor een rapport dat automatisch moet worden afgedrukt na voltooiing van de metingen. Klik ten slotte op het tabblad 'general' en sla de geselecteerde parameters in de verschillende tabbladen van het venster voor de analysemethode op onder een nieuwe bestandsnaam op een opgegeven locatie.Klik op de OK-knop om dit venster te sluiten. Hiermee is het instellen van de testparameters van het instrument voltooid. Om de microplaatlezer in te stellen, klikt u op de MPR-knop om het setup-venster voor de MPR naar voren te halen.Selecteer eerst de wells voor de standaarden. Klik bijvoorbeeld op positie A1 en sleep de muis naar E1. Klik vervolgens op de knop voor de standaardset.Hiermee worden de posities geselecteerd die voor de standaarden worden gebruikt, zoals aangegeven door de groene kleur. Selecteer vervolgens de posities voor de monsters. Klik op dezelfde manier en sleep de muis over de overeenkomstige posities op de plaat en klik vervolgens op de knop voor de monsterset, waarna de geselecteerde posities automatisch geel worden gemarkeerd.Herhaal dezelfde handeling voor de posities van de gewenste monstermetingen. Om de standaarden en monsterinformatie in het eerder voorbereide csv-bestand te laden, klikt u op het tabblad 'well information' van het MPR-instellingsvenster.Selecteer de knop voor de informatie over de laadputten; er opent nu een Windows Verkenner-venster om het .csv-bestand met putinformatie te selecteren. Na het laden van de informatie moet het venster als een tabel worden weergegeven. Om een werkoplossing van Pico green-reagens te bereiden, voegt u 50 µL 200 X pico green-reagens toe aan 9,95 mL TE-buffer.Bereid voor de standaardcurve seriële verdunningen van Lambda dubbelstrengs DNA in TE-buffer voor eindconcentraties variërend van 1 tot 100 nanogram per milliliter; pipetteer 150 µL van elke standaard in de aangewezen wells van een 96-well plaat. Pipetteer vervolgens 150 µL van elk testmonster in de overeenkomstige aangewezen wells van de plaat. Voeg nu met een multichannelpipet 150 µL PicoGreen-oplossing toe aan elke well en meng de oplossing met de DNA-monsters.Incubeer de plaat voorzichtig gedurende twee tot vijf minuten in een donkere ruimte om de reactie te laten ontwikkelen. Klik op de knop van het MPR-display om het instelvenster van de MPR bovenaan het scherm weer te geven en klik op de knop voor de uitwisselingspositie. Het platform voor de microplaat zal naar de voorzijde van het instrument bewegen; open de deur van de microplaatlezer en plaats de 96-wells plaat op het platform met well A1 naar voren, en sluit vervolgens de deur van de microplaatlezer.Klik op de knop voor de beginpositie om positie A van de microplaat in de meetpositie te plaatsen. Klik op de knop voor het monitorischerm om het meetvenster bovenaan het scherm te tonen. Klik op de meetknop om te beginnen met het meten van de standaarden en de onbekende monsters.Een goede kalibratiecurve wordt geëvalueerd aan de hand van de verschillende parameters die door de F 7, 000 software worden verstrekt. Zo heeft deze ideale kalibratiecurve, verkregen voor de kwantificering van dubbelstrengs DNA met behulp van Pico green-kleurstof, een berekende determinatiecoëfficiënt van 0,99993. Het beschreven high-throughput systeem is een seriële samenstelling van technologieën, waaronder Pico Green-kleurstof, een Hitachi F 7, 000 fluorescentiespectrofotometer uitgerust met een microplatelezer en een softwareprogramma om de gegevensverzameling, opslag, analyses en presentatie te automatiseren.De combinatie van krachtige technologieën kan voorzien in de toenemende behoefte om kleine hoeveelheden dubbelstrengs DNA nauwkeurig te analyseren.

quantification-dsdna-using-hitachi-f-7000-fluorescence

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Het gebruik van NanoDrop microvolume systemen als praktische en efficiënte alternatieven voor de traditionele nucleïnezuur kwantificatie methode wordt beschreven door de demonstratie van twee microvolume nucleïnezuur kwantificatie protocollen.

