RNAi Interferentie door dsRNA Injectie in Drosophila Embryo's

Het algemene doel van deze procedure is om de endogene genexpressie te reduceren door dubbelstrengs RNA in drosophila-embryo's te injecteren, om zo genen te identificeren die noodzakelijk zijn voor de orgaanontwikkeling. Dit wordt bereikt door eerst embryo's te verzamelen en deze in een rechte lijn op te stellen. Vervolgens worden naalden voorbereid en gebruikt om dubbelstrengs RNA in de embryo's te injecteren.

Ten slotte worden de embryo's in een vochtige kamer geplaatst om zich te ontwikkelen. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die defecten in de fusie van de tracheale vertakkingen bij drosophila aantonen via antilichaamskleuring van embryo's in een laat stadium, of door larven te observeren onder een lichtmicroscoop. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals forward genetische screening om genen te identificeren die nodig zijn voor orgaanontwikkeling, is dat dit een relatief eenvoudige en snelle reverse genetische benadering is om genfuncties te analyseren voordat er een mutant beschikbaar is voor dat gen.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van de ontwikkelingsbiologie, zoals de identificatie van kritieke genen die vereist zijn voor de ontwikkeling van het D-tracheaalsysteem. Dit is een uitstekend model om de morfogenese van zoogdierorganen te bestuderen, zoals de luchtwegen van vertebraten, het bloedsomloopstelsel, nierbuisjes en exploratoir epitheel. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, omdat het tijd kost om technieken onder de knie te krijgen zoals het uitlijnen van embryo's, het afbreken van naalden en het injecteren van stranded RNA in de embryo's.

Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien de stappen met betrekking tot de hoeveelheid dubbelstrengs RNA die wordt geïnjecteerd per embryo kunnen variëren, en een schriftelijke beschrijving van hoe syncytiale blastoderm-embryo's eruitzien lastig kan zijn. Deze stappen zijn moeilijk aan te leren omdat het injecteren van geschikte hoeveelheden dubbelstrengs RNA in syncytiale blastoderm-embryo's een cruciale stap is om de expressie van endogene genen effectief te onderdrukken.

Begin met het inrichten van kooien bij 25 °C met twee tot vier dagen oude W 1 1 1 8 vliegen; verschanst de druivensapplaten elk uur gedurende de dag om de eierverzameling over een periode van één tot twee dagen te synchroniseren. Voorafgaand aan de verzameling: verzamel syncytiale of blastoderm-embryo's gedurende één uur bij 25 °C op een rechthoekig stuk druivensapagar en snijd vervolgens met een scheermesje voorzichtig een lijn in het midden van de agar.

Gebruik een metalen probe om embryo's van de plaat met druivensap over te brengen naar het stuk druivensap-agar. Plaats ongeveer 50 embryo's in een rechte lijn, waarbij de langere assen van de embryo's onder een hoek van 45 graden ten opzichte van de lijn in het midden van de agar staan. Zorg ervoor dat alle embryo's in dezelfde richting wijzen, met de posterieure uiteinden van de lijn afgewend.

Knip een rechthoekig stukje dubbelzijdige plakband af en plak dit op een dekglas van 18 bij 18 millimeter. Pak de embryo's op met behulp van de tape op het dekglas. Plaats het dekglas op een objectglas.

Druk de embryo's lichtjes aan op de dubbelzijdige plakband en laat de embryo's ongeveer 10 minuten aan de lucht drogen. Bedek de embryo's met een dunne laag 700 halo carbonolie. Wacht ongeveer 10 minuten tot de embryo's onder de microscoop helder zijn.

Naalden voor micro-injectie worden geprepareerd door glazen capillaire buizen uit te trekken. Wij maken gebruik van een needle puller van World Precision Instruments met de volgende programmaparamenters: Heat one, delay four, back.

Vul de naald met 2 µL dubbelstrengs RNA met behulp van een Einor P 20 pipet met einor micro loader tips. Bereid een objectglas voor met een schoon dekglas erop en plak deze aan elkaar vast. Plaats de gevulde naald tegen de rand van het dekglas om een scherpe punt te creëren.

