Het lokaliseren van Eiwit in 3D Neural Stem Cell Culture: een hybride Visualisatie Methodologie

Wanneer ze in suspensie worden gekweekt, prolifereren neurale progenitorcellen die zijn geïsoleerd uit neurogene niches van de hersenen om neurosferen te vormen. Hier tonen we de isolatie en seriële sectie van vrij drijvende postnatale hippocampaal-afgeleide neurosferen om de eiwitexpressie binnen de driedimensionale neurosfeer te lokaliseren. We zullen immuunkleuring uitvoeren voor een eiwit van belang, in dit geval Conexion 29, gevolgd door de assemblage en translatie van tweedimensionale microscopiebeelden naar een driedimensionale reconstructie van de neurosfeer.

Visualisatie van eiwitten binnen de context van hun natuurlijke driedimensionale structuren, zoals een vrij zwevende neuronenbol of weefsel, maakt een beter begrip mogelijk van de eiwitfunctie op basis van de locatie binnen deze structuren, en staat tevens toe om mogelijke regels af te leiden voor eiwitten met een bekende lokalisatie maar onbekende functies. Hallo, ik ben Sophia Ambo van het Neural Regeneration Laboratory aan de Universiteit van Ottawa. En ik ben Nicholas Valenzuela van de Carlton Immersive Media Studio aan de Carleton Universiteit in Ottawa.

Vandaag demonstreren we hoe u postnatale neurale progenitorcellen uit de hippocampus kunt isoleren, expanderen en serieel kunnen snijden als neurosferen. Om proteïne-expressie via immunovleking te lokaliseren, gebruiken we vervolgens tweedimensionale beelden van de serieel gesneden neurosferen die na de immunovleking zijn verzameld, om een methode te illustreren voor het reconstrueren van de cellulaire en proteïne-locatie in de driedimensionale structuur en zo de ruimtelijke organisatie van de proteïne-expressie in de neurosferen te beoordelen. Laten we beginnen.

Zodra de hersenen zijn verzameld, bereidt u ze voor om op de houder te plaatsen door een vlak oppervlak te creëren zodat de hersenen er goed op kunnen rusten. Dit wordt 'blocking' genoemd. Block het cerebellum met behulp van een scheermesje en een pincet.

Breng vervolgens een druppel secondelijm aan op het klemstuk en bevestig het eerste brein hierop, met de anterieure zijde naar boven en de dorsale zijde naar u toe gericht. Ga op dezelfde wijze te werk met de overige breinen; voor het laatste brein is het raadzaam om de dorsale zijde van u af te positioneren, aangezien het snijden in deze richting soms onvolledig is. Indien er onvolledig snijden optreedt, gebruik dan een scalpel om door te snijden en de sectie te verzamelen.

Snelheid is essentieel bij de lijmstap, omdat de hersenen niet te lang aan de lucht mogen worden blootgesteld. Zodra alle hersenen zijn vastgelijmd, wordt de chuck in de vibrato geplaatst en de houder gevuld met ijskoud CSF.

Stel de vibrator in op een frequentie van 8,5 en een snelheid van 3,5 tot 4,5. Breng het mes in contact met de A CSF en stel de automatische snede in. We zullen nu coupes van 500 micron snijden.

Bewaar de coupes die de hippocampus bevatten. Plaats deze in een schaal gevuld met ijskoude A CSF en gooi de overige coupes weg. Zodra alle coupes zijn verzameld, kan worden overgegaan tot de dissectie van de hippocampus.

Met behulp van een stereomicroscoop nemen we alleen de dorsale hippocampus af, ongeveer tussen bgma -1.65 mm en -2.10 mm. Plaats de hippocampi in een lege, ijskoude schaal. Wanneer alle hippocampi uit de coupes zijn verzameld, is het tijd om ze naar de laminaire flowkast te brengen voor mechanische dissociatie.

