Name: Zuivering van voorlopercellen uit Skeletal Muscle (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 55 s
Description: Leer hoe je levensvatbare myogene en adipogene voorlopercellen isoleert uit murine skeletspier via enzymatische dissociatie en FACS. Deze methode analyseert celpopulaties tijdens weefselregeneratie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

1. Tissue Collection: <ol><li> Gebruik muizen tussen 7 en 12 weken oud. Meestal worden ten minste twee dieren die worden gebruikt: de ene is het instellen van de FACS in een kleur die vereist zijn voor compensatie en voor fluorescentie-min-een isotype controle monsters. De andere is de werkelijke steekproef voor het sorteren. </li><li> Euthanaseren de muizen door de CO 2 inhalatie of volgens een protocol ethiek van de keuze. Plaats muizen op een papieren handdoek, naar boven, en spray met 70% ethanol grondig om verontreiniging te voorkomen met de muis vacht. </li><li> Til de huid in de buikstreek met een tang, maak dan een kleine lengte snijden met scherpe schaar. </li><li> Schil de twee flappen van de huid in tegengestelde richtingen (omhoog en omlaag) volledig bloot achterste ledematen spieren eronder. </li><li> Accijnzen het spierweefsel door het invoegen en uitbreiding van de schaar langs beide zijden van het scheenbeen. </li><li> Herhaal dezelfde procedure voor het dijbeen naar het spierweefsel extract. </li><li> Plaats alle geëxcideerde spierweefsel in 60mm petri-schalen, met behulp van een schotel voor het weefsel van elke muis. </li><li> Herhaal het bovenstaande voor alle muizen. </li></ol> 2. Distantiëren weefsel in enkele cellen door enzymatische digestie: Gedurende dit deel van het protocol, gebruik steriele reagentia en hulpmiddelen en werken onder steriele omstandigheden. <ol start="9"><li> Voeg 2 mL van Collagenase II (Sigma, cat # 6885, 500u / ml) en 20 pi van 250mm CaCl 2 voorraad aan elke Petri-schaal. </li><li> Scheur het spierweefsel in kleine stukjes (ongeveer 1 mm 3) met twee tang (een gekartelde, een met twee tanden, van Fine Science Tools, kat # 11051-10, 11154-10), aandacht te verwijderen en gooi zoveel mogelijk verontreinigde niet-spierweefsel mogelijk te maken. </li><li> Dek de Petri-gerechten en incubeer ze op 37 graden Celsius gedurende 30 minuten. </li><li> Haal het Petri-schalen en het gebruik van een 3 ml spuit zuiger grondig mash het weefsel stukken. Gebruik een zuiger voor elk monster aan verontreinigingen te voorkomen. </li><li> Voeg wat (~ 5 ml) steriel koude PBS aan elk Petri-schaal en giet het weefsel slib in een 50 ml Falcon buis (spoel de Petri-schaal indien nodig, om alle weefsel te herstellen) </li><li> Schud de Falcon buis, de buis vullen met PBS, centrifuge @ 800rpm x 5 minuten (Eppendorf bench top Model: 5810R), en zuig het supernatant (herhaal 3 keer) </li><li> Voeg 1 ml mengsel van Collagenase D (Roche, Cat # 11088882001, 1.5u / mL) / Dispase II (Roche, Cat #: 04942078001, 2.4u / ml) en 10μL van CaCl 2 (250mm) aan elke buis, incuberen bij 37 graden celsius met rotatie gedurende een uur. </li><li> Voeg 5-10 ml van de koude, steriele PBS, vortex en pipet grondig om het weefsel te homogeniseren. </li><li> Vul buizen met PBS en meng goed. </li><li> Breng de vloeistof op een cel 40μm zeef geplaatst op de top van een 50 ml Falcon buis om te filteren op de resterende grote stukken weefsel. Verdeel elk monster gelijkmatig in drie 50ml Falcon buizen. Vul elk van de buizen met PBS dan @ 1600 tpm gecentrifugeerd gedurende 5 minuten bij 8 graden Celsius. </li><li> Verwijder het supernatant en verzamelen van cellen voor kleuring. </li></ol> 3. Antilichaam kleuring en sorteren: Gedurende dit deel van het protocol, gebruik steriele FACS en het verzamelen buffers en werken onder steriele omstandigheden. Commerciële antilichamen worden over het algemeen beschouwd als steriel correct wordt gehanteerd. <ol start="20"><li> Voor een kleur-en isotype controle monsters, resuspendeer de steekproef in 1 ml FACS buffer en verdeel de geschorste cellen in negen 1,5 ml gelabelde Eppendorf buizen (100 pi elke buis). <ol><li> Stel een kleur vlekken vermengt zich volgens de volgende tabel: LET OP: De uiteindelijke concentratie van isotype controle antilichamen in de vlek moet overeenkomen met dat van het primaire antilichaam zij de controle voor. Bijvoorbeeld, als