Name: Computer-assisted Grootschalige visualisatie en kwantificering van eilandjes van Langerhans massa, afmetingen Distributie en Architectuur (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 59 s
Description: Verken een geautomatiseerde methode voor grootschalige 3D-analyse van eilandjes van Langerhans met behulp van immunohistochemie en beeldanalyse. Deze aanpak kwantificeert isletgrootte, celcompositie en ruimtelijke organisatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De studie wordt ondersteund door US Public Health Service Grant DK-081527, DK-072473 en DK-20595 aan de Universiteit van Chicago Diabetes Research and Training Center (Animal Models Core), en een geschenk van de Kovler Family Foundation.

1. Het creëren van virtuele Slices van immunohistochemisch Stained Images <ol><li> Open StereoInvestigator. Leg de schoon objectglas houden het monster in de microscoop houder en visualiseren in Stereo Investigator door te klikken op "Acquisition" en daarna "Live Image" (Acquisition → Live Image). Bepaal de niveaus van blootstelling voor elk kanaal, in onze specifieke voorbeeld, Kanaal 2 wordt gebruikt voor DAPI, Kanaal 3 voor GFP, Channel 4 voor RFP, Channel 5 voor Cy5, en Channel 6 voor Cy7. Gebruik de "Video Histogram" venster, dat de intensiteit van de fluorescentie weergegeven, het bepalen van de blootstelling niveau. Geschikte fluorescentie-intensiteiten zijn bereikt indien de intensiteit staarten af ​​aan de rechterkant van de Video Histogram. Blootstelling kan worden gewijzigd in de "Camera-instellingen 'venster. De Video Histogram kan worden gericht met de microscoop nadruk wiel. </li><li> Voordat u een Virtual Slice, contour van het monster door te klikken op het scherm op een punt afstand van de steekproef, die een referentiepunt zal in het teken, en vervolgens te klikken op rond de omtrek van het monster. Als de contour is voltooid, klik met de rechtermuisknop en selecteer "Close Contour" om de begin-en eindpunt aan te sluiten. </li><li> Nadat de contour is gesloten, het veroveren van een Virtual Slice voor het monster (→ Overname Acquire Virtual Slice). Wanneer het Virtual Slice venster opties open, selecteer "High Speed ​​Acquire" evenals automatische scherpstelling door het vinkje in het vakje naast "Manual". Sla het bestand op. </li><li> De virtuele slice prefocus moet worden gekalibreerd door het selecteren (klik met de rechtermuisknop → Toevoegen aan Site Lijst Focus) en handmatig scherpstellen een aantal willekeurige secties, dat wil zeggen, sites, in de Virtuele Slice voorbeeld. Wanneer er meerdere sites zijn gericht, start de Virtual Slice (klik met de rechtermuisknop → Start Virtual Slice met Prefocus). Na de Virtual Slice voor het eerste monster is voltooid, schakelt u naar het volgende kanaal en pas de belichting. Herhaal stap 4 en 5 voor elk kanaal. </li></ol> 2. Computer-assisted tweedimensionale analyse Kwantificering van de Eilandjes <ol><li> De beelden worden vervolgens verwerkt met behulp van een ImageJ macro met de naam "IHCVS," dat voor het eerst voorbereidt geladen afbeeldingen voor analyse en kwantificeert kenmerken van eilandjes, zoals cellulaire samenstelling (dat wil zeggen elk gebied van bèta-, alfa-en delta-celpopulaties, en eilandje gebied aan de som-waarde). De stapel is opgesplitst in de afzonderlijke kanalen in ImageJ, waar elk kanaal een aparte afbeelding op basis van de immunohistochemische kleuring laat zien. Elk beeld wordt vervolgens automatisch thresholded, waarna een 8-bit zwart-wit beeld, of een masker, van de thresholded beeld wordt geproduceerd. De apart kanaal beelden worden vervolgens opgeteld rekenkundig in een samengestelde masker, en ImageJ de ingebouwde deeltjes analyse is uitgevoerd op de samengestelde afbeelding. </li><li> ROI worden vervolgens geïdentificeerd met uitsluiting van deeltjes die kleiner zijn dan een enkele beta-cel (&lt;170 micrometer 2; oppervlakte die wordt berekend met behulp van een diameter van ~ 15 micrometer; Hara et al., 2003.). De resulterende ROI worden geanalyseerd en gekwantificeerd met behulp ImageJ; kwantificering kan bevatten perimeter (een afstand rond een gebied), rondheid (een zekere mate van rondheid, waar het nummer 1.0 toont een perfecte cirkel), Feret de diameter (de langste afstand binnen een gebied) en het centrum coördinaten voor elk geanalyseerd regio, zodat het eilandje distributie kan wiskundig worden geanalyseerd met behulp van verschillende combinaties van deze parameters en uitgezet in een 3D-grafiek, de gegevens van die zal worden gebruikt voor wiskundige modellering. Een virtueel stukje beeld geanalyseerd in 30 seconden. Meerdere beelden kunnen worden geanalyseerd door het inbedden van het beeld verwerking en analyse script in een lus syntax wordt ondersteund door ImageJ macro-taal. De lus opent alle bestanden in een bepaalde map, analyseert de beelden, en uitgangen resultaten in een nieuwe locatie als een Excel-bestand. </li><li> De geaggregeerde resultaten worden opgeslagen in een Excel spreadsheet, het opslaan van gegevens, zoals oppervlakte, omtrek, circulariteit, Feret de diameter, en eilandje midden voor elk eilandje, samen met bijbehorende nummers geëtiketteerd in de afbeelding. </li></ol> Computational Analyse en Histogram Setup <ol><li> Mathematica scripts, die zich automatisch zodra het gestart is, worden gebruikt om de verzamelde gegevens te verwerken spreadsheet, een bedrag van honderdduizenden inzendingen. Een van de kritische processen die worden uitgevoerd is een frequentie-analyse, die een histogram gebruikt om de grootte verdeling te onderzoeken en ook om uitschieters in de data vast te stellen constructen. Onder het script, is totaal eilandje oppervlakte gemeten en vergeleken met andere parameters, met name om de tijd punten of de leeftijd van de alvleesklier, en vervolgens dus weergegeven in een grafiek. </li></ol> 3. Drie-dimensionale reconstructie van de tweedimensionale immunohistochemisch Stained Virtual Slice Images 3D reconstructie van Virtual Slices <ol><li> Kopieer het script ("im_jp2_2_tiff") in de directory (dat wil zeggen, map) dat debevat de JP2 afbeeldingen. Voer het script met de Linux-shell door te typen "./im_jp2_2_tiff" in de console en vervolgens op enter te drukken. Het uitvoeren van dit script zal automatisch converteert alle JP2-afbeeldingen in de map in de tiff-bestanden, dat is het formaat dat wordt gebruikt in de bouw en de kwantificering van de drie-dimensionale stapels van de Virtual Slices. (Opmerking:. Type in "chmod + x im_jp2_2_tiff" als het script niet uitgevoerd, waardoor de tekst bestand om te zetten in een script, zodat het goed kan draaien) </li><li> Wanneer alle van de vastgelegde beelden zijn omgezet van JP2 naar TIFF-bestanden, zijn ze klaar om te worden gebruikt voor analyse in ImageJ. </li><li> Met ImageJ, open alle van de beelden voor het eerste monster (vijf beelden in dit geval: DAPI, GFP, RFP, Cy5, Cy7) en voeg ze als een afbeelding (Image Color → → Merge Channels). Herhaal dit proces voor elk van de monsters. Als alle monsters zijn gecombineerd als afzonderlijke beelden, het reinigen van de beelden door te selecteren ongewenste regio's met het "Polygoon Selections" tool en vullen ze in (Bewerken → Fill). (Wijzig het formaat van foto's naar een kleiner formaat, indien nodig). Maak vervolgens van elk beeld in een RGB-kleuren afbeelding (Image Type → → RGB-kleur). Tot slot, maak een stapel uit de beelden (Afbeelding → Stacks → afbeelding om Stacks), waarna ze verder kan worden afgestemd op de "Stack Reg" plug-in, indien nodig. Uiteindelijk, het samenvoegen van de kanalen en dan het combineren van de beelden creëert een 3D-montage van alle eilandjes in de gehele alvleesklier. Om de afbeelding, klik op "Plugins" en dan "3D-viewer." </li></ol> 4. Islet Mapping Verzamelen Afbeeldingenstapels <ol><li> Situeren de ganse berg pancreaseilandjes onder de microscoop. </li><li> Open de Slidebook software. Toegang tot de "Capture and Control Focus" door te drukken op "Ctrl + Shift + E." In de "Focus Control"-venster, de doelstelling geformuleerd om 20X of 40x, afhankelijk van de grootte van het eiland. Van toepassing zijn water bij gebruik van een water-immersie objectief lens. </li><li> Met het oog op de microscoop oculair te gebruiken om eilandjes te vinden, stelt u "Bin" om 2X en zet de Filter Set om Gebruiker1 in de "Focus Controls" venster. "Emission Selection" moet worden ingesteld op 100% Ogen en Neutral Density op 1. Klik op "GFP ey" en dan "Open Fluor." </li><li> Te visualiseren het monster in Slidebook, terug te keren naar de Focus Controls venster en schakel "Filter