Name: RNAi Interferentie door dsRNA Injectie in Drosophila Embryos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-11T11:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Leer RNAi door dsRNA-injectie in Drosophila-embryo's voor genfunctie-analyse in ontwikkelingsbiologie. Deze methode identificeert essentiële genen voor orgaanontwikkeling, met name voor tracheale ontwikkeling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs willen graag Stephen Crews bedanken voor dysfusion cDNA, Dys antilichaam en w 1118 vliegen.

1. Embryoteams <ol><li> Stel kooien bij 25 ° C met behulp van 2-4 dagen oud w 1118 flies.Grape sap platen worden elke uur tijdens de dag om het ei collectie te synchroniseren gedurende 1-2 dagen periode voor collectie </li><li> Verzamelen van embryo's voor 1 uur bij 25 ° C </li><li> Knip een rechthoekig stuk druivensap agar, licht gesneden in het midden met een scheermesje, laat een lijn in de agar </li><li> Gebruik een metalen sonde naar embryo transfer van druivensap plaat om jouw stuk druivensap agar, lijn ze in een rechte lijn met hoe langer de embryo-as van 45 graden ten opzichte van de lijn in het midden van de agar. Hier krijg je een rechte lijn van ongeveer 50 embryo's. Zorg ervoor dat alle embryo's wijzen in dezelfde richting, met posterior einde wijzen uit de buurt van de lijn. </li><li> Knip een rechthoekig stuk van dubbele plakband en plaats deze op een 18x18mm dekglas. </li><li> Pick-up embryo's met dubbele plakband op de cover slip </li><li> Plaats het deksel glijden naar een glasplaatje, droog het embryo in de lucht voor ongeveer 10 minuten. </li><li> Bedek de embryo met een dun laagje van 700 Halocarbon olie, nu is het klaar voor injectie. </li></ol> 2. Pulling Naald Maak micro-injectie naalden door te trekken glazen capillaire buizen. We maken gebruik van een naald trekker van World precisie-instrument (Model PUL-1). De naald trekker programma specificaties zijn: warmte: 1, 4 vertraging. 3. Het vullen van de Needles Back-load naalden met behulp van de Eppendorf pipet p20 uitgerust met Eppendorf Microloader tips, normaal belasting 1,5 tot 2 pi dsRNA 4. Breek de Needles <ol><li> Voor het breken van de naald, plaats een dekglaasje op een dia. </li><li> Maak een dia met een druppel olie in het midden van de dia </li><li> Zet de Picospritzer III picopump om de luchtdruk aan te passen </li><li> Breek de gevulde naald tegen de rand van een dekglas, het creëren van een scherpe punt. </li><li> Wanneer de tip is gebroken, stap op het voetpedaal van de Picospritzer III picopump, zullen sommige dsRNA uit lekken van de naald. </li><li> Haal de dia met de dekglaasje aan. </li><li> Steek de naald onder de olie druppel in het midden van de dia bereid daarvoor. </li><li> Pas de instelling op de Picospritzer III picopump tot 100-200pl dsRNA krijgt als je stap op de voet pedaal. dsRNA kan gezien worden als een kleine druppel. </li></ol> 5. Injectie <ol><li> Breng de naald aan het achterste deel van de eerste blastoderm embryo in dezelfde focal plane en injecteer het embryo uit het midden rond 30-50% ei lengte. </li><li> Nadat u stap op het voetpedaal van de Picospritzer III picopump, zal een kleine hoeveelheid dsRNA verschijnen als een kleine stip in de plaats van injectie. </li></ol> 6. Fenotypische analyse <ol><li> Na injectie, plaatst u de dia in een overdekte vochtige kamer (plastic petrischaal) bij 18 ° C tot de embryo's te ontwikkelen om de gewenste embryonale stadium. </li><li> Gebruik probe om embryo's te verwijderen uit de dubbelzijdige tape en ze te duwen naar de rand van het dekglas. Was de embryo's van de dia in een verzameling flacon met nylon gaas op de bodem met behulp van heptaan, was 3 keer met PBT. Dechorionate embryo's in 50% bleekwater gedurende 5 minuten, en was drie keer met PBT. Transfer embryo's uit de collectie flacon om een ​​stuk van nylon mesh, en dan dompel de nylon mesh in het fixeermiddel oplossing (5 ml heptaan, 4.5ml PBS, 0,5 ml 37% formaldehyde) om embryo's vrij te geven. Fix embryo's in de fixeermiddel oplossing voor 30min. Devitellinize embryo's met methanol, transfer embryo's een eppendorfbuisje, en immunostain de embryo's met behulp van standaard protocollen. </li><li> Embryo's kan ook de ontwikkeling van passende larvale stadium. </li><li> Bereid een dia met een daling van 700 Halocarbon olie in het midden </li><li> Overdracht een larven aan de dia, zet een dekglas op de top </li><li> Let op larven onder felle veld microscoop. </li></ol> 7. Representatieve resultaten: Een voorbeeld van dsRNA knock down dysfusion (dys) gen in Drosophlia embryo wordt getoond in Fig1. GFP-dsRNA geïnjecteerde embryo's worden de negatieve controle. Dys is een bHLH PAS transcriptiefactor, uitgedrukt in tracheale fusie cellen. GFP-dsRNA geïnjecteerde embryo's vertonen een normale tracheale fusion, en Dys eiwit is aanwezig in fusie-cellen (Figuur 1A). Aan de andere kant, dys-dsRNA geïnjecteerde embryo's tonen mislukt tak fusion, en Dys eiwitten zijn niet aanwezig in de fusie-cellen (Figuur 1B). Bij het dsRNA geïnjecteerd embryo's te ontwikkelen voor larvale stadium, de dys-dsRNA ingespoten larven toonde mislukt tak fusie (Fig.1D) in vergelijking met GFP-dsRNA geïnjecteerd negatieve controle (Figuur 1C). Deze resultaten toonden effectief naar beneden slaan van endogene dys genexpressie door dsRNA injectie in Drosophila embryo's <img src="/files/ftp_upload/2477/2477fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Verwijdering van dys functie door dys-RNAi onthult tracheale fusie defects. Blastoderm embryo's (w 1118) werden geïnjecteerd met ofwel GFP-dsRNA (negatieve controle) of dys-dsRNA en getest op tracheale defecten. (A) Stage 16 embryo geïnjecteerd met GFP-dsRNA en gekleurd met α-dys en MAB 2A12 die vlekken het tracheale lumen. Prominent getoond is de laterale romp, die is gesmolten. Pijlen wijzen naar laterale romp Dys-positieve fusion cellen. (B) Stage 16 embryo geïnjecteerd met dys-dsRNA en gekleurd met α-dys en MAB 2A12. Het embryo toonde een gebrek aan laterale romp fusie (het sterretje geeft de normale locatie van een laterale-stam fusie onder controle embryo's). Geen Dys-positieve cellen waargenomen, hetgeen aangeeft dat de dys-RNA effectief Dys eiwit afgeschaft. (C naar D) Tweede-instar larven met een GFP-dsRNA of dys-dsRNA werden onderzocht door helder-veld microscopie voor tracheale defecten. (C) Sites van fusie zijn aangegeven met een asterisk in de GFP-dsRNA ingespoten controle larven. (D) De laterale romp niet zekering in de dys-RNA geïnjecteerd larven, (*) geeft de normale locatie van een laterale romp fusie.

