Computer-assisted Grootschalige visualisatie en kwantificering van eilandjes van Langerhans massa, afmetingen Distributie en Architectuur

Het algemene doel van deze procedure is om onbevooroordeelde representatieve gegevens te verzamelen binnen een beperkt monster en om de complexe driedimensionale structuur van het weefsel nauwkeurig te analyseren. Dit wordt bereikt door eerst virtuele plakjes van immunohistochemisch, chemisch gekleurde pancreassecties vast te leggen. Vervolgens worden de virtuele plakjes gekwantificeerd met de IHC virtual slice macro in Image J-software en worden de gegevens geanalyseerd met scripts die zijn geschreven voor Mathematica.

Vervolgens wordt een 3D-reconstructie van de virtuele plakjes uitgevoerd met behulp van Image J. De laatste stap van de procedure is om een stapel individuele eilandjesbeelden vast te leggen met behulp van de slide book-software en om de beeldstacks handmatig in drie dimensies in kaart te brengen met behulp van stereo-onderzoeker. Uiteindelijk kan een nauwkeurige oogjesarchitectuur met 3D-coördinaten voor elke oogjescel worden verkregen door een gecombineerde methode van 3D-beeldvorming en handmatige inkaartbrenging. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van obesitas- en diabetesstudies, zoals hoe fysiologische en pathofysiologische omstandigheden de pancreas, beta-celmassa, eilandjesverdeling en architectuur beïnvloeden.

De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de diagnose of therapie van obesitas en diabetes Mellitus omdat een beter begrip van de veranderingen in beta-celmassa de ontwikkeling en evaluatie van therapeutische interventies zal vergemakkelijken. Hoewel de methoden die in de huidige studie worden beschreven specifiek inzicht geven in de dynamische immunohistologische analyse van de pancreas, kunnen ze ook worden toegepast op een reeks andere organismen en weefsels. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal omdat de computerondersteunde analysestappen moeilijk te leren zijn.

Vanwege de complexiteit van het analyseren van dergelijke grote gegevenssets in twee en drie dimensies. Begin deze procedure door een schone dia te plaatsen die een volledige sectie van een immunohistochemisch, chemisch gekleurde pancreas bevat in de houder van een fluorescentiemicroscoop. Open de stereo-onderzoekersoftware en visualiseer het monster door op acquisitie te klikken.

En dan live-beeld. Bepaal de belichtingsniveaus voor elk kanaal met behulp van het videohistogramvenster, dat de intensiteit van de fluorescentie weergeeft. In dit voorbeeld wordt kanaal twee gebruikt voor DAP P-kanaal drie voor GFP-kanaal vier voor RFP, kanaal vijf voor sci vijf en kanaal zes voor SCI zeven.

Gebruik het camera-instellingenvenster om het belichtingsniveau aan te passen zodat de fluorescentie-intensiteit afneemt. Aan de rechterkant van het videohistogram kan het beeld worden scherpgesteld met de focuswiel van de microscoop. Voordat u een virtuele plak maakt, omcirkel het monster door op het scherm te klikken op een punt verwijderd van het monster, wat een referentiepunt zal markeren.

Klik vervolgens rond de omtrek van het monster wanneer de contour voltooid is. Klik met de rechtermuisknop en selecteer sluit contour om de begin- en eindpunten te verbinden zodra de contour is gesloten, maakt u een virtuele plak voor het monster door acquisitie te selecteren en vervolgens virtuele plak te verwerven. Wanneer de opties van het virtuele plakvenster openen, selecteert u hoge snelheid verwerven, evenals het uitschakelen van handmatig.

Focussen door het vakje naast handmatig uit te schakelen. Sla het bestand op. Kalibreren van de prefo door met de rechtermuisknop te klikken en toevoegen aan focussitelijst te selecteren.

Focusseren op verschillende willekeurige secties in de virtuele plakvoorbeeld Wanneer er verschillende sites zijn gefocusseerd, start u de virtuele plak door met de rechtermuisknop te klikken en te selecteren. Start virtuele plak met prefo nadat de virtuele plak voor het eerste monster is voltooid, schakelt u over naar het volgende kanaal en past u de belichting dienovereenkomstig aan. Deze procedure wordt herhaald voor elk kanaal om de eilandjes te kwantificeren, verwerk de afbeeldingen met behulp van een Image J-macro genaamd I-H-C-V-S, die eerst geladen afbeeldingen voorbereidt voor analyse en vervolgens functies van eilandjes zoals cellulaire samenstelling kwantificeert.

De I-H-C-V-S-macro's splitst de stack in zijn respectievelijke kleurkanalen. In Image J converteert elke afbeelding naar een achtbits zwart-witmasker. Na automatische intensiteitsdrempelstelling en voegt de afzonderlijke kanaalafbeeldingen rekenkundig samen tot een samengestelde masker.

De ingebouwde deeltjeanalyse van Image J op de samengestelde afbeelding zal vervolgens gebieden van belang of ROI's identificeren terwijl deeltjes kleiner dan één beta-cel worden uitgesloten. De kwantificering van ROI's. Met behulp van Image J produceert u een spreadsheet met celparameters.

Sla de geaggregeerde resultaten op in een Excel-spreadsheet. Opslag van gegevens zoals gebiedsomtrek, circulariteit, fer-diameter en eilandjecentrum voor elk eilandje, samen met overeenkomstige nummers die in de afbeelding zijn gelabeld. Computationele analyse van deze parameters kan worden uitgevoerd zoals beschreven in het schriftelijke protocol Om informatie te onthullen, inclusief eilandjeverdeling en frequentieanalyse, voer 3D-reconstructie uit van virtuele plakjes door een script uit te voeren dat alle JP-twee afbeeldingen in de directory omzet in TIF-bestanden, wat het formaat is dat wordt gebruikt bij de constructie en kwantificering van driedimensionale stacks van de virtuele plakjes.

Hier wordt een script genaamd I MJ twee twee tiff gebruikt. Kopieer het script naar de directory die de JP twee afbeeldingen bevat. Voer het script uit met de Linux-shell door punt slash I am JP twee twee TIFF in de console te typen en vervolgens op enter te drukken.

Wanneer alle vastgelegde afbeeldingen zijn geconverteerd van JP twee naar TIFF-bestanden, zijn ze klaar om te worden gebruikt voor analyse in Image J.Open alle afbeeldingen voor het eerste monster met behulp van Image J, die in dit geval afkomstig zijn van een menselijk foetaal pancreas en voeg ze samen door op afbeelding, kleur en vervolgens kanalen samenvoegen te selecteren. Herhaal dit proces voor elk van de monsters wanneer alle monsters als enkele afbeeldingen zijn gecombineerd. Maak de afbeeldingen schoon door ongewenste gebieden te selecteren met het polygoonselectiegereedschap.

Vul ze in door