anti-Sca-1 wordt gebruikt voor een μg/10 6 cellen, moet de overeenkomstige isotype worden gebruikt bij dezelfde concentratie. <table border="1"><tbody><tr><td> Tube # </td><td> Naam van de buis </td><td> Vennootschap </td><td> Cat # </td><td> kloon </td><td> isotype </td><td> verdunning </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Niet-vlek </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2 </td><td> Hoechst33342 </td><td> sigma </td><td> B2261 </td><td></td><td></td><td> 2-5ug/ml </td></tr><tr><td> 3 </td><td> PI </td><td> sigma </td><td> P4864 </td><td></td><td></td><td> 1ug/ml </td></tr><tr><td rowspan="2"> 4 </td><td rowspan="2"> CD31-FITC CD45-FITC </td><td> eBioscience </td><td> 11-0311-85 </td><td> 390 </td><td> Rat IgG2a </td><td> 500 </td></tr><tr><td> Huis gemaakt </td><td></td><td> I3 / 2 </td><td> Rat IgG2b </td><td> 500 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> Sca1-PECY7 </td><td> eBioscience </td><td> 25-5981-82 </td><td> D7 </td><td> Rat IgG2a </td><td> 5000 </td></tr><tr><td> 6 </td><td> α-7 APC </td><td> Huis gemaakt </td><td></td><td> R2F2 </td><td> Rat IgG2b </td><td> 1000 </td></tr></tbody></table></li><li> Stel isotype controle vlekken vermengt zich met behulp van de volgende tabel: <table border="1"><tbody><tr><td> Tube # </td><td> Naam van de buis </td><td> Hoechst </td><td> PI </td><td> CD31- FITC </td><td> CD45- FITC </td><td> Schaalbare- PE-CY7 </td><td> een-7- APC </td><td> Rat- IgG2b- APC </td><td> Rat- IgG2a- pecy7 </td><td> Rat- IgG2a- FITC </td><td> Rat- IgG2b- FITC </td></tr><tr><td> 7 </td><td> Iso- CD31 / CD45 </td><td> + </td><td> + </td><td> - </td><td> - </td><td> + </td><td> + </td><td> - </td><td> - </td><td> + </td><td> + </td></tr><tr><td> 8 </td><td> Iso- Schaalbare- pecy7 </td><td> + </td><td> + </td><td> + </td><td> + </td><td> - </td><td> + </td><td> - </td><td> + </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> 9 </td><td> Iso- α-7-APC </td><td> + </td><td> + </td><td> + </td><td> + </td><td> + </td><td> - </td><td> + </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td></tr></tbody></table></li><li> Pipet de enkele kleur-en isotopen-controle vlekken mixen (we meestal pas zo aan de concentratie van antilichamen die tussen 5 en 10 pi van verkleuring mix worden toegevoegd aan elk monster) in de juiste eppendorfbuisje van Stap 20. Meng goed en incubeer op ijs gedurende 1 uur. </li></ol></li><li> Vlek cellen van monster muis met 800μL van het antilichaam cocktail (hieronder) voor FACS celsortering. Meng goed en incubeer op ijs gedurende 1 uur. Antilichaam cocktail: Hoechst, PI, CD31-FITC, CD45-FITC, Sca1-PECY7, α-7 APC LET OP: De optimale verhouding van antilichamen tegen cellen moet worden bepaald door individueel te titreren elk antilichaam, omdat er aanzienlijke verschillen kunnen bestaan ​​tussen partijen. De optimale hoeveelheid antilichaam moet worden gebruikt moeten worden uitgedrukt in μgs van antilichamen per 10 6 doelcellen en constant gehouden bij het ​​gebruik van dezelfde partij antilichaam. Het is duidelijk dat, indien het aantal van target cellen geen significante verandering tussen experimenten, of als de kleuring volume wordt geschaald met het aantal cellen, een vaste verdunning van elk antilichaam kan ook gebruikt worden. </li><li> Wassen: Voeg ongeveer 1 ml FACS buffer aan elk van de negen controle buizen; Voeg ongeveer 20 ml van FACS buffer om het monster buis. </li><li> Centrifugeer de Eppendorf buisjes @ 3000rpm gedurende 5 minuten (Eppendorf bench top centrifuge, Model: 5417C). Centrifugeer de monsterbuis @ 1600 tpm gedurende 5 minuten (Eppendorf bench top centrifuge, Model: 5810R). </li><li> Zuig Verwijder de bovenstaande vloeistof van alle buizen. </li><li> Resuspendeer cellen in de FACS buffer (1 ml voor elk van de controles, 4ml voor het sorteren sample), om Pipetteer cellen in "FACS buizen" door de cel kap zeef (BD Falcon cat # 352235, 40μm poriëngrootte) te verwijderen resterende klonten die mogelijk invloed op de cytometer. </li><li> Stel de FACS sorter met een enkele kleur controles en isotype controles. </li><li> Verzamel gesorteerd cellen volgens de onderstaande tabel in een 3,5 ml collectie buffer (95% DMEM, 5% FBS) afzonderlijk. Normaal gesproken, bij het oogsten van beide achterste ledematen, kan een enkele wild-type muis opbrengst