<ol><li>St Johnston, D., Nusslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+pattern+and+polarity+in+the+Drosophila+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The origin of pattern and polarity in the Drosophila embryo.</a> Cell. 68, 201-219 (1992).</li>
<li>Venken, K. J., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+technologies+for+gene+manipulation+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Emerging technologies for gene manipulation in Drosophila melanogaster.</a> Nat. Rev. Genet. 6, 167-178 (2005).</li>
<li>Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391, 806-811 (1998).</li>
<li>Kennerdell, J. R., Carthew, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+dsRNA-mediated+genetic+interference+to+demonstrate+that+frizzled+and+frizzled+2+act+in+the+wingless+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Use of dsRNA-mediated genetic interference to demonstrate that frizzled and frizzled 2 act in the wingless pathway.</a> Cell. 95, 1017-1026 (1998).</li>
<li>Misquitta, L., Paterson, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+disruption+of+gene+function+in+Drosophila+by+RNA+interference+%28RNA-i%29%3A+a+role+for+nautilus+in+embryonic+somatic+muscle+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Targeted disruption of gene function in Drosophila by RNA interference (RNA-i): a role for nautilus in embryonic somatic muscle formation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 1451-1456 (1999).</li>
<li>Horowitz, A., Simons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Branching morphogenesis.</a> Circ. Res. 103, 784-795 (2008).</li>
<li>Hogan, B. L., Kolodziej, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organogenesis%3A+molecular+mechanisms+of+tubulogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Organogenesis: molecular mechanisms of tubulogenesis.</a> Nat. Rev. Genet. 3, 513-523 (2002).</li>
<li>Ghabrial, A., Luschnig, S., Metzstein, M. M., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Branching+morphogenesis+of+the+Drosophila+tracheal+system%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Branching morphogenesis of the Drosophila tracheal system.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 19, 623-647 (2003).</li>
<li>Jiang, L., Crews, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysfusion+transcriptional+control+of+Drosophila+tracheal+migration%2C+adhesion%2C+and+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Dysfusion transcriptional control of Drosophila tracheal migration, adhesion, and fusion.</a> Mol. Cell. Biol. 26, 6547-6556 (2006).</li>
<li>Jiang, L., Crews, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+dysfusion+basic+helix-loop-helix+%28bHLH%29-PAS+gene+controls+tracheal+fusion+and+levels+of+the+trachealess+bHLH-PAS+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">The Drosophila dysfusion basic helix-loop-helix (bHLH)-PAS gene controls tracheal fusion and levels of the trachealess bHLH-PAS protein.</a> Mol. Cell. Biol. 23, 5625-5637 (2003).</li>
</ol>