Set" op "Live" en klik op "GFP ds." Gebruik de joystick om het eilandje midden in de camera een raam zo goed mogelijk. Focus op een diepte ergens nabij het centrum van het eilandje, waar de cellen gemakkelijk kunnen worden onderscheiden. </li><li> In de "Focus Controls Window", selecteer het "Z tabblad." Klik in de linkerbovenhoek van het venster om de huidige diepte in te stellen als een referentiepunt. Gebruik het scope controle om naar de bovenste diepte van het eilandje in welke functies duidelijk kan worden onderscheiden en klik op "set-top." Scroll naar de onderkant van het eiland in en klik op "Instellen Bottom." Klik op "Go" om terug te keren naar het referentiepunt. </li><li> In de Capture-venster, zet u "Bin Factor" naar "2X" en zet "Filter Set" naar "Live". Stel het "Capture type" naar "3D" (en enige 3D). Aan de rechterkant van het venster, klikt u op 'Gebruik Boven en Onder posities. " Klik op "Return to Point Na Capture Reference." Stel de "Step Size" naar "3." </li><li> Onder de "Filter Set Box," te selecteren DAPI DSU, GFP DSU, RFP DSU, en Cy5 DSU. Voor ieder een, klikt u op "beste te vinden" onder "Belichting aanpassen 'en vervolgens op" Test "om ervoor te zorgen dat de gekozen belichting geschikt is. Klik op "Start" om de vangst te beginnen. </li><li> Als de opname is voltooid, stelt u de niveaus als nodig en de weergegeven kleur voor RFP naar wit. Sla de slide en ga naar → Exporteren → TIFF-serie View. Typ de naam van de dia met een streepje aan het einde en sla het op. Tientallen individuele TIFF-bestanden worden gemaakt, dus het kan handig zijn om elke eilandje het imago van stapel te houden in een aparte map. </li></ol> Mapping Afbeeldingenstapels <ol><li> Open Stereo Investigator. Visualiseer het beeld door het openen van het beeld stacks (File → Afbeelding Stack → Afbeelding Stack Open). In de "Image Scaling menu," set "afstand tussen Images" naar 3,00 micrometer. Om te corrigeren voor 2X binning in Slidebook, selecteer dan "overschrijven X en Y Scaling" en "Gebruiker gespecificeerd voor Bron van X en Y" Scaling en voer 0,65 voor zowel X en Y. </li><li> Midden van de afbeelding door te klikken in het midden van het eilandje van belang in de "Macro-venster." Mark ten minste een cel met de juiste markering. Beta-cellen groen verschijnen, zal alfa-cellen verschijnen, rood, en delta-cellen zal verschijnen witte, gebruik Marker 2 (een holle cirkel) om beta-cellen, Marker 5 (een holle driehoek) merk alfa-cellen markeren, en Marker 6 ( een holle driehoek) tot delta-cellen. De cellen moeten worden gemarkeerd in het centrum van hun kern, die zal verschijnen blauw als het monster is gekleurd met DAPI. </li><li> Zodra ten minste een cel is gemarkeerd, geeft u de "Orthogonal View" met behulp van het pictogram in het hoofdmenu. Check "Z-Filter" en "Symmetrisch". Het assortiment should worden ingesteld op 15,00. Beginnend bij de 0.0 Z-niveau, bladert u door het eilandje met de muis wiel en markeer elke cel met de juiste markering. Elke cel mag slechts eenmaal worden gemarkeerd in het centrum van de diepte. Bij het afwerken op iedere van de Z-niveaus, de "Z-filter" vakje kan worden uitgeschakeld. Deze toont alle van de markeringen van alle van de Z-niveau. </li><li> Als elke cel is gemarkeerd, wordt het bestand opslaan als een "DAT" bestand, ga dan naar → Exporteren Tracing File. Sla de tracing als een "TXT" bestand. Klik op "Nieuwe gegevens File" om de werkruimte te wissen voordat u probeert om nieuwe eilandjes kaart. </li></ol> 5. Representatieve resultaten: De voorbereiding van Virtual Schijfjes uit een immunohistochemisch gekleurde pancreas monster in staat stelt een te onderzoeken alle van de endocriene cellen (alfa, beta en delta-cellen) in het hele alvleesklier, zowel samen als eilandjes (Figuur 1A) en individueel in aparte kanalen ( Figuur 1B). Met de hulp van computerprogramma's en scripts, kan een massa-analyse van grootschalige data worden uitgevoerd op deze Virtual Slices. In het bijzonder, een analyse van deeltjes van composiet maskers (figuur 1C) is uitgevoerd als een tabel met statistieken die dergelijke parameters als eilandje oppervlakte, omtrek (de afstand rond een gebied), rondheid (een zekere mate van rondheid, waarbij 1,0 staat voor een perfecte cirkel) en Feret diameter van (de langste afstand binnen een gebied) voor elk eilandje ontdekt (figuur 1D). De grootschalige analyse van deze beelden resulteert in de productie van het totale aantal eilandje en de grootteverdeling histogrammen, evenals een gedetailleerde vergelijking van alfa-, bèta-, delta-en-cel gebieden. Daarnaast wordt elke Virtual Slice genomen op een diepte van ongeveer 5 micrometer, en al van de individuele 2D Virtual Schijfjes zijn verder gestapeld tot een 3D-reconstructie van het gehele pancreas monster te creëren. Eilandje in kaart brengen toont een ander voorbeeld, niet alleen van het vastleggen van eilandjes in 3D, maar ook van gedetailleerde computer-ondersteunde analyse. Eilandje in kaart brengen bestaat uit het vastleggen van de verschillende eilandjes (Figuur 2A) en de daaropvolgende markering van alfa-, bèta-, delta-en-cellen op verschillende Z-vliegtuigen (figuur 2B) op een eilandje in 3D (figuur 2C, D) te visualiseren. Geautomatiseerde wiskundige analyse van in kaart gebracht eilandjes displays hun cellulaire samenstelling en architectuur, met inbegrip van cel-cel afstanden (figuur 2E) en cumulatieve kansen van cel-cel op afstand distributies (figuur 2F). <img src="/files/ftp_upload/2471/2471fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Grootschalige afvang en analyse van eilandje distributie via Virtual Slice. A. Virtual slice weergave van een menselijke pancreas sectie. a. Immunohistochemische kleuring voor insuline (groen), glucagon (rood), somatostatine (wit) en DAPI (blauw). b. Omgerekend 8-bit masker na automatische drempelwaarden. Een boxed gebied is vergroot in BB Views van elk kanaal. a. delta-cellen, b. beta-cellen, c. alfa-cellen, en d. samengevoegd samengestelde afbeelding. C. Particle analyse uitgevoerd op composiet masker. Merk op dat elke eilandje structuur met inbegrip van kleine cel clusters is genummerd (blauwe markering). D. Statistieken tabel met verschillende parameters gemeten voor individuele structuren, die id's die overeenkomen met labels aangegeven in C hebben <img src="/files/ftp_upload/2471/2471fig2.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 2. Analyse van de immunohistochemische Virtual Slice. A. 3D scatterplot van figuur 1 toont grootte en vorm distributie van elke eilandje door parameters zoals het gebied, circulariteit en Feret de diameter. B. 3D scatterplot van figuur 1 toont cellulaire eilandje samenstelling en omvang. C. Islet grootteverdeling van de gehele menselijke sectie analyse van Figuur 1 gemonteerd op een lognormale kansdichtheid distributie. D. Wiskundige analyse van de cellulaire samenstelling van ratio's (beta-cellen in het groen, alfa-cellen in het rood en delta-cellen in het blauw) voor elke eilandje effectieve diameter bak van Figuur 1. E. a. Eilandje grootteverdeling van de steekproefsgewijze immunohistochemische analyse (links). Eilandje grootteverdeling van de virtuele slice analyse (rechts). b. Log-normale plot vergelijking van de steekproefsgewijze immunohistochemische analyse (rood) en virtuele slice (blauw). <img src="/files/ftp_upload/2471/2471fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Islet in kaart brengen en wiskundige analyse van de cellulaire samenstelling en architectuur. A: Screen-capture met een focal plane van een 3D-gereconstrueerde stapel van beelden van een menselijk eilandje geüpload naar Stereo-Investigator (beta-cellen in het groen, alfa-cellen in het rood, delta-cellen in het wit, en de kernen in het blauw) . B: Fluorescentie beelden (links) en bijbehorende gegevens in kaart gebracht (rechts) in drie verschillende focale vliegtuigen getoond met een interval van 10 urn. C: representatief beeld van 3D gereconstrueerd eilandje kaartgegevens. D: 3D reconstructie van de wijk-gesneden eilandje op basis van de coördinaten verkregen door het eilandje in kaart brengen. E: Wiskundige analyse van cellulaire samenstelling en architectuur. Left. Relatieve frequentie van cel-cel afstanden tussen twee cellen in een enkele cel populatie. Rechts. Relatieve frequentie van cel-cel afstanden tussen twee verschillende celpopulaties. F: Kolmogorov-Smirnov (KS) te testen. Links. Cumulatieve kansen van cel-cel op afstand distributies voor alfa-to-alpha, beta-to-beta en delta-to-delta cellen. Rechts. KS afstanden voor de corresponderende drie cumulatieve kansen.