ongeveer 150.000 myogene progenitor cellen of 100.000 adipogenic progenitor cellen, met de levensvatbaarheid boven de 95%, zoals beoordeeld door reanalyzing gesorteerd cellen door FACS aan het einde van de procedure (zie figuur 1 ) Definitie van myogene en adipogenic voorouders gebaseerd op oppervlakte vlekken <table border="1"><tbody><tr><td> Antilichaam / beits </td><td> Myogene progenitor (MP) </td><td> Adipogenic progenitor (AP) </td></tr><tr><td> Hoechst </td><td> + </td><td> + </td></tr><tr><td> PI </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> CD31-FITC </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> CD45-FITC </td><td>- </td><td> - </td></tr><tr><td> Sca1-PECY7 </td><td> - </td><td> + </td></tr><tr><td> α-7 APC </td><td> + </td><td> - </td></tr></tbody></table></li></ol> 4. Transplantatie: <ol start="28"><li> Centrifuge gesorteerde cellen @ 1500 tpm gedurende 5 minuten, het supernatant en overdracht cellen te verwijderen om geautoclaveerd Eppendorf buisjes (1,5 ml), spoel cellen met 500 pi van steriele PBS (serum gratis!), Centrifugeer @ 3000rpm gedurende 5 minuten. Behoud van alle reagentia in steriele omstandigheden en het werken in een weefselkweek kap, opnieuw in suspensie myogene voorouders in PBS, of adipogenic stamvader in Matrigel (BD cat # 354234) bij ongeveer 10 6 cellen / ml. </li><li> Transplant myogene voorouders of adipogenic voorlopercellen aan ontvanger muizen. <ol><li> Verdoof de muis met isoflouran op basis van uw instelling beleid. </li><li> Scheer het haar rond de injectie regio, dan steriliseren de huid door te wrijven met 70% ethanol </li><li> Injecteer 20μL van myogene voorouders of adipogenic voorouders (= 20K-cellen) met behulp van een 3 / 10 CC insuline spuit (BD cat # 309300). </li></ol></li><li> Na een juiste tijd (drie weken werkt goed, maar myofibers uitdrukken donor-afgeleide transgene markers zijn meestal binnen een week na transplantatie), verdoven de ontvanger muizen uit stap 29 door intraperitoneale injectie van 400 pi Avertin (Sigma Cat # T04840-2, 25 mg / ml), vervolgens transcardially perfuseren met 50ml PBS (bevat 10 uM van EDTA), gevolgd door 15 ml van 4% PFA. Verzamel doelweefsel, post-fix met 4% PFA 's nachts indien nodig, dan' s nachts naar 20% sucrose. Insluiten in oktober, bevriezen en cryosection. </li></ol> 5. Representatieve resultaten: Wanneer MP worden getransplanteerd in muizen skeletspieren, ze gemakkelijk zekering met reeds bestaande myofibers. Daarom elke genetische label aanwezig is in de donor cellen zullen worden gemakkelijk te detecteren in de vezels die ze ontvangen. Figuur 2 toont een voorbeeld waarbij de getransplanteerde cellen uitgedrukt menselijke alkaline phostphatase, onthulde histochemisch. Wanneer AP worden getransplanteerd het resultaat is sterk afhankelijk van de omgeving van de transplantatie site: wanneer getransplanteerde subcutaan deze cellen ontstaan ​​geven aan de adipocyten en myofibroblasten (zie figuur 2). In veel andere sites, waaronder de spieren, zij niet overleven tenzij vervetting is veroorzaakt 3. <img src="/files/ftp_upload/2476/2476fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Sorteren strategie voor de isolatie van voorlopercellen populaties van skeletspieren (A) Sorteren strategie:. Leefbare cellen werden geïdentificeerd op basis van forward scatter en zijwaartse verstrooiing. Hoechst kleuring werd gebruikt om anuclear puin en propidiumjodide (PI) kleuring uit te sluiten om de dode cellen te sluiten. Hematopoietische (CD45) en endotheel (CD31) cellen werden uitgesloten van de sortering poorten. De α7 + Hoechst + PI - CD45 - CD31 - scal - deelverzameling bevat alle myogene voorlopers (MP). De schaalbare + Hoechst + PI - CD45 - CD31 - α7 - populatie bevat adipogenic voorlopers (AP). (B) Fluorescentie-minus-een (FMO) isotype controles bevestigen de specificiteit van de vlek. (C) Zuiverheid controles van de MP en AP subsets na sorteren. <img src="/files/ftp_upload/2476/2476fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Representatieve resultaten volgende MP en AP transplantatie. AP werden subcutaan getransplanteerd (bovenste paneel) en MP intramusculair (onderste paneel). In beide gevallen, donor cellen zijn afkomstig uit een muis te drukken transgene menselijke alkalische fosfatase, geïdentificeerd door de bruine vlekken.

