Name: Directe levering van MAV Morpholinos Into the zebravis Otocyst door injectie en elektroporatie van invloed op binnenoor Ontwikkeling (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-07T18:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Leer een methode voor gerichte levering van morpholinos naar het zebrafis binnenoor via micro-injectie en elektroporatie bij 24 uur na bevruchting. Deze techniek minimaliseert onbedoelde effecten op de hersenen en ondersteunt onderzoek naar genfunctie in de ontwikkeling van het auditieve systeem.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Deafness Research Foundation te Yc S en de NSF (IOS 0.930.096) naar KFB. KFB: NIH / NINDCD 2 RO1 DC04184, <a href="https://commons.era.nih.gov/commons/genericStatus.do?actionRole=nonPI&amp;applID=7854446&amp;uhf-token=Ugf7JvudZTCbTUW9jSAR1snMUgg%3D">3R01DC004184-08W1</a> , NSF DBI 0832862, NSF IOS 0930096

1. Elektroden voor het maken van Elektroporatie <ol><li> Snij 75 micrometer diameter wolfraam draad (AM Systems, Inc Carlsborg, WA) van geschikte lengte (ongeveer 3-5 cm) </li><li> Zet wolfraam draad door molex connector (pin gestempeld messing) </li><li> Wrap wolfraam draden en molex connector met krimpkous (CSP-technologie, Chicago, IL) en verwarmen met een bunsenbrander of warmte kanon van de krimpende slang afdichting op de draad </li><li> Te slijpen van de punt van wolfraam draad, duik de draad in 1,0 N natriumhydroxide (Conrad et al.. 1993) en, met behulp van een paperclip als de andere elektrode, elektrolyse de draad met een blokgolf Electroporator. De voorwaarden die wij gebruiken zijn vijf 50-volt pulsen van telkens 100 ms met 50 ms in tussen de pulsen. Elektroden moeten worden geslepen tot een diameter van 15-20 urn </li><li> Houd de draden in een lade in groeven geperst in boetseerklei voor gebruik in elektroporatie </li></ol> 2. Set Up Elektroporatie Station <ol><li> Tape 75μm wolframelektroden aangescherpt tot micromanipulators (World precisie-instrumenten). </li><li> Plaats micromanipulators aan beide zijden van de dissectiemicroscoop fase (Leica). </li><li> Verbind de elektroden met een Protect CUY-21 Bewerken Square Wave Electroporator (figuur 1). </li><li> Zet de electroporator en de parameters instellen voor elektroporatie, zoals spanning, pulsduur, en het aantal pulsen. De meest effectieve parameters voor dit experiment bleken te zijn drie 13-volt pulsen die elk geduurd 5.0ms, met 100ms tussen elke puls. Als elektroporatie creëert luchtbellen in het embryo, vermindering van de puls lengte. </li></ol> 3. Micro-injectie van Morpholinos Into zebravis Otic Blaasjes <ol><li> Oogst zebravis embryo's van een kweekbak. Incubeer de embryo's in embryo-raising medium met 0,3 PPM methyleenblauw (Westerfield, 2005) bij 28,5 ° C gedurende de nacht. </li><li> Trek glas naalden met een Sutter P-97 electrode puller </li><li> Warming-up een agarosegel basis (1% agarose in vis het water in een 10 mm petrischaal) tot 37 ° C in een waterbad </li><li> Verhit 1% laag smeltpunt agarose (LMPA) in vis water tot het gesmolten is en warm in de 37 ° C waterbad te houden. </li><li> Vul een glas met een naald morfolino oplossing (GeneTools, Corvallis, OR) en snijd de tip om juiste diameter. Plaats de injectienaald op een micromanipulator (Kuhn). </li><li> Gesneden naald tot ongeveer 10 urn en injecteer in minerale olie om ervoor te zorgen dat de punt voldoende afname van morfolino oplossing biedt. </li><li> Dechorinate embryo's op 24 uur postfertilization (HPF) en verdoven ze met MS222 (tricaïne, Sigma) in 0,3 PPM methyleenblauw vis water. </li><li> Lijn 3 tot 5 embryo's onder narcose op de agarosegel basis met de juiste kant naar boven voor handige uniforme analyse </li><li> Doe 1 tot 2 druppels van 1% LMPA over elke embryo en laat stollen voor het embryo vast te zetten </li><li> Draai de petrischaal, zodat de otic blaasje is aan de rechterkant </li><li> Plaats de naald in het lumen van de otic blaasje en injecteer de morfolino-oplossing met een PV820 Pneumatische