<ol><li>Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+islet+plasticity+-+Interspecies+comparison+of+islet+architecture+and+composition%5BTitle%5D)+AND+%22ISLETS%22%5BJournal%5D)">Pancreatic islet plasticity - Interspecies comparison of islet architecture and composition.</a> ISLETS. 2, 135-145 (2010).</li>
<li>Kim, A., Miller, K., Jo, J., Wojcik, P. l, Kilimnik, G., Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+architecture+-+a+comparative+study%5BTitle%5D)+AND+%22ISLETS%22%5BJournal%5D)">Islet architecture - a comparative study.</a> ISLETS. 1, 129-136 (2009).</li>
<li>Kilimnik, G., Kim, A., Jo, J., Miller, K., Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+pancreatic+islet+distribution+in+situ+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Quantification of pancreatic islet distribution in situ in mice.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 297, E1331-E1338 (2009).</li>
<li>Hara, M., Dizon, R. F., Glick, B. S., Lee, C. S., Kaestner, K. H., Piston, D. W., Bindokas, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+pancreatic+beta-cells+in+the+intact+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Imaging pancreatic beta-cells in the intact pancreas.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 290, E1041-E1047 (2006).</li>
<li>Hara, M., Wang, X., Kawamura, T., Bindokas, V. P., Dizon, R. F., Alcoser, S. Y., Magnuson, M. A., Bell, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+mice+with+green+fluorescent+protein-labeled+pancreatic+beta+-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Transgenic mice with green fluorescent protein-labeled pancreatic beta -cells.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 284, E177-E183 (2003).</li>
</ol>