<ol><li>Buckingham, M., Montarras, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle stem cells.</a> Curr Opin Genet Dev. 18, 330-336 (2008).</li>
<li>Relaix, F., Marcelle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Muscle stem cells.</a> Curr Opin Cell Biol. 21, 748-753 (2009).</li>
<li>Joe, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+injury+activates+resident+fibro%2Fadipogenic+progenitors+that+facilitate+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis.</a> Nat Cell Biol. 12, 153-163 (2010).</li>
<li>Natarajan, A., Lemos, D. R., Rossi, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibro%2Fadipogenic+progenitors%3A+A+double-edged+sword+in+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Fibro/adipogenic progenitors: A double-edged sword in skeletal muscle regeneration.</a> Cell Cycle. 9, (2010).</li>
<li>Sherwood, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+adult+mouse+myogenic+progenitors%3A+functional+heterogeneity+of+cells+within+and+engrafting+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Isolation of adult mouse myogenic progenitors: functional heterogeneity of cells within and engrafting skeletal muscle.</a> Cell. 119, 543-554 (2004).</li>
<li>Sacco, A., Doyonnas, R., Kraft, P., Vitorovic, S., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-renewal+and+expansion+of+single+transplanted+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-renewal and expansion of single transplanted muscle stem cells.</a> Nature. , (2008).</li>
<li>Montarras, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+isolation+of+satellite+cells+for+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration.</a> Science. 309, 2064-2067 (2005).</li>
</ol>