Bespuit het mesje van een scalpel met 70% ethanol en steriliseer dit door middel van vlammen. Snijd het weefsel met de scalpel totdat het vloeibaar lijkt. Verzamel het weefsel vervolgens door te pipetteren met behulp van dissociatiemedium dat al pepane DNAs en neurale protease bevat, en breng dit over in een buis van 15 milliliter.

Plaats voor de enzymatische dissectie de buis in een roterende oven ingesteld op 37 °C en laat de digestie 45 minuten tot een uur plaatsvinden. Zodra de digestie voltooid is, voegt u 10 ml steriele weefselkweek-PBS toe om de enzymatische reactie te stoppen en centrifugeert u de cellen bij 300 ×g gedurende vijf minuten. Verwijder het supernatant en resuspendeer het pellet.

Gebruik in vijf milliliter PBS een Pasteurpipet en tritureer het monster om het weefsel verder te dissociëren. Blijf tritureren totdat de weefselstukjes niet verder verkleinen. Pelleteer de cellen op dit punt opnieuw.

Verwijder de PBS en resuspendeer het pellet in drie milliliters onderhoudsmedium. Tritureer het monster vervolgens grondig. Neem een aliquot van 15 microliter en meng dit met een gelijk volume trypaanblauw.

Neem twee monsters van 10 µL en vul een hemocytometer voor het tellen van de cellen. Tel de cellen in drie velden per sectie, voor een totaal van zes velden. Bereken de gemiddelde aantallen om de celdichtheid te bepalen.

Houd er rekening mee dat het monster is verdund. Plaats de cellen in trypan blue-platen, in schaaltjes met lage adhesie, bij een dichtheid van 2,5 × 10⁵ cellen per schaaltje in een eindvolume van 5 mL onderhoudsmedium. Indien schaaltjes met lage adhesie niet beschikbaar zijn, kunnen petrischalen worden gebruikt.

In dit geval moet u de neurosferen elke dag in de ochtend en middag tikken gedurende de eerste zes dagen, zodat de neurosferen niet aan de bodem van de schaal hechten. Voeg EG, F en FGF toe voordat u de schalen in de incubator plaatst. Deze groeifactoren moeten elke twee dagen worden aangevuld gedurende de gehele cultuurperiode. Fixeer de neurosferen op dag in vitro 14 met formaldehyde tot een eindconcentratie van ongeveer 4% door dit direct aan de cultuur toe te voegen en 20 minuten bij kamertemperatuur te incuberen.

Centrifugeer de cellen bij 300 ×g gedurende vijf minuten om een pellet te vormen. Was de cellen tweemaal met PBS en resuspendeer ze in een 15 tot 20% sucrose-oplossing in een 10 millimolair fosfaatbuffer. Laat de cellen ten minste 24 uur cryoprotecteren bij 4 °C voordat ze met een cryostaat in coupes worden gesneden.

Haal de cryobeschermde neurosfereen uit de koelkast en plaats ze in een schaal van 60 millimeter. Voor seriële secties waarbij het cruciaal is om elke individuele sectie te verzamelen, vond ik het het beste om neurosfereen van een goede grootte en vorm te selecteren met behulp van een stereomicroscoop; plaats vervolgens met een pipetteerder een neurosfeer in een cryovorm die gevuld is met OCT-compound. Markeer de plek waar de neurosfereen zich bevinden op de cryovorm.

Deze stap helpt bij het lokaliseren van de neurosferen tijdens het snijden. Zodra vijf tot 10 sferen snel in de mal zijn geplaatst, worden deze bevroren met CO2. Markeer, aan de hand van de aanduidingen op de cryomal, direct in het bevroren OTC-blok waar de neurosferen zich bevinden.

Verwijder het OCT-blok uit de mal en plaats het op de houder van de cryostaat. Fixeer de mal aan de houder met CO2 en plaats deze in de cryostaat. Laat de monsters ten minste 30 minuten equilibreren.