De computer-assisted grootschalige visualisatie en kwantificatie hier gepresenteerde veroorloven vier belangrijke punten in eilandjes van Langerhans studies: (1) Een grootschalige analyse van de alvleesklier exemplaren biedt een uitgebreid overzicht van de totale omvang eilandje distributie en eilandje architectuur. (2) De 3D reconstructie en wiskundige analyse van de cellulaire samenstelling en architectuur verder vergemakkelijken het onderzoek naar de ruimtelijke rangschikking van de endocriene cellen binnen een eilan...

<table><tbody><tr><td>Fluorescentiemicroscoop</td><td>Microscoop</td><td>Olympus Corporation</td><td>IX-81</td><td></td></tr><tr><td>Stereo Investigator</td><td>Programma</td><td>MBF Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MIP-GFP muizen</td><td>Muizen</td><td>Jackson Laboratory</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mathematica</td><td>Programma</td><td>Wolfram</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image J</td><td>Programma</td><td>National Institutes of Health</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slidebook</td><td></td><td>Programma</td><td>Olympus</td><td></td></tr></tbody></table>

computer-assisted grootschalige visualisatie en kwantificering van eilandjes van langerhans massa, afmetingen distributie en architectuur

Computer-assisted Large-scale Visualization and Quantification of Pancreatic Islet Mass, Size Distribution and Architecture