PicoPump (World precisie-instrumenten) met een aangesloten stikstof tank (figuur 2) </li></ol> 4. Elektroporatie Procedure <ol><li> Verplaats de gemonteerde's naar de elektroporatie station onmiddellijk na de injectie </li><li> Plaats de positieve elektrode op het weefsel juist achter het Otic blaasje, maar dringen niet door, steek de negatieve elektrode in de hersenen net anterieur van de otic blaasje </li><li> Van toepassing zijn huidige gebruik van een voetpedaal of door op een schakelaar. </li><li> Giet het water vissen op agarose en verwijder de embryo's van agarose met wervelende en een glazen pipet. Wees voorzichtig dat u de embryo's beschadigen. Voor embryo's die zijn moeilijk te verwijderen, gebruik dan een naald om voorzichtig losmaken een LMPA rond de embryo. </li><li> Plaatsen embryo's in een plaat met methyleenblauw vis water en verhoog de ​​embryo's om de gewenste stappen voor de analyse (morfologische, immunohistochemische, in situ hybridisatie, etc en microscopische anlaysis). </li></ol> 5. Representatieve resultaten: <img src="/files/ftp_upload/2466/2466fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Elektroporatie station. Elektroden werden gemaakt met behulp van geslepen 75μm Tungsten draden en verbonden door leidt tot een Protect CUY-21 Bewerken plein Wave Electroporator. Deze elektroden werden geplakt micromanipulators. <img src="/files/ftp_upload/2466/2466fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Injectie station. Alle embryo's werden geïnjecteerd in het rechter oor is voor normalisatie. <img src="/files/ftp_upload/2466/2466fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Phalloidin kleuring van actine filamenten met 3 DPF embryo's. (A) De drie DPF embryo injected met controle MO heeft sterke kleuring van phalloidin in het achterste macula (pm). (B) Het embryo dat werd geïnjecteerd met controle MO en daarna geëlectroporeerd vergelijkbare niveaus van phalloidin vlekken had in uur in de injectie alleen embryo's. (C) Injectie met MIF MO's in de otic blaasje alleen niet leiden tot vermindering van de phalloidin vlekken, terwijl de injectie van mif MO's, samen met elektroporatie veroorzaakte een dramatische vermindering van de phalloidin kleuring in de pm (D). am, anterior macula. <img src="/files/ftp_upload/2466/2466fig4.jpg" alt="Figuur 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4. Phalloidin kleuring van actine filamenten met 5 DPF larven. Er was geen verschil tussen de injectie (A) en injectie met elektroporatie wanneer de standaard controle morfolino werd gebruikt (B). Echter, toonde de 5 DPF larven die werden geïnjecteerd met MIF morpholinos en geëlektroporeerd verminderde phalloidin kleuring in het achterste macula (pm) (D), maar minder dramatisch dan 3 DPF, in vergelijking met de embryo dat werd geïnjecteerd met MIF morpholinos alleen (C ). am, anterior macula. <img src="/files/ftp_upload/2466/2466fig5.jpg" alt="Figuur 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 5"> Figuur 5. Geacetyleerd tubuline kleuring van embryo's op 3 DPF. Het embryo in (A) kreeg geen injectie of elektroporatie. Het embryo in (B) was geëlektroporeerd maar kreeg geen injectie. Embryo's die zowel injectie en elektroporatie (C, D) met een MIF morpholinos zienderogen verminderd tubuline vlekken in vergelijking met de controlegroep. (Pm, posterior macula). <img src="/files/ftp_upload/2466/2466fig6.jpg" alt="Figuur 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 6"> Figuur 6. Geacetyleerd tubuline kleuring van embryo's op 3 DPF met controle morfolino. (A) Embryo zonder enige behandeling vertoonde een sterke geacetyleerd tubuline kleuring in het achterste macula (pm) en een uitgebreide innervatie. (B) Embryo geïnjecteerd met controle morfolino. (C) Embryo behandeld met elektroporatie alleen. (D) Controle embryo met controle morfolino geïnjecteerd en geëlektroporeerd heeft een vergelijkbaar niveau van geacetyleerd tubuline in de achterste macula en innervatie in vergelijking met de niet-behandelde controle.