Zodra dit is voltooid, snijdt u snel tot aan de markeringen op het blokje, waarna u vanaf dat punt elke sectie begint te verzamelen. Controleer met een lichtmicroscoop waar de plakjes van de neurosfeer beginnen. Wanneer het sectioneren voltooid is, bewaart u de coupes in een vriezer tot u klaar bent om de immunochemie uit te voeren. Neem voor deze stap de coupes die een van de serieel gesneden neurosferen bevatten, inclusief de coupes van de vijf voorgaande en vijf volgende secties.

Dit zorgt ervoor dat u de volledige neurosfeer in beeld brengt. Het gebruik van een nucleaire tegenkleuring is essentieel om alle secties van uw neurosfeer te kunnen vinden. Houd hier rekening mee bij het plannen van uw immunokleuring. Terwijl de coupes worden voorbehandeld door PBS toe te voegen en minstens vijf minuten op kamertemperatuur te laten komen, gebruiken wij een antilichaambuffer die 0,3% Triton X 100 bevat voor permeabilisatie en 3% runderserumalbumine voor blokkering.

Verdun uw primaire antilichaam op de juiste wijze in deze buffer en incubeer dit gedurende de nacht bij vier graden in de menselijke kamer. Gebruik PBS om de paraform van de neurosferen af te drijven en verwijder deze voorzichtig met een pincet. Dit is de eerste van vier PBS-wasstappen van vijf minuten.

Breng het secundaire antilichaam aan op de objectglazen en incubeer deze gedurende één uur bij kamertemperatuur. Laat de paraform, zoals eerder beschreven, met PBS van het objectglas afdrijven en verwijder deze met een pincet. Ook dit is de eerste van vier vijfminuten durende PBS-wasstappen.

Bij de derde wasstap voegen we HOS 3 3 2, 5 8 toe als kerntegenkleuring, verdund tot 0,5 micrograms per milliliter. Na de HOS-wasstap volgt nog één laatste wasbeurt van vijf minuten in PBS. Wanneer alle wasstappen zijn voltooid, brengt u een royale hoeveelheid monteermedium aan op de onderkant van het objectglas en bedekt u dit met een glasdekglas.

Zet de hoeken vast met nagellak. Zodra alle preparaten zijn afgedekt met een dekglas, zet u de rest van de randen van het dekglas vast. Maak direct beelden van het preparaat of bewaar deze bij -20 °C tot u hiertoe klaar bent.

Bij het maken van beelden is het vinden van de cellen op het objectglas het moeilijkste gedeelte; het is eenvoudig om cellen die tot de sfeer behoren te detecteren als u zoekt met de tegenkleuring van de kernen. Zodra u het begin van de neurosfeer heeft gevonden, die mogelijk slechts uit enkele cellen bestaat, maakt u van elke volgende sectie beelden. Neem opnames van de kernkleuring, uw eiwit of eiwitten van belang en een fasecontrastbeeld.

Deze fasecontrastafbeelding zal zeer belangrijk zijn in de modelleringsfasen. Afbeeldingen met vaste schaalbalken van 10 micrometers en 50 micrometers, ingesteld in de software open lab 3.56, worden geïmporteerd in Photoshop CS 4 met een standaard canvasgrootte van 3.300 bij 2.550 pixels.

Alle beelden van de seriële coupes zijn opgeslagen als TIFF-bestanden met behoud van de standaard canvasgrootte. Open de contrastbeelden van de eerste en tweede fase van de seriële coupes van de neurosferen. Verhoog de transparantie van de tweede coupe onder het tabblad afbeelding, open de beeldrotatie en kies willekeurig.

Draai de tweede sectie totdat u punten van geometrische en structurele continuïteit tussen de beelden kunt identificeren. Herhaal dit voor alle seriële secties en sla elke sectie op als een aparte laag. Zorg ervoor dat elke beedlaag die overeenkomt met fase en eiwitexpressie gekoppeld is, zodat alle rotaties voor elk kanaal gelijktijdig worden uitgevoerd.

Maak in Maya een vlak aan met dezelfde proporties als het Photoshop-bestand vanuit de statusregel van de gebruikersinterface van Maya. Wijzig de menubalk van de standaardinstelling 'animation' naar 'surfaces'. Gebruik een primitieve subdivision sphere om het cellichaam te creëren terwijl de sfeer is geselecteerd.