NanoDrop microvolume Kwantificering van nucleïnezuren

We beschrijven een digitale eindpuntassay voor het kwantificeren van nucleïnezuren met een vereenvoudigde (analoge) uitlezing. We meten bulkfluorescentie van druppelgebaseerde digitale assays met behulp van een standaard qPCR-machine in plaats van gespecialiseerde instrumenten en bevestigen onze resultaten door middel van microscopie.

Eenvoudige Bulk uitlezing van Digital nucleïnezuur kwantificering Testen

Dit manuscript beschrijft een duplex digitale PCR test die kan worden gebruikt om tegelijkertijd kwantificeren Enterococcus spp. En HF183 genetische merkers als indicatoren van algemene en menselijke-geassocieerde fecale besmetting in recreatiewater.

Een duplex digitale PCR test voor gelijktijdige kwantificering van de<em&gt; Enterococcus spp.</em&gt; En de Human Fecal-geassocieerde HF183 Marker in Waters

Met deze methode kunt selectieve kleuring en kwantificering van DNA in gels door inweken de gel in een groene SYBR ik / Nitro blauwe Tetrazolium oplossing en vervolgens blootstelling aan zonlicht of een blauwe lichtbron. Dit produceert een zichtbaar neerslag en bijna geen apparatuur, waardoor het ideaal is voor gebruik van veld vereist.

DNA kleuring methode gebaseerd op Formazan neerslag veroorzaakt door blootstelling aan blauw licht

Hier presenteren we een protocol om te bestuderen van DNA-eiwit interactie door de totale interne reflectie fluorescentie microscopie (TIRFM) met behulp van een site-specifically gemodificeerde λ DNA substraat en een Quantum-dot label eiwit.

Visualiseren van de interactie tussen het eiwit Qdot-label en Site-specifically gemodificeerde λ DNA op het niveau van één molecuul

We introduceren hier een procedure om eiwit oligomeren en aggregatie in cellysaat en levende cellen te meten met behulp van fluorescentiecorrelatiespectroscopie.

Detectie van eiwitaggregatie met behulp van fluorescentiecorrelatiespectroscopie

Dit protocol beschrijft een unieke methode voor het detecteren van de binding tussen verbindingen en eiwitmoleculen, en biedt de voordelen van minimaal verlies van eiwitmonsters en een hoge nauwkeurigheid van de gegevens.

Detectie van CD40-eiwit-umbelliferon-interactie via differentiële scanfluorescentie

Deze studie presenteert een eenvoudige, gebruiksvriendelijke ratiometrische FRET-test voor de detectie en kwantitatieve beoordeling van DNase-activiteit, en demonstreert de toepassing ervan bij de analyse van een zwakke nuclease.

Beoordeling van DNase-activiteit door ratiometrische fluorescentieresonantie energieoverdracht

Dit protocol schetst het ontwerp van gesplitste hybridisatiesondes die gebruik maken van fluorescerende oplichtende aptameer DAP-10-42 als signaalreporter en hun toepassing voor nucleïnezuurdetectie en differentiatie tussen doelen met single-nucleotidesubstituties.

Gesplitste hybridisatiesonde die gebruik maakt van een DNA-fluorescerende oplichtende aptameer als signaalreporter voor sequentiespecifieke nucleïnezuuranalyse

Dit protocol biedt gedetailleerde bewerkingen voor monstervoorbereiding, gegevensverzameling en analyse van DNA intrinsieke fluorescentiespectra.

Spectroscopische superresolutiebeeldvorming van DNA-moleculen met intrinsiek contrast

Leer de kwantificering van dubbelstrengs DNA met PicoGreen kleurstof en de Hitachi F-7000 fluorescentiespectrofotometer. Deze methode genereert een lineaire kalibratiecurve voor nauwkeurige DNA-bepaling in biologisch onderzoek.

Kwantificering van dsDNA het gebruik van de Hitachi F-7000 fluorescentie Spectrophotometer en PicoGreen Dye

Meer video's verkennen