De dsRNA injectiemethode presenteren maakt hier een zeer gevoelige en snelle analyse van gen-functie in Drosophila tracheale ontwikkeling. Deze methode kan mogelijk worden toegepast op genfunctie te analyseren voor de andere weefsels en organen ontwikkeling.

<table><tbody><tr><td>Halogeenkoolstofolie 700</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8898</td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer III picopomp</td><td>Parker Hannifin Corporation</td><td>051-0500-900</td><td></td></tr><tr><td>Micropipetten</td><td>Fisher Scientific</td><td>21170M</td><td></td></tr><tr><td>Microloaders</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td></td></tr></tbody></table>

rnai interferentie door dsrna injectie in drosophila embryo&#39;s

RNAi Interference by dsRNA Injection into Drosophila Embryos

Genetische screening is een van de meest krachtige methodes beschikbaar zijn voor het verkrijgen van inzicht in complexe biologische proces 1. In de loop der jaren veel verbeteringen en tools voor genetische manipulatie zijn beschikbaar in Drosophila 2. Al snel na de eerste ontdekking door Frie en Mello 3 dat dubbelstrengs RNA kan worden gebruikt om knockdown de activiteit van individuele genen in Caenorhabditis elegans, RNA interferentie (RNAi) is aangetoond dat een krachtige reverse genetische benadering van genfuncties te analyseren in Drosophila orgel ontwikkeling 4, 5. Veel organen, zoals long-, nier-, lever-en vaatstelsel, zijn samengesteld uit vertakte netwerken die tubulaire transport vitale vloeistoffen of gassen 6, 7. De analyse van Drosophila tracheale vorming biedt een uitstekend model systeem om de morfogenese van andere buisvormige organen acht te bestuderen. De Berkeley Drosophila genoom project heeft geopenbaard honderden genen die worden uitgedrukt in de tracheale systeem. De studie van de moleculaire en cellulaire mechanismen van de buis vorming, de uitdaging is om de rol van deze genen te begrijpen in tracheale ontwikkeling. Hier beschreven we een gedetailleerde methode voor het dsRNA injectie in Drosophila embryo tot knockdown individuele genexpressie. Wij hebben met succes neergehaald endogene dysfusion (dys) genexpressie door dsRNA injectie. Dys is een bHLH-PAS eiwit, uitgedrukt in tracheale fusion-cellen, en het is nodig voor tracheale tak fusion 9, 10. dys-RNAi volledig geëlimineerd dys expressie en resulteerde in tracheale fusie defect. Deze relatief eenvoudige methode is een hulpmiddel om genen nodig voor Uw voor tissure en orgel ontwikkeling in Drosophila te identificeren.

RNA-interferentie is bewezen zeer effectief te genfunctie te analyseren in<em&gt; Drosophila</em&gt; Tracheale ontwikkeling. Een gedetailleerd protocol dat wordt gebruikt door Jiang lab naar dsRNA injecteren in vliegen embryo&#39;s knockdown genexpressie wordt geïllustreerd. Deze techniek heeft het potentieel voor het screenen van genen die nodig zijn voor weefsels en organen ontwikkeling in<em&gt; Drosophila</em&gt;.

RNAi Interferentie door dsRNA Injectie in Drosophila Embryo&#39;s

Genetische screening is een van de krachtigste beschikbare methoden om inzicht te krijgen in complexe biologische processen 1. In de loop der jaren zijn er veel verbeteringen ...

Het algemene doel van deze procedure is om de endogene genexpressie te reduceren door dubbelstrengs RNA in drosophila-embryo's te injecteren, om zo genen te identificeren die noodzakelijk zijn voor de orgaanontwikkeling. Dit wordt bereikt door eerst embryo's te verzamelen en deze in een rechte lijn op te stellen. Vervolgens worden naalden voorbereid en gebruikt om dubbelstrengs RNA in de embryo's te injecteren.Ten slotte worden de embryo's in een vochtige kamer geplaatst om zich te ontwikkelen. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die defecten in de fusie van de tracheale vertakkingen bij drosophila aantonen via antilichaamskleuring van embryo's in een laat stadium, of door larven te observeren onder een lichtmicroscoop. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals forward genetische screening om genen te identificeren die nodig zijn voor orgaanontwikkeling, is dat dit een relatief eenvoudige en snelle reverse genetische benadering is om genfuncties te analyseren voordat er een mutant beschikbaar is voor dat gen.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van de ontwikkelingsbiologie, zoals de ide

rnai-interference-by-dsrna-injection-into-drosophila-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We beschrijven een gevoelig methode om postembryonic regulatoren van eiwit expressie en lokalisatie...