De eilandjes van Langerhans is een unieke micro-orgaan bestaat uit verschillende hormonen uitscheiden endocriene cellen, zoals beta-cellen (insuline), alfa-cellen (glucagon), en de delta-cellen (somatostatine) die zijn ingebed in de exocriene weefsel en omvatten 1 - 2% van de gehele alvleesklier. Er bestaat een nauwe samenhang tussen lichaam en alvleesklier gewicht. Totaal aantal beta-celmassa neemt ook evenredig te compenseren voor de vraag naar insuline in het lichaam. Wat ontsnapt dit in verhouding uitbreiding is de grootteverdeling van de eilandjes. Grote dieren zoals mensen delen dezelfde eilandje grootteverdelingen met muizen, wat suggereert dat deze micro-organismen een bepaalde omvang te beperken tot functioneel is. Het onvermogen van grote dieren pancreata om proportioneel grotere eilandjes te genereren wordt gecompenseerd door een toename van het aantal eilandjes en door een toename van het aandeel van de grotere eilandjes in hun algemene eilandje grootteverdeling. Bovendien, eilandjes vertonen een opvallende plasticiteit in cellulaire samenstelling en de architectuur tussen de verschillende soorten en ook binnen dezelfde soort onder verschillende pathofysiologische omstandigheden. In de huidige studie beschrijven we nieuwe benaderingen voor het analyseren van biologische beeldgegevens om de automatisering van analytische processen, die zorgen voor de analyse van grote en heterogene data collecties in de studie van dergelijke dynamische biologische processen en complexe structuren te vergemakkelijken. Dergelijke studies werden gehinderd te wijten aan technische problemen van de onpartijdige bemonstering en het genereren van grootschalige datasets om precies vast te leggen met de complexiteit van biologische processen van eilandje biologie. Hier laten we methoden om onpartijdige &quot;vertegenwoordiger&quot; gegevens te verzamelen binnen de beperkte beschikbaarheid van de monsters (of om de monstername te minimaliseren) en de standaard experimentele instellingen en om precies te analyseren van de complexe driedimensionale structuur van het eilandje. Computer-assisted automatisering zorgt voor het verzamelen en analyseren van grootschalige datasets en ook zorgt voor onpartijdige interpretatie van de gegevens. Bovendien is de precieze kwantificering van eilandje grootte-verdeling en ruimtelijke coördinaten (dat wil zeggen X, Y, Z-posities) leidt niet alleen tot een nauwkeurige visualisatie van eilandjes van Langerhans structuur en samenstelling, maar ook stelt ons in staat om patronen tijdens de ontwikkeling en aanpassing te identificeren op een wijziging van omstandigheden door middel van wiskundige modellering. De ontwikkelde methoden in dit onderzoek zijn van toepassing op studies van vele andere systemen en organismen ook.

Nieuwe computer-ondersteunde methoden van grootschalige inkoop en de analyse van immunohistochemisch gekleurde alvleesklier exemplaren zijn beschreven: (1) Virtual Snijd verovering van de hele afdeling, (2) massa-analyse van grootschalige data, (3) Reconstructie van 2D Virtual Slices , (4) 3D eilandje in kaart brengen, en (5) Wiskundige analyse.

Computer-assisted Grootschalige visualisatie en kwantificering van eilandjes van Langerhans massa, afmetingen Distributie en Architectuur

Het pancreaseilandje is een uniek micro-orgaan dat is opgebouwd uit verschillende hormoonsecreterende endocriene cellen, zoals bètacellen (insuline), alfacellen (glucagon), ...