<ol><li>Conrad, G. W., Bee, J. A., Roche, S. M., Teillet, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+microscalpels+by+electrolysis+of+tungsten+wire+in+a+meniscus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Fabrication of microscalpels by electrolysis of tungsten wire in a meniscus.</a> J Neurosci Methods. 50, 123-127 (1993).</li>
<li>Suzuki, M., Takamura, Y., Maeno, M., Tochinai, S., Iyaguchi, D., Tanaka, I., Nishihira, J., Ishibashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+laevis+macrophage+migration+inhibitory+factor+is+essential+for+axis+formation+and+neural+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Xenopus laevis macrophage migration inhibitory factor is essential for axis formation and neural development.</a> J Biol Chem. 279, 21406-21414 (2004).</li>
<li>Barald, K. F., Kelley, M. W., W, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+placode+to+polarization%3A+new+tunes+in+inner+ear+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">From placode to polarization: new tunes in inner ear development.</a> Development. 131, 4119-4135 (2004).</li>
</ol>

De productie van het artikel werd gesponsord door Gene Tools, LLC die produceren reagentia genoemd in de video en tekst.

We hebben met succes geïntroduceerd antisense oligonucleotide MO&#39;s in het oor van de 24 HPF zebravis embryo. Embryo&#39;s die zijn gerezen na de injectie en elektroporatie waren levensvatbaar zijn. Als de embryo&#39;s overleefde de elektroporatie, groeiden ze tegen normale tarieven in vergelijking met embryo&#39;s die waren kreeg geen behandeling, maar ook embryo&#39;s die alleen waren geïnjecteerd en embryo&#39;s die alleen was geweest geëlektroporeerd. We de effecten van MIF en MIF-achtige MO&#39;s waargenomen na oor injectie en elektroporatie door middel van etikettering met phalloidin en geacetyleerde tubuline. Phalloidin kleuring van actine filamenten in sensorische haarcellen van het achterste macula geeft aan dat elektroporatie van de MIF en MIF-achtige MO bij de 24-HPF stadium veroorzaakt veranderingen in haar cel en / of stereocilia cijfers in vergelijking met embryo&#39;s die alleen werden geïnjecteerd met de MO&#39;s (Figuur 3). Deze daling in het haar cel aantallen in overeenstemming is met de bevindingen van Shen et al.. (Ingediend) dat MO&#39;s te MIF en MIF-achtige leiden tot een vermindering van het aantal van de haarcellen in het zakvormig macula. De afname in haar cel aantallen in embryo&#39;s die werden geïnjecteerd met MOS en geëlektroporeerd aantonen dat elektroporatie kunnen helpen bij het verplaatsen van de MO&#39;s over het celmembraan, waardoor de omvang van de morfologische effecten in vergelijking met embryo&#39;s in de otic blaasje enige was geïnjecteerd. Veranderingen in de morfologie van de statoacoustic ganglion werden waargenomen door geacetyleerde tubuline vlekken. De omvang van innervatie door de statoacoustic ganglion werd beïnvloed, omdat embryo&#39;s die werden ingespoten en geëlectroporeerd tonen verminderde vertakking van de neurieten (figuur 5). Er kan ook worden verminderd condensatie van de ganglien-cellen en / of het verminderd aantal ganglioncellen, omdat de geacetyleerde tubuline kleuring is significant verlaagd in embryo&#39;s die zowel geïnjecteerd en geëlectroporeerd. Omdat mif is aangetoond kritisch te zijn voor de ontwikkeling van het zenuwstelsel (Suzuki et al.., 2004), kan de veranderingen gezien na elektroporatie het gevolg zijn van verhoogde transfectie van de MAV en MAV-achtige MO oplossing in het neuroblast cellen. Elektroporatie van antisense oligo morpholinos direct in het ontwikkelen van een weefsel is een nuttig instrument voor het regelen van de expressie van een gen tijdens de ontwikkeling dat weefsel, zowel ruimtelijk als in de tijd, in het embryo. Electroporatie van mif en MIF-achtige MO&#39;s in de weefsels van het binnenoor resulteerde in een abnormale morfologie van zowel de achterste macula en de statoacoustic ganglion. Er was een vermindering van het aantal van sensorische haarcellen in het achterste macula in embryo&#39;s die waren geïnjecteerd en geëlektroporeerd in vergelijking met embryo&#39;s die waren ontvangen geen behandeling of met embryo&#39;s die ofwel slechts geïnjecteerd of alleen geëlektroporeerd. Er was ook een daling in de mate van innervatie van de achterste sensorische patch door de statoacoustic ganglion en de grootte van de SAG. Elektroporatie is een waardevolle methode voor transfecteren macromoleculen in specifieke weefsels, met het voordeel van het observeren van de primaire effecten van dat DNA, RNA, of MO in de gewenste weefsel en onderscheid deze van secundaire effecten op andere weefsels, waaronder de hersenen, neurale lijst en periotic mesenchym op binnenoor ontwikkeling (Barald en Kelley, 2004).