Dubbelstrengs RNA lekt uit de naaldpunt. Terwijl het voetpedaal van de picopomp wordt ingedrukt, bereidt u een objectglas voor met een druppel olie in het midden. Steek de naald in de oliedruppel.

Stel de instelling van de picopomp zo in dat er 100 tot 200 picoliter dubbelstrengs RNA wordt uitgestoten wanneer het voetpedaal wordt ingedrukt. Dubbelstrengs RNA is zichtbaar als een kleine druppelpositie.

Druk met de naaldpunt aan het posterieure deel van het eerste embryo op het voetpedaal van de picopomp. Dubbelstrengs RNA zal verschijnen als een kleine druppel op de injectieplaats.

Voltooi het injecteren van dubbelstrengs RNA in de embryo's op het objectglas. Vernietig alle embryo's die geen blastoderm hebben. Plaats het dekglas in een afgedekte vochtige kamer, zoals een plastic petrischaal bij 18 °C, totdat de embryo's zijn ontwikkeld tot het gewenste embryonale of larvale stadium.

Gebruik voor embryo's die het gewenste embryonale stadium hebben bereikt een probe om de embryo's van de dubbelzijdige tape te verwijderen en duw ze naar de rand van het dekglas. Spoel de embryo's met heptaan in een opvangbuisje met een nylon gaas aan de bodem. Was de embryo's drie keer met PBT, laat ze vijf minuten weken in 50% bleekmiddel en was de embryo's vervolgens opnieuw drie keer met PBT.

Verplaats de embryo's met een pipet van het opvangbuisje naar een stuk nylon gaas en dompel het stuk nylon gaas in de fixeeroplossing. Fixeer de embryo's gedurende 30 minuten. Verwijder de onderste laag van de fixeeroplossing.

Fixeer ze vervolgens met methanol; de embryo's worden overgebracht naar een Eppendorf-buis en immunogekleurd met twee A 12- en diffusie-antilichamen volgens standaard antilichaamkleuringsprotocollen voor embryo's die zijn ontwikkeld tot het gewenste larvale stadium. Bereid een objectglas voor met een druppel halocarbon 700-olie in het midden en twee kleine dekglasjes aan weerszijden van de oliedruppel. Breng één larve over naar het objectglas en plaats vervolgens een dekglasje bovenop de oliedruppel.

Observeer de larven onder een lichtmicroscoop. Hier worden representatieve resultaten getoond van zowel de injectie van diffuus dubbelstrengs RNA als GFP dubbelstrengs RNA.

Embryo's geïnjecteerd met dubbelstrengs GFP-RNA vertonen normale tracheale fusie en het diffusie-eiwit is aanwezig in de fusiecellen. De pijlen wijzen naar laterale trunk-diffusie positieve fusiecellen en het asterisk geeft de locatie van de normale fusie aan.

Echter, embryo's waarin dubbelstrengs RNA is geïnjecteerd, vertonen een mislukte fusie van de vertakkingen en diffusie-eiwitten zijn niet aanwezig in de fusiecellen. De driehoek geeft de plaats aan van de mislukte vertakkingsfusie wanneer embryo's waarin dubbelstrengs RNA is geïnjecteerd zijn uitgegroeid tot het larvale stadium. De G-F-P-R-N AI-larven vertonen een normale fusie van de tracheale vertakkingen, aangegeven met een asterisk.

Aan de andere kant vertoonden de diffusion RN AI-larven een mislukte takfusie, aangegeven door driehoeken. Deze resultaten tonen het effect van knockdown van de endogene expressie van het diffusion-gen door injectie van dubbelstrengs RNA in drosophila-embryo's. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden alle enseal blaster-embryo's na hun ontwikkeling te doden.

Deze techniek maakte de weg vrij voor onderzoekers in het veld van de ontwikkelingsbiologie om de functie van nieuwe genen voor orgaanontwikkeling in drosophila te onderzoeken. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe endogene genen kunnen worden uitgeschakeld door dubbelstrengs RNA in drosophila-embryo's te injecteren.