RNAi screening Postembryonic fenotypes Leg in C. elegans</em

Het doel van deze publicatie is om te visualiseren en te discussiëren over de operatieve stappen van een Enhanced Northern Blot protocol op RNA geëxtraheerd uit Drosophila melanogaster embryo's, cellen en weefsels. Dit protocol is bijzonder bruikbaar voor de efficiënte detectie van kleine RNA species.

Verbeterde Northern Blot detectie van kleine RNA Species in Drosophila melanogaster

RNA-interferentie (RNAi) gebaseerde gen knockdown technieken vormen de kern van Tribolium onderzoek. Hier geven we een overzicht van onze larvale RNAi techniek Tribolium castaneum. Larvale RNAi is een eenvoudige, maar krachtige techniek die een snelle toegang tot verlies-van-functie fenotypes biedt, waardoor onderzoekers om de functie van genen te bestuderen in verschillende contexten.

Larvale RNA interferentie in de Rode Bloem Kever, Tribolium castaneum

RNA-interferentie (RNAi) is een uiterst waardevol hulpmiddel voor het onthullen van genfunctie. De mogelijkheid om genen te targeten met behulp van RNAi tijdens pre-adulte stadia is echter beperkt in de belangrijkste menselijke malariavector Anopheles gambiae. We beschrijven een RNAi-protocol om genfunctie te verminderen via directe injectie tijdens de popontwikkeling.

RNAi Trigger delivery in<em&gt; Anopheles gambiae</em&gt; Poppen

Hier presenteren we protocollen voor het kweken van een intermediair-kiem kever, Dermestes maculatus (D. maculatus) in het lab. We hebben ook protocollen voor de embryonale en ouderlijke RNAi en methodes te delen voor het analyseren van embryonale fenotypes voor bestudering van genfunctie in deze soort.

Grootbrengen en Double-stranded RNA-gemedieerde gen knock-down in het verbergen Kever, Dermestes maculatus

Dit artikel demonstreert nieuwe technieken ontwikkeld voor mondelinge levering van double-stranded RNA (dsRNA) via de vaatbundels weefsels van planten voor RNA-interferentie (RNAi) in het floëem sap voederen van insecten.

Double-stranded RNA orale afleveringsmethoden voor het opwekken van RNA-interferentie in het floëem en Hemipteran insecten Plant-sap-voeding

RNA interferentie is een breed toepasbare, krachtige techniek voor het manipuleren van genexpressie in specifieke ontwikkelingsstadia. Hier beschrijven we de noodzakelijke stappen voor de implementatie van deze techniek in de aquatische duikkever Thermonectus marmoratus, van de verwerving van gensequenties tot het knockdownen van genen die de structuur of het gedrag beïnvloeden.

RNA Interferentie in aquatische kevers als een krachtig instrument voor het manipuleren van genexpressie op specifieke ontwikkelingstijdpunten

De orale toediening van dsRNA geproduceerd door bacteriën, een toedieningsmethode voor RNA-interferentie (RNAi) die routinematig wordt gebruikt bij Caenorhabditis elegans, werd hier met succes toegepast op volwassen muggen. Onze methode maakt robuuste omgekeerde geneticastudies en transmissieblokkerende vectorstudies mogelijk zonder het gebruik van injectie.

Effectieve orale RNA-interferentie (RNAi) toediening aan volwassen Anopheles gambiae muggen

De manipulatie van RNA-interferentie (RNAi) vormt een formidabele uitdaging bij veel sluipwespen met een kleine grootte, zoals Trichogramma-wespen . Deze studie schetste een efficiënte RNAi-methode in Trichogramma denrolimi. De huidige methodologie biedt een robuust model voor het onderzoeken van genregulatie in Trichogramma-wespen .

RNA-interferentie in de ei-sluipwesp, Trichogramma dendrolimi Matsumura

Dit artikel neemt de phiC31-integrase-gemedieerde transgenese in Drosophila als voorbeeld en presenteert een geoptimaliseerd protocol voor micro-injectie van embryo's, een cruciale stap voor het creëren van transgene vliegen.

Embryo-micro-injectie voor transgenese bij Drosophila

Leer RNAi door dsRNA-injectie in Drosophila-embryo's voor genfunctie-analyse in ontwikkelingsbiologie. Deze methode identificeert essentiële genen voor orgaanontwikkeling, met name voor tracheale ontwikkeling.

RNAi Interferentie door dsRNA Injectie in Drosophila Embryo's

Meer video's verkennen