<ol><li> MO: 0,3 mM van een combinatie van voor de MIF, MAV-achtige MO1, en ​​MAV-achtige MO2 werd gebruikt. Mif MO is complementair aan het startcodon van zebravis mif mRNA: 5&#39;-acatcggcatgactgcgacagagat-3 &#39;. Twee MO&#39;s werden gebruikt voor mif-like mif-like MO1 is complementair aan de translationele start site:. 5&#39;-GTTTCTATATTTATGAACGGCATGA-3 &#39;, terwijl de MIV-achtige MO2 afgeleid van AS volgorde op de intron1/exon 2 grens: 5&#39;-GATTCATCCTCTGAAGACGTAAGCC -3 &#39;. Controle MO was het gecodeerde nucleotidesequentie van Gene Tools: 5&#39;-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA-3 &#39;. </li><li> methyleenblauw (0,3 ppm) in het water vissen </li><li> MS222 (tricaïne, Sigma, 0,64 mM in vis water) </li><li> Lage smeltpunt agarose (LMPA; Roche) </li><li> fenolrood (Sigma) </li><li> Anti-geacetyleerd tubuline (Sigma) </li><li> Alexa Fluor ® 488 geit anti-muis tweede antilichaam (Molecular Probes) </li><li> Texas rood-phalloidin (Molecular Probes) </li></ol>

directe levering van mav morpholinos into the zebravis otocyst door injectie en elektroporatie van invloed op binnenoor ontwikkeling

Direct Delivery of MIF Morpholinos Into the Zebrafish Otocyst by Injection and Electroporation Affects Inner Ear Development

In de afgelopen jaren, is elektroporatie uitgegroeid tot een populaire techniek voor in vivo transfectie van DNA, RNA, en morpholinos in verschillende weefsels, waaronder de ogen, de hersenen en somieten van de zebravis. Het voordeel van elektroporatie ten opzichte van andere methoden van genetische manipulatie is dat de specifieke weefsels kan worden gericht, zowel ruimtelijk als in de tijd, voor de invoering van macromoleculen door de toepassing van elektrische stroom. Hier beschrijven we het gebruik van elektroporatie voor transfecteren MIF en mif-achtige morpholinos in het weefsel van de zich ontwikkelende binnenoor van de zebravis. In eerdere studies, mif morfolino geïnjecteerd in embryo&#39;s op de 1 - tot 8-cellig stadium geleid tot grootschalige morfologische veranderingen in het zenuwstelsel en het oog, evenals het oor. Door zich te richten de weefsels van het binnenoor in latere stadia van ontwikkeling, kunnen we bepalen de primaire effecten van de MIF in de ontwikkelingslanden binnenoor, in tegenstelling tot secundaire effecten die kunnen voortvloeien uit de invloed van andere weefsels. Door gebruik te maken phalloidin en geacetyleerd tubuline vlekken op de morfologie van neuronen, neurale processen en haarcellen worden geassocieerd met het achterste macula studie, waren we in staat om de werkzaamheid van elektroporatie te beoordelen als een methode voor gerichte transfectie in de zebravis binnenoor. De blaasjes Otic van 24hpf embryo&#39;s werden ingespoten met morpholinos en geëlektroporeerd en werden vervolgens vergeleken met embryo&#39;s die waren kregen geen behandeling of waren alleen geïnjecteerd of geëlektroporeerd. Embryo&#39;s die werden geïnjecteerd en geëlektroporeerd lieten een afname in haar cel aantallen, verminderd innervatie door de statoacoustic ganglion (SAG) en minder SAG neuronen in vergelijking met controlegroepen. Onze resultaten toonden aan dat de directe levering van morpholinos in otocysts in latere stadia van de niet-specifieke zenuwstelsel en de neurale lijst effecten van morpholinos geleverd op de 1-8 cellig stadium voorkomt. Het staat ook het onderzoek van effecten die zijn gericht op het binnenoor en niet secundaire effecten op het oor van de primaire effecten op de hersenen, neurale lijst of periotic mesenchym.