Het doel van dit protocol is om te staken een redelijke balans tussen de hoge opbrengsten en een hoge levensvatbaarheid van het gezuiverde cellen. De meest kritische stap om ervoor te zorgen dat de gezonde cellen worden teruggewonnen is, voorspelbaar, de enzymatische dissociatie van de start weefsel. De behandeling van het weefsel moet worden in het bijzonder zacht, dat is moeilijk aan te tonen of zelfs waarderen in een audiovisuele formaat. Een andere belangrijke factor is de lengte van de procedure. Hoe langer het duurt om van de donor naar de ontvanger dier, hoe lager de levensvatbaarheid en dus de implantatie efficiëntie. Moet er vragen over de levensvatbaarheid dat niet onmiddellijk wordt beantwoord door te kijken naar de frequentie van PI positieve gebeurtenis in het gezuiverde cellen monsters na sortering, stellen we voor dat een beperkte verdunning test om clonogenicity maatregel is 3 uitgevoerd. Typische soorten van onbeschadigde spieren routinematig opbrengst ongeveer 1 in 15-20 cellen die in staat na het begin van myogene of fibro / adipogenic kolonies in vitro. Terwijl in wezen 100% van de kolonies geïnitieerd vanuit Kamerleden bevatten gedifferentieerde myotubes, slechts ongeveer een derde van de kolonies verkregen uit FAPs bevatten adipocyten in aanvulling op gladde spieren actine positieve myofibroblasten.

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het serum </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th><th> Reacties </th></tr><tr><td> Collagenase II </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C-6885, </td><td> 500 u / ml </td></tr><tr><td> Collagenase D </td><td> Roche </td><td> 11088882001 </td><td> 1,5 u / ml </td></tr><tr><td> Verplaats II </td><td> Roche </td><td> 04942078001 </td><td> 2,4 u / ml </td></tr><tr><td> cel zeef </td><td> BD </td><td> 352340 </td><td> 40 urn </td></tr><tr><td> Buis met cel zeef </td><td> BD </td><td> 352235 </td><td> 40 urn </td></tr><tr><td> Hoechst33342 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B2261 </td><td> 2-5 ug / ml </td></tr><tr><td> CD31-FITC </td><td> Ebiosciences </td><td> 11-0311-85 </td><td> Kloon 390 </td></tr><tr><td> CD45-FITC </td><td> Huisgemaakte </td><td></td><td> Kloon I3 / 2 </td></tr><tr><td> Sca1-PECY7 </td><td> Ebiosciences </td><td> 25-5981-82 </td><td> Kloon D7 </td></tr><tr><td> α-7 integrine APC </td><td> Huisgemaakte </td><td> Informeer bij Rossi lab </td><td> R2F2 </td></tr></tbody></table>

zuivering van voorlopercellen uit skeletal muscle

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

Skeletspieren bevat meerdere stamvader populaties van verschillende embryonale oorsprong en ontwikkelingspotentieel. Myogene voorouders, meestal woonachtig in een &#39;satelliet cel positie &quot;tussen de myofiber plasmamembraan en de laminine-rijke kelder membraan dat ensheaths hij, zichzelf vernieuwen cellen die uitsluitend toegewijd aan de myogene afstamming 1,2. We hebben onlangs beschreef een tweede klasse van het schip verbonden voorouders die kunnen genereren myofibroblasten en witte adipocyten, die inspeelt op schade door efficiënt te voeren proliferatie en biedt ondersteuning aan trofische myogene cellen tijdens weefselregeneratie 3,4. Een van de meest betrouwbare testen aan de ontwikkelings-en regeneratief potentieel van een bepaalde celpopulatie vast te stellen is afhankelijk van hun isolement en transplantatie 5-7. Daartoe hebben we geoptimaliseerde protocollen voor hun zuivering door middel van flowcytometrie van enzymatisch gedissocieerd spier, die zullen we schetsen in dit artikel. De populaties verkregen met behulp van deze methode zal bevatten ofwel myogene of fibro / adipogenic kolonievormende cellen: geen andere soorten cellen in staat zijn uit te breiden in vitro of in vivo overleven levering. Echter, wanneer deze populaties onmiddellijk worden gebruikt na de soort voor moleculaire analyse (bijvoorbeeld qRT-PCR) moet men in gedachten houden dat de vers gesorteerd subsets kunnen andere verontreinigingen cellen die het vermogen van het vormen van kolonies of engrafting ontvangers gebrek bevatten.