Het algemene doel van deze procedure is om onbevooroordeelde representatieve gegevens te verzamelen binnen een beperkt monster en om de complexe driedimensionale structuur van het weefsel nauwkeurig te analyseren. Dit wordt bereikt door eerst virtuele coupes te maken van immunohistochemisch gekleurde pancreassecties. Vervolgens worden de virtuele coupes gekwantificeerd met de IHC virtual slice macro in ImageJ-software, waarna de gegevens worden geanalyseerd met scripts geschreven voor Mathematica.Vervolgens wordt met behulp van Image J een 3D-reconstructie van de virtuele coupes uitgevoerd. De laatste stap van de procedure is het vastleggen van een stack van individuele eilandjesbeelden met de slide book-software en het handmatig in kaart brengen van de beeldstacks in drie dimensies met stereo investigator. Uiteindelijk kan de precieze architectuur van de eilandjes met 3D-coördinaten voor elke eilandjescel worden verkregen via een gecombineerde methode van 3D-beeldvorming en handmatige mapping. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van obesitas- en diabetesstudies, zoals hoe fysiologische en pathofysiologische omstandigheden de massa van de pancreatische bètacellen, de distributie van de eilandjes en de architectuur beïnvloeden.De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de diagnose of therapie van obesitas en diabetes mellitus, aangezien een beter begrip van de veranderingen in de bètacelmassa de ontwikkeling en evaluatie van therapeutische interventies zal vergemakkelijken. Hoewel de methoden die in de huidige studie worden beschreven specifiek inzicht bieden in de dynamische immunohistochemische analyse van de pancreas, kunnen ze ook worden toegepast op een reeks andere organismen en weefsels. Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, omdat de computerondersteunde analysestappen moeilijk aan te leren zijn.Vanwege de complexiteit van het analyseren van dergelijke grote datasets in twee en drie dimensies. Begin deze procedure door een schoon objectglas met een volledige sectie van een immunohistochemisch gekleurde pancreas in de houder van een fluorescentiemicroscoop te plaatsen. Open de Stereo Investigator-software en visualiseer het monster door op acquisitie te klikken.Neem vervolgens live beelden. Bepaal de belichtingsniveaus voor elk kanaal met behulp van het videohistogramvenster, waarin de fluorescentie-intensiteit wordt weergegeven. In dit voorbeeld wordt kanaal twee gebruikt voor DAP, kanaal drie voor GFP, kanaal vier voor RFP, kanaal vijf voor sci five en kanaal zes voor SCI seven.Pas via het instellingenvenster van de camera het belichtingsniveau aan, zodat de fluorescentie-intensiteit afneemt. Aan de rechterkant van het videohistogram kan het beeld worden gescherpt met het focuswiel van de microscoop. Voordat u een virtuele coupe maakt, contoureet u het monster door op een punt op het scherm buiten het monster te klikken, wat als referentiepunt dient.Klik vervolgens rond de omtrek van het monster wanneer de contour is voltooid. Klik met de rechtermuisknop en selecteer 'close contour' om het begin- en eindpunt te verbinden. Zodra de contour is gesloten, legt u een virtuele doorsnede van het monster vast door 'acquisition' te selecteren en vervolgens 'acquire virtual slice'. Wanneer de opties voor het venster van de virtuele doorsnede openen, selecteert u 'high speed acquire' en schakelt u 'manual' uit.Stel de focus in door het vakje naast handmatig uit te vinken. Sla het bestand op. Kalibreer de prefo door met de rechtermuisknop te klikken en toevoegen aan focuslocatielijst te selecteren.Stel handmatig de focus in voor verschillende willekeurige secties in de preview van de virtuele slice. Wanneer meerdere locaties in focus zijn gebracht, start de virtuele slice door met de rechtermuisknop te klikken en te selecteren: Start virtual slice with prefo. Nadat de virtuele slice voor het eerste monster is voltooid, schakelt u over naar het volgende kanaal en past u de belichting dienovereenkomstig aan. Deze procedure wordt voor elk kanaal herhaald om kwantificering van eyelets uit te voeren; verwerk de beelden met een ImageJ-macro genaamd I-H-C-V-S, die eerst de geladen beelden voorbereidt voor analyse en vervolgens kenmerken van eyelets, zoals de cellulaire samenstelling, kwantificeert.De I-H-C-V-S macro's splitsen de stack in de respectievelijke kleurkanalen. In ImageJ wordt elke afbeelding omgezet in een zwart-wit masker van acht bit. Na automatische intensiteitsdrempelwaarde-bepaling worden de afzonderlijke kanaalafbeeldingen rekenkundig samengevoegd tot een samengesteld masker.De ingebouwde particle-analyse van Image J op de composietafbeelding identificeert vervolgens regio's van belang of ROI's, waarbij particles die kleiner zijn dan één bètacel worden uitgesloten. De kwantificatie van ROI's met Image J resulteert in een spreadsheet met celparameters.Sla de geaggregeerde resultaten op in een Excel-spreadsheet. Sla gegevens op zoals oppervlakte, omtrek, circulariteit, Feret-diameter en het centrum van elk oogje, samen met de corresponderende nummers zoals aangegeven in de afbeelding. De computationele analyse van deze parameters kan worden uitgevoerd zoals beschreven in het geschreven protocol. Om informatie te onthullen, waaronder de distributie en frequentieanalyse van de oogjes, voert u een 3D-reconstructie van virtuele coupes uit door een script te draaien dat alle JP2-afbeeldingen in de map converteert naar TIF-bestanden; dit is het formaat dat wordt gebruikt voor de constructie en kwantificering van driedimensionale stacks vanuit de virtuele coupes.Hier wordt een script genaamd I MJ two two tiff gebruikt. Kopieer het script naar de directory die de JP two-afbeeldingen bevat. Voer het script uit met de Linux shell door dot slash I am JP two two TIFF in de console te typen en vervolgens op enter te drukken.Wanneer alle vastgelegde beelden zijn geconverteerd van JPEG2 naar TIFF-bestanden, kunnen ze worden gebruikt voor analyse in ImageJ. Open met ImageJ alle beelden van het eerste monster, dat in dit geval afkomstig is van een menselijke foetale pancreas, en voeg deze samen tot één beeld door Image, Color en vervolgens Merge Channels te selecteren. Herhaal dit proces voor elk van de monsters. Wanneer alle monsters zijn samengevoegd tot enkele beelden, kunnen deze worden opgeschoond door ongewenste regio's te selecteren met de Polygon Selections-tool.Vul deze in door 'edit' en vervolgens 'fill' te selecteren. Converteer elke afbeelding naar een RGB-kleurafbeelding. Maak tot slot een stack van de afbeeldingen, waarna deze verder kunnen worden uitgelijnd met de stack reg-plugin.Uiteindelijk creëert het samenvoegen van de kanalen en het combineren van de beelden een 3D-montage van alle oogjes in de gehele pancreas. Om beeldstacks te verzamelen, plaatst u de whole mount pancreas-oogjes onder de microscoop. Voeg water toe indien u gebruikmaakt van een waterimmersie-objectief.Open de software van het objectglassysteem, ga naar de opname- en focusbediening door op Ctrl + Shift + E te drukken in het focusbedieningsvenster. Stel het objectief in op 20x of 40x, afhankelijk van de grootte van het oogje. Om het oculair van de microscoop te gebruiken om de oogjes te lokaliseren, stelt u de binoculaire vergroting in op 2x en de filterset op user 1.In het venster voor de focusregeling moet de emissieselectie worden ingesteld op 100%Eyes; de neutrale dichtheid moet worden ingesteld op één klik GFP ey, waarna de vloer wordt geopend om het monster in slide book te visualiseren. Keer terug naar het venster voor de focusregeling en schakel