Een methode om rechtstreeks te leveren morpholinos in de zebravis otocyst op 24hpf is ontwikkeld. Met behulp van micro-injectie van morpholinos in het lumen van otic blaasje en elektroporatie tegen penetratie effect, waren we in staat om het effect van morpholinos op de hersenen te omzeilen en de effecten die specifiek zijn voor het binnenoor te verkrijgen.

Directe levering van MAV Morpholinos Into the zebravis Otocyst door injectie en elektroporatie van invloed op binnenoor Ontwikkeling

In recente jaren is elektroporatie een populaire techniek geworden voor in vivo transfectie van DNA, RNA en morpholino's in diverse weefsels, waaronder de ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om antisense-oligonucleotiden, morphino's of andere moleculen die de ontwikkeling verstoren, direct in de otische vesicles van zebravis te brengen op één dag of 24 uur na bevruchting. In dit voorbeeld gebruiken we morphino's tegen de vroegste neurotrofine die verantwoordelijk is voor de ontwikkeling van het statische akoestische ganglion, een cytokine van het immuunsysteem genaamd macrophage migration inhibitory factor, of MIF, om vast te stellen of morphino's tegen dit molecuul de ontwikkeling van het binnenoor of de neurogenese beïnvloeden. Dit wordt bereikt door eerst morphino's in het lumen van de otische vesicle te brengen via micro-injectie, waarna elektroporatie wordt uitgevoerd om de penetratie van de morphino's vanuit het lumen in de cellen van de otische vesicles te faciliteren.Vervolgens worden de embryo's gekweekt bij 28.5 °C om de effecten van de morphos op de ontwikkeling van het binnenoor en de neurogenese te observeren. Gedurende de volgende dagen worden resultaten verkregen die wijzen op een afname van de sensorische haarcellen in het binnenoor, evenals een afname van de innervatie door het stato-akoestische ganglion op basis van immunohistochemie en kleuring, waarbij respectievelijk geacetyleerd tubuline in de kinocilia en actine in de stereocilia op het oppervlak van de haarcellen worden gelabeld. Wij hebben deze methode voor injectie en elektroporatie van morphos in het kippenembryo oorspronkelijk ontwikkeld samen met een zeer getalenteerde undergraduate student in het laboratorium.Katie Holmes heeft dit succesvol geschaald naar de afmetingen van zebravissen. Het huidige onderzoeksteam, bestaande uit Yuchi, een postdoc, Matt Wyatt, een promovendus, en Deb Thompson, een voormalige postdoc in het lab, heeft deze techniek verfijnd voor zebravissen. Deze methode kan hopelijk cruciale vragen beantwoorden in de velden van de ontwikkelingsbiologie en het gehooronderzoek, waaronder of specifieke morfeneffecten op een organsysteem zoals het oor kunnen worden onderscheiden van gegeneraliseerde ontwikkelingseffecten die veel organsystemen beïnvloeden en secundair zijn voor het oor, zoals effecten op de hersenen die indirect het oor beïnvloeden.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals micro-injecties in het één- tot viercelstadium, is dat deze methode morfo-genen in latere stadia direct in het oor introduceert. Hierdoor kunnen de directe effecten van morfo-genen op de blastula en het secundaire effect op het binnenoor worden vermeden. Om elektroden te maken, begint u met het afknippen van tungstendraad met een diameter van 75 µm en een lengte van ongeveer drie tot vijf cm. Plaats de tungstendraad door een Molex-kabelconnector.Wikkel vervolgens de wolfraamdraden en de Molex-kabelconnector in krimpkous