Begin met het manipuleren van de hoekpunten door met de rechtermuisknop op het object te klikken en 'vertex' te selecteren in het markeringsmenu. Verfijn vervolgens het oppervlak van de bol door het weergaveniveau in het markeringsmenu te wijzigen via het tabblad 'subdivision surfaces' van het hoofdmenu. Open het optievenster 'collapse hierarchy' en stel het aantal niveaus in op twee.

Collapse de sfeer. Verander de menubalk van oppervlakken naar polygonen terwijl de sfeer is geselecteerd. Open de tool voor het boetseren van geometrie vanuit het mesh-tabblad van het hoofdmenu.

Verfijn het oppervlak van de cel tot de definitieve vorm. Gebruik hiervoor de sculpt geometry tool set vanuit het tabblad tool settings. Herhaal dit proces voor elke cel van uw typologie om de variëteit aan progenitorcellen in de neurosferen te simuleren.

In deze demonstratie zullen 10 verschillende progenitorcellen de basis vormen van de neurosfeer. Selecteer de celtypologie en bevries de transformaties met de cellen van uw typologie. Er worden twee surface shaders ontworpen om zowel cellen die het eiwit connects in 29 tot expressie brengen als cellen waarin het eiwit afwezig is, weer te geven.

Open het hyper shade-venster via het tabblad 'windows rendering editor' van het hoofdmenu. Kies een ramp-shader in het tabblad 'surface materials'. Open de attributen-editor en stel de attributen in voor shader-kleur, gloeiende omgevingskleur, bump-map en speculaire kleur.

Wijs een Brownian 3D-textuur toe aan de ambient color-node en een 2D-fractaaltextuur aan de bump mapping-node. Selecteer de resulterende shader-ingang- en uitgangsverbindingen en exporteer het geselecteerde netwerk. Selecteer de celtypologie en open het venster met exportselectie-opties.

Kies het bestandstype Maya A-S-C-I-I en vink het vakje include these inputs export selection uit. Open het bestand met de uitgelijnde seriële coupes in Adobe Photoshop. Stel een legenda van potloodstreken op om de locatie van elke progenitorcel in de seriële coupes te markeren.

In deze demonstratie wordt een legenda van drie symbolen gebruikt: een massief vierkant, een vierkant met een stippellijn en een vierkant met een kruis om aan te geven of een cel zich in één, twee of drie secties bevindt.

Deze legenda van markeringen is verder gedefinieerd door de kleur rood, die cellen representeert die conexion 29 tot expressie brengen, en wit, dat cellen representeert die geen Conexion 29 tot expressie brengen. Zet de faselaag aan en begin het centrum van elke progenitorcel te markeren met een witte potloodstreek. Gebruik een aparte laag binnen de sectiemap om uw kaarten op te bouwen.

Schakel tussen de secties om de positie van de cel te bepalen, waarbij wordt gewaarborgd dat cellen die over meer dan één sectie verspreid zijn, correct worden aangeduid. Met de CX 29-laag ingeschakeld, selecteert u de cellen die in de regio's liggen waar CX 29 positief tot expressie komt.

Kies het vulcommando uit het bewerkingstabblad van de hoofdmenubalk van Photoshop en verander de witte lijnen in rode lijnen zodra de kaarten zijn voltooid. Sla elk gedeelte op als een aparte JPEG-afbeelding in de map met bronafbeeldingen van het Maya-project. Om dit te doen, moet eerst een nieuw Maya-project worden aangemaakt via de statusregel van de gebruikersinterface van Maya.

Wijzig de instelling van de menubalk van de standaardanimatie naar polygonen om de vlakken te importeren. Voeg de ma en de schaalbalk toe. Selecteer de ma-bestanden uit de map 'projects seen' met het geselecteerde vlak.