de filterset over naar fix. Klik vervolgens op G-F-P-D-S. Gebruik de joystick om het oogje in het venster van camera één zo goed mogelijk te centreren.Stel de focus in op een diepte nabij het midden van het oogje waar de cellen gemakkelijk te onderscheiden zijn. Selecteer in het venster voor focusregeling de zab. Gebruik de scope-regeling om naar de bovenste diepte van het oogje te scrollen waarin kenmerken duidelijk te onderscheiden zijn, en klik op set top.Scroll naar de onderkant van het oogje en klik op set. Klik onderaan op go. Om terug te keren naar het referentiepunt in het acquisitievenster, klikt u op advanced en vervolgens op alternate bij de kanaalmodus.Stel de bin factor in op twee keer en het capture-type op 3D aan de rechterkant van het venster, klik op 'use top and bottom positions' en 'return to center volume after capture'. Stel de stapgrootte in op drie. Stel de filterset in op 'live' onder het vak voor de filterset.Selecteer DAP, E-D-S-U-G-F-P-D-S-U-R-F-P-D-S-U en SCI vijf DSU. Klik voor elk van deze op 'find best' onder 'adjust exposure'. Klik vervolgens op 'test' om te controleren of de geselecteerde belichting geschikt is.Klik op start om de opname te beginnen. Wanneer de opname is voltooid, past u de niveaus naar behoefte aan en wijzigt u de weergegeven kleur voor RFP naar wit. Sla de slide op en ga naar het bekijken van de geëxporteerde TIFF-serie.Typ de naam van de slide in met een koppelteken aan het einde en sla deze op. Er worden tientallen individuele TIF-bestanden aangemaakt, dus het kan handig zijn om elke image stack van de oogleden in een aparte map te bewaren. Open de stereo investigator-software om de image stacks in kaart te brengen.Visualiseer de afbeelding door de afbeeldingsstacks in het menu voor beeldschaling te openen. Stel de afstand tussen de afbeeldingen in op drie micron om te corrigeren voor een tweevoudige buiging. Selecteer in het slide-boek de optie om de X- en Y-schaling te overschrijven en gebruik een gespecificeerde waarde voor de bron van de X- en Y-schaling.Voer 0,65 in voor zowel het X- als Y-centrum en zoom in op de afbeelding door op de zoomknop te klikken; markeer vervolgens in het midden van de iris van belang in het macrovenster ten minste één cel. Bij gebruik van de juiste marker zullen bètacellen groen verschijnen. Alfacellen zullen rood verschijnen en deltacellen zullen wit verschijnen.Markeer de cellen in het centrum van hun kern, die blauw zullen verschijnen als het monster is gekleurd met DPI. Gebruik Marker twee om bètacellen te markeren, Marker vijf voor alfacellen en Marker zes voor deltacellen. Zodra er ten minste één cel is gemarkeerd, wordt het orthogonale beeld weergegeven met behulp van het pictogram in het bovenmenu; vink Z filter en symmetric aan.Het bereik moet worden ingesteld op 15.00. Begin bij 0.0 Z. Scroll met het muiswiel door de oogjes en markeer elke cel met de juiste marker; markeer elke cel slechts één keer in het midden van de diepte. Nadat alle Z-niveaus zijn gemarkeerd, kan het selectievakje voor het Z-filter worden uitgevinkt.Dit zal alle markeringen van alle Z-niveaus tonen. Wanneer elke cel is gemarkeerd, slaat u het bestand op als een DAT-bestand. Ga vervolgens naar file export tracing.Sla de tracing op als een TXT-bestand. Klik tot slot op 'new data file' om de werkruimte leeg te maken voordat u probeert nieuwe eyelets in kaart te brengen. De bereiding van virtuele coupes uit een immunohistochemisch gekleurd pancreasmonster maakt het mogelijk om de alfa-, bèta- en deltahormoonproducerende endocriene cellen in de gehele pancreas samen als eilandjes te onderzoeken; de immunohistochemische kleuring voor insuline is in het groen te zien, glucagon in het rood, somatostatine in het wit en dap in het blauw.De beelden werden vervolgens na automatische drempelwaarde-bepaling omgezet in een 8-bits masker. Hier wordt het samengestelde merge-beeld getoond. De distributie van oogjes met behulp van virtuele coupes maakt echter ook individuele analyse in afzonderlijke kanalen mogelijk.Hier worden weergaven van elk kanaal getoond om de deltacellen, betacellen en alfacellen te onthullen. De partikelanalyse is uitgevoerd op een samengesteld masker waarop elke eyelet-structuur genummerd en blauw gemarkeerd is. De partikelanalyse van de samengestelde maskers wordt uitgegeven als een datatabel met parameters zoals het oppervlak, de omtrek en de circulariteit van de eilanden, evenals diverse diameters voor elke gedetecteerde eyelet, met ID's die overeenkomen met de genummerde labels op het samengestelde masker.De grootschalige analyse van deze beelden resulteert in de productie van histogrammen van het totale aantal eilandjes en de grootteverdeling, evenals gedetailleerde vergelijkingen van de oppervlakten van alfa-, bèta- en deltacellen. Mapping van de eilandjes en mathematische analyse van de cellulaire samenstelling en architectuur kunnen een enkel brandvlak onthullen uit een 3D-gereconstrueerde stapel beelden van menselijke eilandjes die zijn geüpload in Stereo Investigator. Hier zijn de bètacellen in het groen, de alfacellen in het rood, de deltacellen in het wit en de kernen in het blauw.Na de acquisitie van verschillende eylets worden alfa-, bèta- en deltacellen hier op diverse diepten gemarkeerd; fluorescente beelden en de bijbehorende kaartgegevens worden getoond voor drie verschillende brandvlakken met een interval van 10 microns. Zodra de alfa-, bèta- en deltacellen op diverse vlakken zijn gemarkeerd, kan het eylet in 3D worden gevisualiseerd. Hier wordt een 3D-reconstructie getoond van het in kwarten gesneden eylet, gebaseerd op coördinaten verkregen via eylet-mapping.Bovendien kan een geautomatiseerde wiskundige analyse van in kaart gebrachte eyelets de cellulaire samenstelling en architectuur weergeven. Hier wordt de relatieve frequentie van cel-celafstanden tussen twee cellen in een enkele celpopulatie getoond. Ook wordt de relatieve frequentie van cel-celafstanden tussen twee verschillende celpopulaties weergegeven.Ook worden de cumulatieve waarschijnlijkheden van cel-tot-cel-afstandverdelingen voor alfa-naar-alfa-, bèta-naar-bèta- en delta-naar-delta-cellen getoond. De Kolmogorov-Smirnov- of KS-test kan op deze waarschijnlijkheden worden uitgevoerd om de overeenkomstige KS-afstanden te verkrijgen. Zodra dit beheerst is, kan grootschalige beeldvorming en analyse van een volledige weefselcoupe in vier uur worden uitgevoerd.3D-reconstructie van een weefselblok kan in 30 minuten worden voltooid. Ten slotte kunnen 3D-beeldvorming en handmatige mapping in vier uur worden afgerond als dit correct wordt uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te beginnen met een hoogwaardige immunohistochemische kleuring van de coupes.De nauwkeurigheid van de daaropvolgende analyse is volledig afhankelijk van de ruwe data. Zorg er daarnaast voor dat uw computers ten minste acht gigabytes RAM hebben om een analyse van deze omvang te kunnen verwerken. Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers, niet alleen op het gebied van obesitas en diabetes, maar breed in vele andere vakgebieden die gebruikmaken van de standaard pathologische analyse.Dit kan bijzonder nuttig zijn wanneer de beschikbaarheid van monsters beperkt is. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u onbevooroordeelde representatieve gegevens verzamelt binnen een beperkte steekproefomvang met behulp van standaardtechnieken. Het selecteren van slechts een specifiek gebied is mogelijk niet representatief voor het volledige beeld, zoals we hebben aangetoond in onze studie naar de distributie van pancreaseilandjes.