en verhit deze met een bunsenbrander of een heteluchtpistool om de krimpkous aan de draad te fixeren. Om vervolgens de punt van de wolfraamdraad aan te scherpen, wordt de draad ondergedompeld in natriumhydroxide en, met een paperclip als tweede elektrode, wordt de draad geëlektrolyseerd met een vierkante golf generator. De gebruikte condities zijn vijf pulsen van 50 volt, elk met een duur van 100 milliseconden en een tussenpoos van 50 milliseconden tussen de pulsen.Voer drie herhalingen uit met de punt van de elektrode ondergedompeld in het normale natriumhydroxide. Steek de elektrode iets verder in het natriumhydroxide en voer nog een herhaling uit. Steek de elektrode verder in, waarbij de elektrode beide keren ongeveer dezelfde afstand wordt bewogen, en voer een laatste herhaling uit.Deze graduele verscherping resulteert in een zeer fijne punt op de elektrode, waardoor de elektroden nauwkeuriger en met minder schade in het ontwikkelende zebravisembryo kunnen worden ingebracht. Bewaar de draden vóór gebruik voor elektroporatie voor het micro-injecteren van morphino's in de otische vesicles van zebravis ingedrukt in boetseerklei in een tray. Zet eerst in de avond kweekbakken klaar met een plastic scheidingswand om de mannetjes van de vrouwtjes te scheiden.Plaats vier mannetjes en vier vrouwtjes in het aquarium en laat het aquarium gedurende de nacht in een incubatieruimte staan met een licht-donkercyclus van 14 tot 10 uur. De volgende ochtend, nadat de lichten zijn ingeschakeld, wordt de scheidingswand verwijderd en worden de vissen gedurende ongeveer 20 tot 30 minuten ongestoord gelaten. Scheid de mannetjes van de vrouwtjes en verwijder de broedvissen uit het kweekaquarium.Plaats ze in tanks met vers viswater. Oogst de embryo's uit de kweektank door het water dat de eitjes bevat door een zeef te gieten. Spoel de eitjes in de zeef meerdere keren met vers eitjeswater voordat ze in een Petrischaal worden gegoten.Verwijder alle onbevruchte of ondoorzichtige eieren en incubeer de embryo's gedurende de nacht in embryo-kweekmedium met 0,3 PP m methyleenblauw bij 28,5 °C. Trek glazen naalden met een Sutter P 97 elektrode-trekker vlak voor de injectie. Warm een AROS-gelbasis bestaande uit 1% agros in viswater in een Petri-schaal van 10 mm op tot 37 °C in een waterbad; warm 1% laag-smeltende AGROS of LMPA in viswater op tot deze gesmolten is en houd dit warm in het waterbad van 37 °C.Vul een glazen naald met een morpholino-oplossing en snijd de punt tot de gewenste diameter, ongeveer 10 tot 15 micron. Monteer de injectienaald op een micromanipulator die is verbonden met een PV820 pneumatische picopomp met stikstoftank. De-choreer de embryo's 24 uur na bevruchting en anesthetiseer ze met tricaine in viswater met 0,3 PPM methyleenblauw.Lijn vervolgens drie tot vijf genarceerde embryo's met de rechterzijde naar boven uit op de AROS-gelbasis voor een handige en uniforme analyse, breng één tot twee druppels 1% LMPA aan over elk embryo en laat dit stollen om het embryo te fixeren. Draai de Petrischaal zodat de otische blaas zich aan de rechterzijde bevindt. Plaats vervolgens de naald in het lumen van de otische blaas en injecteer de morpho-oplossing met behulp van het voetpedaal.Verplaats de gemonteerde embryo's direct na de micro-injectie naar het electroporatiestation om het electroporatiestation in te stellen. Plak eerst de verscherpte tungsten-elektroden van 75 micrometer aan de micromanipulatoren. Plaats vervolgens de