Wijs een Lambert-shader toe door met de rechtermuisknop op het object te klikken en het tabblad 'assign new material' in de attribute editor te openen. Klik in het pop-upmenu op het geblokte vakje rechts van het kleurattribuut van de materialen. Kies 'file' in het gedeelte '2D texture' onder de sectie 'file attribute' in de attribute editor.

Klik op het bestandsicoon rechts van het attribuut voor de naam van de afbeelding. Selecteer de eerste sectie uit de map met bronafbeeldingen. Schakel de camera van het werkruimtevenster van het perspectivisch aanzicht naar het standaard orthografische bovenaanzicht door het tabblad van dat paneel te openen.

Selecteer het hulpmiddel 'create polygon' in het mesh-tabblad van het hoofdmenu en trek de omtrek van de sectie over. Kies de eerste kaart uit de map met bronafbeeldingen en wijs deze toe aan het nieuw aangemaakte polygoonvlak. Volg de stappen voor het maken van het polygoonvlak met het object geselecteerd en kies UV uit het markeringsmenu door met de rechtermuisknop op het vlak te klikken.

Selecteer alle UV-punten van de vlakken en open de UV-textuureditor via het tabblad 'windows' in het hoofdmenu; schaal de UV's proportioneel om ze aan het doorsnedevlak aan te passen. Herhaal dit proces voor elk segment van de neuros-bol, waarbij u ervoor zorgt dat de tussenruimten tussen elk segment overeenkomen met de hoogte van de schaalbalk uit de statusregel van de Maya-gebruikersinterface. Wijzig de menubalk van de standaardinstelling 'animation' naar 'dynamics', waarbij alleen het eerste segment van de neuros-bol zichtbaar blijft.

Verberg alle andere secties door de weergave-instellingen te wijzigen in het weergavetabblad van het hoofdmenu terwijl het optievak voor de CV-curve-tools is geopend; selecteer 'one linear' in de CV-curve-instellingen. Begin, terwijl de scène via de camera voor bovenaanzicht wordt bekeken, met het toewijzen van punten aan de celkaarten, waarbij één curve wordt gemaakt voor de CX 29 negatieve cellen en de CX 29 positieve cellen. De resulterende curves zijn vlak wanneer ze via de camera voor zijaanzicht worden bekeken.

Benader de dikte van de secties door de punten van de curve op de Y-as te verschuiven, met de schaalbalk als leidraad. Herhaal dit proces voor elke sectie van de neurosfeer.

Importeer het bestand cell typology.ma uit de scenes-map van het project en dupliceer de celtypologie voor zowel de CX 29 negatieve als de CX 29 positieve progenitoren. Open het hyper shade-venster via het tabblad windows rendering editors in het hoofdmenu.

Importeer de eerder gebouwde shaders en wijs deze via het outliner-venster toe aan de cellen van de typologie. Verwijder de bestandsnaam aan het begin van de geïmporteerde objecten. Dit zal in latere fasen van het modelleringsproces belangrijk worden.

Selecteer het tabblad 'particles' in het hoofdmenu en maak een particle emitter aan voor de eerste CV-curve. Open het tabblad 'particle shape one' en wijzig onder 'emission attributes' de 'max count' van min één naar het aantal punten op uw eerste curve. Wijzig in het tabblad 'render attributes' het 'particle render type' naar 'blobby surface'.

Klik op het vak voor het huidige rendertype hieronder en wijzig de straal van de deeltjes naar 0.01. Koppel de deeltjes aan de knooppunten van de curve door eerst de deeltjes te selecteren en vervolgens, terwijl u Shift ingedrukt houdt, de curve te selecteren.

Open de doelopties vanuit het tabblad deeltjes van het hoofdmenu en stel het doelgewicht in op één. Klik op maken. Selecteer in het venster van de outliner de cellen van nummer één tot 10 in volgorde en open het venster met opties voor onmiddellijke vervanging vanuit het tabblad deeltjes van het hoofdmenu.