computer-assisted-large-scale-visualization-quantification-pancreatic

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Het volgende protocol schetst het proces van het pancreas dissectie voor virtuele slice beeldvorming, en de daaropvolgende kwantificering van alle GFP-gelabelde beta-cellen in de gehele alvleesklier.

In situ kwantificering van beta-celmassa in Muizen

We beschrijven de aanpassing van optische projectie tomografie...

Nabij Infrarood Optische projectie Tomografie voor de beoordeling van β-cel Massa Distributie in Diabetes Research

Hier presenteren we een protocol bij afbeelding menselijke alvleesklier secties in drie dimensies (3D) met behulp van geoptimaliseerde passieve methoden wissen. Dit manuscript toont deze procedures voor de passieve optische clearing gevolgd door meerdere immunofluorescentie kleuring ter identificatie van de belangrijkste elementen van de autonome en zintuiglijke neurale netwerken innervating menselijke eilandjes.

Hoge resolutie 3D beeldvorming van het Neuro-insulaire netwerk van menselijke alvleesklier

Dit eilandje isolatie protocol beschreef een roman route van Collagenase injectie om het exocriene weefsel te verteren en een vereenvoudigde gradiënt procedure om de eilandjes van muizen te zuiveren. Het gaat om enzymatische spijsvertering, gradiënt scheiding/zuivering en eilandje hand-picking. Succesvolle isolatie kan 250 – 350 hoge kwaliteit en volledig functionele eilandjes per muis opleveren.

Een eenvoudig hoog rendement protocol voor isolatie van de alvleesklier eiland van muizen

Hier presenteren we een protocol voorbeeld vorming en kwantificeren van de calcium dynamica in heterogene celpopulaties, zoals de eiland cellen van de alvleesklier. Fluorescerende verslaggevers worden geleverd in de perifere laag van cellen binnen het eilandje, die vervolgens wordt geïmmobiliseerd en imaged, en per-cel analyse van de dynamiek van de intensiteit van de fluorescentie wordt uitgevoerd.

Imaging calcium dynamica in subpopulaties van muizen pancreatic eilandje cellen

Het doel van dit protocol is om continu de dynamiek van het menselijke alvleesklier eilandje engraftment proces en de bijdragende gastheer versus donorcellen te controleren. Dit wordt bereikt door het transplanteren van menselijke eilandjes in de voorste kamer van het oog (ACE) van een NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-muisontvanger gevolgd door herhaalde 2-foton beeldvorming.

Longitudinale In Vivo Beeldvorming en kwantificering van menselijke alvleesklier eilandjes en bijdragende gastheercellen in de oogkamer van het voorste oog

In vivo beeldvorming met hoge resolutie van de alvleesklier werd vergemakkelijkt met het pancreas intravital imaging venster.

Gestabiliseerde longitudinale in vivo cellulaire visualisatie van de alvleesklier in een murien model met een pancreas intravital imaging venster

In dit protocol worden de pancreaseilandjes gereconstrueerd en geanalyseerd met behulp van computationele algoritmen die zijn geïmplementeerd in een speciale multiplatformtoepassing.

Computationele reconstructie van pancreaseilandjes als hulpmiddel voor structurele en functionele analyse

Dit protocol beschrijft hoe menselijke alvleesklierplakjes van overleden orgaandonoren kunnen worden gegenereerd om de celfunctie onder bijna-fysiologische omstandigheden te bestuderen. Deze innovatieve aanpak maakt het mogelijk om normale en structureel beschadigde eilandjes te onderzoeken en de ingewikkelde wisselwerking tussen endocriene en exocriene compartimenten.

Het genereren van plakjes menselijk pancreasweefsel om endocriene en exocriene pancreasfysiologie te bestuderen

Grootschalige Schermen van Metagenomic Bibliotheken

Verken een geautomatiseerde methode voor grootschalige 3D-analyse van eilandjes van Langerhans met behulp van immunohistochemie en beeldanalyse. Deze aanpak kwantificeert isletgrootte, celcompositie en ruimtelijke organisatie.

Computer-assisted Grootschalige visualisatie en kwantificering van eilandjes van Langerhans massa, afmetingen Distributie en Architectuur (Video) | JoVE Journal

Computer-assisted Grootschalige visualisatie en kwantificering van eilandjes van Langerhans massa, afmetingen Distributie en Architectuur

Meer video's verkennen