micromanipulatoren aan weerszijden van de tafel van de dissectiemicroscoop.Zet de elektroporator aan en stel de parameters voor elektroporatie in. De meest effectieve parameters voor dit experiment bleken drie pulsen van 13 volt gedurende twee milliseconden te zijn, met telkens 100 milliseconden tussen elke puls.Plaats de elektroden zodanig dat de otische vesikel gelijkmatig wordt geflankeerd, met één elektrode oppervlakkig ten opzichte van de otische vesikel en de andere diep ten opzichte van de otische vesikel. Breng vervolgens een stroom toe met behulp van een voetpedaal of door op een schakelaar te drukken wanneer de elektroporatie is voltooid. Giet viswater over de aros en verwijder de embryo's met een glazen pipet door de plaat voorzichtig te zwenken.Wees voorzichtig om de embryo's niet te beschadigen bij embryo's die moeilijk te verwijderen zijn. Gebruik een naald om voorzichtig alle LMPA die hen omringt weg te breken. Breng de embryo's over naar een plaat met viswater met methyleenblauw en kweek de embryo's tot de gewenste stadia voor morfologische immunohistochemie.In figuur C worden representatieve resultaten van oorinjectie en elektroporatie van morphino's getoond via hybridisatie en microscopische analyse. De posterieure of auditieve macula, aangeduid als PM, is een van de gehoororganen bij de vis wanneer deze is gelabeld met Phin red. Op deze foto verschijnen de actinebundels in de stereocilia op de sensorische haarcellen als rode stippen op het oppervlak.De peddelvormige macula, zoals zichtbaar door fluorescentielabeling met Phalloidine in een embryo drie dagen na bevruchting dat alleen met MIF-morphino's is geïnjecteerd, vertoont meer actinfilamenten binnen de stereociliën van de haarcellen in vergelijking met embryo's van dezelfde leeftijd die zowel zijn geëlektroporeerd als geïnjecteerd. Echter, injectie en elektroporatie met de standaard controle-morphino veroorzaakte geen verminderde F-actinekleuring in vergelijking met injectie van alleen de morphino. De resultaten zijn vergelijkbaar in de posterieure macula, hoewel minder dramatisch na vijf dagen in larven die zijn geïnjecteerd en geëlektroporeerd, vergeleken met het embryo dat alleen met MIF-morphino's is geïnjecteerd.Er was geen verschil tussen alleen injectie en injectie met elektroporatie wanneer de standaard controle-morph werd gebruikt. Dit embryo, dat is gekleurd met een antilichaam tegen geacetyleerd tubuline, heeft geen injectie of elektroporatie van MIF-Morpholinos ontvangen. Dit embryo is geëlektroporeerd, maar heeft geen injectie ontvangen.Beide embryo's vertonen een normale kleuring voor geacetyleerd tubuline. Deze embryo's zijn beide geïnjecteerd en geëlektroporeerd. Ze hadden een zichtbaar verminderde tubulinekleuring in vergelijking met de controles en veel minder neuronale uitlopers geassocieerd met het oor en de omliggende ganglia.Wanneer de controle-morpho werd gebruikt voor injectie en electroporatie, zagen we geen vermindering in de mate van acetyl-tubulinekleuring, noch een afname in de innervatie door het akoestische ganglion in vergelijking met de injectie van alleen de morpho. Zodra men deze techniek beheerst, kan deze in ongeveer twee uur worden uitgevoerd mits deze correct wordt uitgevoerd. Het moeilijkste deel van de techniek om onder de knie te krijgen is de electroporatie; er moet bijzondere zorg worden betracht om het brein niet te beschadigen, waarbij aangescherpte elektroden kunnen helpen dit probleem te verlichten.