Methode voor de enzymatische dissociatie, oppervlakte-etikettering en de zuivering door flowcytometrie van fibro / adipogenic en myogene voorlopercellen uit muizen skeletspieren.

Zuivering van voorlopercellen uit Skeletal Muscle

Skeletspieren bevatten meerdere progenitorpopulaties met verschillende embryonale oorsprongen en ontwikkelingspotentieel. Myogene progenitoren, die gewoonlijk verblijven ...

Het algemene doel van het volgende experiment is het isoleren van levensvatbare myogene en adipogene progenitorcellen uit spiegelbeeldige skeletspieren. Dit wordt bereikt door eerst spierweefsel te oogsten van geëuthanaseerde muizen. Als tweede stap wordt het monster enzymatisch verteerd, waardoor het weefsel wordt gedissocieerd in enkelvoudige cellen.Vervolgens wordt fluorescence-activated cell sorting (FACS) gebruikt om de progenitorcellen te isoleren. Er worden resultaten verkregen die de levensvatbaarheid en differentiatie van de geïsoleerde cellen aantonen wanneer deze worden getransplanteerd in recipiënte muizen, op basis van histochemische kleuring voor de genetische marker, wat in dit voorbeeld het humane alkalische fosfatase is. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande technieken zoals prepl is dat de cellen direct uit het dier op verschillende tijdstippen kunnen worden geïsoleerd.Bijvoorbeeld, na het induceren van weefselschade, wat betekent dat er geen selectie plaatsvindt op de celpopulatie en de celpopulatie op moleculair niveau kan worden geanalyseerd om te kijken naar de verschillende stadia die de cellen doorlopen tijdens het proces van in vivo regeneratie. Deze techniek kan dus helpen bij het beantwoorden van een cruciale vraag in het veld van weefselregeneratie, en in het bijzonder: welke rol elk celtype speelt tijdens in vivo regeneratie en hoe interageren deze celtypen met elkaar om een gezond weefsel te reconstrueren? De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de therapie van ziekten zoals spierdistrofie.Aangezien de studie van deze progenitoren uiteindelijk regeneratieve strategieën voor dit type ziekten mogelijk kan maken. Bovendien strekken de implicaties van deze techniek zich uit tot een aantal andere weefsels, variërend van het hart tot vetweefsel, omdat de fibro-adipogene progenitoren in elk weefsel zijn aangetroffen dat we tot nu toe hebben getest. Over het algemeen zullen nieuwkomers bij deze techniek problemen ondervinden, omdat drastische dissociatietechnieken de celviabiliteit verminderen en te veel debris veroorzaken, wat vervolgens de zuivere scheiding van de cellen in een later stadium zal hinderen.We kregen voor het eerst het idee voor deze methode toen we besloten flowcytometrie, dat gewoonlijk wordt gebruikt voor APOE-cellen, toe te passen op de studie van stamcellen in solide weefsels. Een visuele demonstratie van deze techniek is belangrijk, aangezien de stappen voor weefseldissociatie moeilijk aan te leren zijn omdat ze zeer lastig correct te beschrijven zijn. De demonstratie van deze techniek zal vandaag worden gegeven door Linky, een onderzoeksassistent in mijn laboratorium die de techniek als eerste heeft ontwikkeld en geoptimaliseerd. Voor deze procedure zijn ten minste twee muizen nodig.Eén muis wordt gebruikt voor de cellen om de nodige enkelkleur- en antilichaam-isotypecontroles te verkrijgen, en de andere muis dient als monster voor de sortering. Begin met muizen tussen de zeven en 12 weken oud die eerder zijn geëuthanaseerd in een steriele laboratoriumzuil. Plaats de geëuthanaseerde muis met de buik naar boven op een steriel papieren handdoekje en spuit de vacht grondig in met 70% ethanol om contaminatie te voorkomen, terwijl u in de ene hand een pincet en in de andere hand een scherpe schaar houdt.Til de huid in de buikregio op en maak een kleine longitudinale incisie. Pak de huid aan weerszijden van de incisie vast en pel de huid terug om de spieren van het achterbeen volledig bloot te leggen. Exciteer vervolgens het spierweefsel door de gesloten schaar onder de spier en boven het tibia in te brengen en de schaar vervolgens te openen.De achterzijde van de bladen zal de scheiding van de spier van de tibia voorzichtig forceren. Herhaal dit voor beide zijden van de tibia en plaats het weefsel in een 60 millimeter Petrischaal. Exciteer nu op dezelfde wijze het spierweefsel van het femur en voeg het weefsel toe aan de Petrischaal.Herhaal dit voor elke muis met één petrischaal per muis. Dissocieer vervolgens het weefsel tot enkelvoudige cellen. Voeg twee milliliter of 1000 units collagenase en 20 microliters van een 250 millimolar calciumchloride-stamoplossing toe aan elke petrischaal met spierweefsel.Werk vervolgens snel en zorgvuldig. Gebruik twee grijze pincetten, één gekarteld en één met twee tanden, om het weefsel in stukjes van één kubieke millimeter te scheuren. Verwijder en gooi zoveel mogelijk niet-spierweefsel weg.Dek de petrischalen af en incubeer deze gedurende 30 minuten bij 37 °C. Haal de schalen na de incubatie uit de incubator en plaats ze terug in de steriele laminaire flowkast. Verwijder de zuiger uit een spuit van 3 mL en gebruik deze om het weefsel te pletten.Gebruik één zuiger per plaat om kruiscontaminatie te voorkomen. Voeg ongeveer vijf milliliter koud steriel PBS toe aan elke Petrischaal en overdraag de inhoud van de schaal naar een conische buis van 50 milliliter. Spoel met nog eens vijf milliliter PBS om al het weefsel terug te winnen en voeg dit toe aan de conische buis.Was en centrifugeer de monsters drie keer volgens het protocol. Voeg vervolgens één milliliter van een oplossing bestaande uit collagenase D dys space twee en calciumchloride toe aan elke buis en incubeer gedurende één uur bij 37 °C onder rotatie. Voeg na de incubatie vijf milliliter koude steriele PBS toe aan de buizen, vortex de buizen kort en tritureer meerdere keren om klonten te dissociëren.Vul de buizen met PBS, meng goed en plaats deze op ijs. Om eventuele overgebleven grote stukken weefsel te verwijderen, plaatst u een cellstrainer van 40 micron over een conische buis van 50 milliliter op ijs en filtert u de celsuspensie. Verdeel het filtraat gelijkmatig over drie conische buizen van 50 milliliter gevuld met koud, steriel PBS en centrifugeer gedurende vijf minuten bij 1600 RPM bij