In het vak met instantie-objecten moeten alle 10 cellen in volgorde worden weergegeven. Kies de juiste naam voor de partikelvorm uit de vervolgkeuzelijst van het tabblad voor het te instantiëren partikel-object. Klik op 'create'. Standaard zal alleen de eerste geselecteerde cel de partikels langs de curve vervangen; om ervoor te zorgen dat alle 10 cellen verschijnen en willekeurig worden afgewisseld tussen de partikels, is een expressie nodig.

Een tweede expressie zorgt ervoor dat de cellen elke keer op dezelfde willekeurige manier emitteren. De bereikschuifregelaar wordt opnieuw gepositioneerd terwijl de emitter is geselecteerd. Open de attribuuteditor in het tabblad met de partikelvorm onder 'add dynamic attribute'.

Klik op het algemene vak onder de lange naam. Typ random underscore index in het veld attribuuttype, wijzig de instelling van scalar naar per particle array en klik op add in het tabblad per particle array attributes. Er is een random underscore index-vak toegevoegd.

Klik met de rechtermuisknop op de lege ruimte en selecteer 'create expression' in het vervolgkeuzemenu. Typ de volgende tekst in het expressievenster om de expressie te voltooien. Open het tabblad 'instant search geometry replacement' in de attribuuteditor en ga bij de algemene opties naar 'object index'.

Selecteer een willekeurige underscore-index uit de vervolgkeuzelijst. Versleep de tijdbalk naar het eerste frame en druk op afspelen. De celtypen zijn nu willekeurig over de deeltjes verdeeld.

Herhaal dit proces voor elk segment van de neurosfeer. Zorg ervoor dat elk nieuw emitter-instantie en elke willekeurige index door naam wordt onderscheiden en op de juiste wijze is georganiseerd in het outliner-venster in de render. Wijzig in het gedeelte van het render-instellingenvenster de render van Maya software naar mental ray.

Open het tabblad kwaliteit en wijzig onder ray tracing de reflectie-instelling naar nul. Open het tabblad frame buffer en wijzig de kleurclip van raw naar alpha en vink Pre multiply uit.

Open de layer-editor van het channel box en wijzig de instellingen van de layer-editor van 'display' naar 'render'. Selecteer de geïmporteerde cellen van de typologie, klik op het icoon voor het maken van een nieuwe layer en het toewijzen van geselecteerde objecten, en hernoem de layer naar ambient occlusion.

Klik met de rechtermuisknop op de onlangs aangemaakte laag en selecteer 'attributes' in het menu rechts van het vak voor de renderlaag. Klik op de knop 'presets' en selecteer 'occlusion' uit de vervolgkeuzelijst. Selecteer het tabblad MIB_AMB_occlusion1 en wijzig het aantal samples van 16 naar 256.

Open de bewerkingsmodus van de kanaalbox-laag opnieuw en open onder het tabblad opties het venster voor het renderen van alle lagen; selecteer 'composite' en zorg dat de 'ambient occlusion'-laag geselecteerd blijft. Wijzig de instelling in het vervolgkeuzemenu direct boven de lagenlijst van 'normal' naar 'multiply'. Render twee passes van de neuros-bol, één keer met de 'ambient occlusion'-laag ingeschakeld en één keer met de masterlaag ingeschakeld. Sla de afbeeldingen op als IFF-bestanden in de afbeeldingenmap van het project.

Open beide afbeeldingen in Adobe Photoshop. Plaats de ambient occlusion-laag bovenop de masterlaag en stel deze in op 'multiply' (vermenigvuldigen). Maak een achtergrond aan en maak de afbeelding plat.

We hebben zojuist aangetoond hoe u uit de hippocampus afgeleide neurogene cellen als neurosferen kunt kweken, hoe u neurosfeer-culturen serieel kunt doorsnijden met behulp van een cryostaat en hoe u immunokleuring uitvoert voor een specifiek eiwit. Ook hebben we laten zien hoe u de ruimtelijke locatie van die eiwitexpressie in drie dimensies kunt modelleren met een combinatie van celcultuurregistratie en driedimensionale modelleringssoftware.

We hopen dat dit u helpt en we wensen u veel succes met uw experimenten.