direct-delivery-mif-morpholinos-into-zebrafish-otocyst-injection

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Micro-injectie is een gevestigde en effectieve methode voor het introduceren van vreemde stoffen in bevruchte zebravis embryo's. Hier tonen we een robuuste micro-injectie techniek voor het uitvoeren van mRNA overexpressie en morfolino oligonucleotide-gen knock-down studies in de zebravis.

Micro-injectie van mRNA en morfolino antisense oligonucleotiden in zebravis embryo&#39;s.

Deze video laat zien hoe morfolino of mRNA kan worden geïnjecteerd in zebravis embryo's in het een-cellig stadium te verlagen of te verhogen van het niveau van specifieke gen-producten tijdens de verdere ontwikkeling.

Micro-injectie van de zebravis embryo&#39;s Gene functie analyseren

Een methode om een ​​doelwit eiwit expressie voorwaardelijk knockdown in de volwassen zebravissen netvlies wordt beschreven, wat inhoudt intravitreally injecteren van antisense morpholinos en electroporating ze in het netvlies. De daaruit resulterende eiwitten neergeslagen voor meerdere dagen, waardoor het testen van de eiwit rol in de regenereren of intact netvlies.

In vivo Elektroporatie van Morpholinos in de Adult zebravis Retina

We beschrijven een methode om de expressie van een doeleiwit voorwaardelijk knockdown op volwassen zebravissen fin regeneratie. Deze techniek micro-injectie en electroporating antisense oligonucleotide morpholinos in fin weefsel, zodat het testen van het eiwit rol in verschillende stadia van fin regeneratie onder wondgenezing blastema vorming en regeneratieve uitgroei.

In vivo Elektroporatie van Morpholinos in het regenereren van Adult Zebravissen Tail Fin

De muis binnenoor is een placode-afgeleide zintuig waarvan het ontwikkelings-programma wordt uitgewerkt tijdens de dracht. We definiëren...

Gene Transfer naar de ontwikkelingslanden Mouse binnenoor door<em&gt; In Vivo</em&gt; Elektroporatie

Het protocol beschrijft gerichte knockdown van genexpressie bij zebravissen door morfolino-injectie in de staart.

Morpholino-injectie: een methode om doelgenexpressie neer te halen om functie bij zebravissen te bestuderen

In dit artikel tonen we een werkwijze voor het manipuleren van genexpressie in het ventriculaire cellen van het volwassen zebravissen telencephalon met morfolino antisense oligonucleotiden. Wij stellen deze werkwijze efficiënt en snel protocol dat kan worden gebruikt voor functionele studies in de volwassen gewervelde hersenen.

Micromanipulatie van genexpressie in de Adult zebravis hersenen met behulp Cerebroventricular Micro-injectie van Morfolino Oligonucleotides

Een flexibel omgekeerde genetische methode voor zebravis over gen-functie te beoordelen tijdens de latere stadia van ontwikkeling en fysiologische homeostase zoals weefselregeneratie behulp intraventriculaire injecties van gen-specifieke morpholinos.

Reverse Genetische Morfolino benadering met behulp van de cardiale ventriculaire Injection naar meerdere Moeilijk-to-target weefsels in de zebravis Larve Transfecteren

Met  behulp van ovo-elektroporatie hebben we een methode ontwikkeld om selectief het auditieve binnenoor en de cochleaire kern in kippenembryo's te transfecteren om een celgroepspecifieke knockdown van fragiele X mentale retardatie-eiwit te bereiken tijdens discrete perioden van circuitassemblage.

Ontleedende cel-autonome functie van fragiele X mentale retardatie-eiwit in een auditief circuit door In Ovo-elektroporatie

In Utero Intraventriculaire injectie en elektroporatie van de E16 Rat embryo&#39;s

Leer een methode voor gerichte levering van morpholinos naar het zebrafis binnenoor via micro-injectie en elektroporatie bij 24 uur na bevruchting. Deze techniek minimaliseert onbedoelde effecten op de hersenen en ondersteunt onderzoek naar genfunctie in de ontwikkeling van het auditieve systeem.

Directe levering van MAV Morpholinos Into the zebravis Otocyst door injectie en elektroporatie van invloed op binnenoor Ontwikkeling (Video) | JoVE Journal

Directe levering van MAV Morpholinos Into the zebravis Otocyst door injectie en elektroporatie van invloed op binnenoor Ontwikkeling

Meer video's verkennen