acht graden Celsius. Verwijder na centrifugatie voorzichtig het supernatant en plaats de cellen op ijs voor kleuring en sortering van myogene en adipogene progenitorcellen.Stel eerst de zes mengcontroles voor enkelkleurige kleuring op volgens het bijbehorende schriftelijke protocol. Deze controles omvatten geen kleuring, hulk-kleuring, propidiumjodide, CD 31- en CD 45 FSE-gelabelde antilichamen, SC one P size zeven-gelabeld antilichaam en alpha zeven A PC-gelabeld antilichaam. Stel vervolgens de drie kleurmengsels voor antilichaam-isotypecontroles op volgens het schriftelijke protocol.Zodra de kleuringsmengsels zijn bereid, labelt u negen Eppendorf-buisjes van 1,5 milliliter voor de enkelkleur- en isotypecontrolemonsters. Resuspendeer en combineer de cellen uit de drie conische buizen in een totaalvolume van 1 milliliter FACS-buffer. Verdeel vervolgens 100 µL van de cellen over elk gelabeld controlebuisje en pipetteer, afhankelijk van de antilichaamconcentratie, tussen de 5 en 10 µL van de kleuringsmengsels in de overeenkomstige controlebuisjes.Resuspendeer de cellen van de proefmuis in 200 µL FACS-buffer en breng deze over in een van de conische buizen van 50 mL. Voeg vervolgens 800 µL van de antilichaamcocktail toe. Meng elke controlebuis en monsterbuis.Incubeer ze vervolgens gedurende één uur op ijs. Was na de incubatie de cellen door één milliliter FACS-buffer aan elk van de negen controlebuisjes en ongeveer 20 milliliter FACS-buffer aan het monsterbuisje toe te voegen. Centrifugeer de controlebuisjes gedurende vijf minuten bij 3000 RPM.Centrifugeer de conische monsterbuis gedurende vijf minuten bij 1600 RPM. Aspireer vervolgens het supernatant na centrifugatie en gooi dit weg. Resuspendeer de controlecellen in elke eend orph-buis met 1 ml fax-buffer en resuspendeer de monstercellen in 4 ml fax-buffer.Voeg propidiumjodide toe aan de monstercellen en isotypecontroles, evenals aan de pi-enkelkleurcontrolebuis. Pipetteer de cellen via de dop met cellenzeef in fax-buisjes om resterende klonters te verwijderen die de cytometer kunnen beïnvloeden.Stel het fax-instrument in met één kleur en isotypecontroles. Sorteer de monstercellen volgens het bijbehorende schriftelijke protocol en verzamel elke populatie afzonderlijk in een opvangbuisje van 3,5 milliliter. Levensvatbare myogenic progenitors zijn de populatie die hulked en alpha seven a PC positief is en PI CD 31 FE CD 45 FE en ska.Adipogene progenitoren zijn PDGFR$\alpha$ grootte zeven negatief levensvatbaar, terwijl ze PDGFR$\alpha$ grootte zeven positief, CD31 negatief, CD45 negatief en $\alpha$7$\beta$1-integrine negatief zijn. Eén wild-type muis kan ongeveer 1 $\times$ 10⁵ adipogene progenitoren en 1,5 tot 2 $\times$ 10⁵ myogene progenitoren opleveren, met een levensvatbaarheid van meer dan 95%.Om cellen voor te bereiden op transplantatie in gastmuizen, worden de cellen gewassen. Centrifugeer eerst de gedestorteerde cellen bij 1500 RPM gedurende vijf minuten. Verwijder het supernatant, resuspendeer de cellen in 500 microliters PBS en breng ze over naar einor-buisjes.Centrifugeer de buizen bij 3000 RPM gedurende vijf minuten en verwijder het supernatant. Resuspendeer vervolgens de myogene progenitorcellen in PBS of de adipogene progenitorcellen in Matrigel op een concentratie van ongeveer 10⁶ cellen per milliliter. Nadat de geanesthetiseerde gastmuizen voor elk donortype cel volgens het geschreven protocol zijn voorbereid, gebruikt u een insulinespuit van 0,3 cc om 20 µL van ongeveer 20.000 myogene of adipogene progenitorcellen te injecteren.Geef de getransplanteerde cellen voldoende tijd om te differentiëren, gewoonlijk ongeveer drie weken. Isoleer vervolgens het doelweefsel en bereid dit voor op cryosectie zoals beschreven in het protocol in deze figuur. De sorteerstrategie wordt gedemonstreerd om de adipogene en myogene progenitoren te isoleren; levensvatbare cellen werden geïdentificeerd op basis van forward scatter en side scatter. Hoeckle-kleuring werd gebruikt om nucleair debris uit te sluiten en propidiumjodide- of PI-kleuring werd gebruikt om dode cellen uit te sluiten. Hematopoëtische en endotheliale cellen, respectievelijk CD 45- en CD 31-cellen, werden vervolgens uitgesloten van de sorteerpoorten. Ten slotte wordt de subset geselecteerd die alpha zeven positief is.SKA1-negatief bevat alle myogene progenitoren en de populatie die alfa zeven-negatief is. SKA1-positief bevat alle adipogene progenitoren; fluorescentie minus één isotype-controles bevestigen de specificiteit van de kleuring. Daarnaast zijn zuiverheidscontroles uitgevoerd op de adipogene en myogene subsets.Na sortering in dit representatieve voorbeeld kunnen adipogene progenitor-donorcellen die transgene, humane alkalische fosfatase tot expressie brengen en subcutaan zijn geïnjecteerd, in het gastweefsel worden geïdentificeerd via histochemie, zoals aangegeven door de bruine kleuring. Myogene progenitor-donorcellen die transgene humane alkalische fosfatase tot expressie brachten en intramusculair werden geïnjecteerd, werden in deze weefselcoupe geïdentificeerd, zoals weergegeven in het bruin.Gebruik van histochemie. Zodra men deze techniek beheerst, kan deze in vijf uur worden uitgevoerd, mits correct uitgevoerd. Indien er meer monsters worden verwerkt, zal de benodigde tijd toenemen. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om snel en voorzichtig te werken.Vermijd daarom het gelijktijdig verwerken van te veel monsters. Een verlenging van de verwerkingstijd zal de celvariabiliteit na deze procedure aanzienlijk verminderen. Andere methoden, zoals colono SC OG expressieanalyse via kwantitatieve R-T-P-C-R, kunnen eveneens worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals: hoe reageren deze pro-cellen in vivo op schade na hun ontwikkeling?Deze techniek maakte de weg vrij voor andere onderzoekers op het gebied van weefselregeneratie om de interactie tussen de progenitorcellen in beschadigd weefsel te onderzoeken. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe deze weefsels zonder schade kunnen worden gedissocieerd. De progenitorcellen worden geïdentificeerd op basis van hun specifieke markers en hun ontwikkelingspotentieel in vivo wordt geanalyseerd.Bedankt voor het kijken. Veel succes met uw experiment.

purification-of-progenitors-from-skeletal-muscle

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

De isolatie en cultuur van een zuivere populatie van rustende cellen satelliet, een spier stamcelpopulatie, is essentieel voor het begrip van spier stamcel biologie en regeneratie, en stamceltransplantatie voor therapieën spierdystrofie en andere degeneratieve ziekten.

Isolatie, Cultuur en Transplantatie van Muscle satelliet-cellen

Bloedvaten in de menselijke skeletspier haven diverse multi-lineage voorloper populaties die ideaal is voor regeneratieve toepassingen zijn. Deze isolatie methode maakt gelijktijdige zuivering van drie multipotente precursor celpopulaties respectievelijk uit drie structurele lagen van de bloedvaten: myogene endotheelcellen van de intima, pericytes van media en adventitia cellen van adventitia.

Isolatie van bloedvatgeassocieerde afgeleid Multipotente Voorlopers van Human Skeletal Muscle

Hier beschrijven we een protocol gebaseerd op epigenetische herprogrammering van menselijke embryonale stamcellen (hESC 's) in de richting van het genereren van een homogene populatie van de skeletspieren voorlopers die onder permissieve cultuur omstandigheden vormen driedimensionale clusters van samentrekkende spiervezels (myospheres), die biologische kenmerken van de menselijke recapituleren skeletspieren.

Generatie Myospheres Van hESCs door Epigenetische herprogrammeren

In vitro cultuur systemen onmisbaar voor ons begrip van gewervelde myogenese bewezen. Er moet echter nog veel te leren over nonmammalian skeletspieren ontwikkeling en groei, met name in de basale taxa. Een efficiënte en robuuste protocol voor isolatie van de volwassen stamcellen van dit weefsel, de myogene voorlopercellen (MTR), en met behoud van hun zelf-vernieuwing, proliferatie en differentiatie in een primaire kweek instelling maakt de identificatie van geconserveerde en afwijkende...

Voorbereiding van de Primaire Myogene Precursor Cell / myoblast Culturen van Basal gewervelde Geslachten

De belangrijkste aderente celtypen die zijn afgeleid van menselijk spierweefsel zijn myogene cellen en fibroblasten. Hier worden celpopulaties verrijkt met behulp van magnetisch geactiveerde celsortering op basis van het CD56-antigeen. Daaropvolgende immunolabeling met specifieke antilichamen en het gebruik van beeldanalysetechnieken maakt kwantificering van cytoplasmatische en nucleaire kenmerken in individuele cellen mogelijk.

Isolatie en Kwantitatieve Immunocytochemische karakterisering van primaire Myogene cellen en fibroblasten van Human Skeletal Muscle

Dit protocol beschrijft een robuuste, reproduceerbare en eenvoudige methode van isolatie en de cultuur van myoblast stamcellen uit de skeletspieren van volwassen en ouderen. De spieren die hier gebruikt behoren voet- en beenspieren. Deze aanpak maakt het isoleren van een verrijkte populatie van primaire myoblasten voor functionele studies.

Voorbereiding en Cultuur van Myogene voorloper cellen / Primary myoblasten uit Skeletal Muscle van Adult en Aged Humans

Hier beschrijven we een methodologie om een ​​pure bevolking van menselijke myoblasten te verkrijgen uit volwassen spierweefsel. Deze cellen worden gebruikt om in vitro skeletspierdifferentiatie te bestuderen en in het bijzonder om eiwitten die betrokken zijn bij Ca 2+ -signalering te bestuderen.

Isolatie van Menselijke Myoblasten, Beoordeling van Myogene Differentiatie, en Opslag Met Calcium Ingangsmeting

We presenteren technieken voor het isoleren, kweken, karakteriseren en differentiëren van menselijke primaire spier voorlopercellen (Hmpc's) verkregen uit skeletspieren biopsie weefsel.  hmpc's verkregen en gekenmerkt door middel van deze methoden kunnen worden gebruikt om vervolgens onderzoek vragen met betrekking tot menselijke myogenese en skeletspier regeneratie aan te pakken.

Isolatie, cultuur, karakterisering, en differentiatie van menselijke spier voorlopercellen van de skeletspier biopsie procedure

De precieze identificatie van fibro-adipogene voorlopercellen (FAPs) en spierstamcellen (MuSC's) is van cruciaal belang voor het bestuderen van hun biologische functie in fysiologische en pathologische omstandigheden. Dit protocol biedt richtlijnen voor de isolatie, zuivering en cultuur van FAPs en MuSC's van volwassen muisspieren.

FACS-isolatie en kweek van fibro-adipogene voorlopers en spierstamcellen van onverstoorbare en gewonde muizenskeletspieren

Dit protocol beschrijft de isolatie van spierstamcellen en fibro-adipogene voorlopers uit individuele skeletspieren bij muizen. Het protocol omvat enkelvoudige spierdissectie, stamcelisolatie door fluorescentie-geactiveerde celsortering, zuiverheidsbeoordeling door immunofluorescentiekleuring en kwantitatieve meting van S-fase-invoer door 5-ethynyl-2'-deoxyuridine-incorporatietest.

Isolatie van rustige stamcelpopulaties van individuele skeletspieren

Dit protocol biedt een gestandaardiseerde methode voor het isoleren en verrijken van primaire myoblasten uit volwassen en neonatale muisskeletspieren via weefseldissociatie, sequentiële filtratie, preplating en gedefinieerde kweekcondities, waardoor de opbouw en het onderhoud van satellietcel-afgeleide myoblastkweken mogelijk is voor latere experimentele toepassingen.

Isolatie van skeletspiersatellietcellen voor in vitro myogenesestudies

Leer hoe je levensvatbare myogene en adipogene voorlopercellen isoleert uit murine skeletspier via enzymatische dissociatie en FACS. Deze methode analyseert celpopulaties tijdens weefselregeneratie.

Zuivering van voorlopercellen uit Skeletal Muscle

Meer video's verkennen