Name: Het lokaliseren van Eiwit in 3D Neural Stem Cell Culture: een hybride Visualisatie Methodologie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-19T18:00:00.000+00:00
Duration: 21 min 47 s
Description: Leer hoe je eiwitten lokaliseert in 3D-neurale stamcelculturen van postnatale hippocampus. Deze hybride visualisatiemethode combineert immunokleuring met driedimensionale reconstructie voor inzicht in eiwitfunctie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken Evan Dysart en Marc Leonard voor deskundige technische bijstand in video-productie en redactie, Matt Cooke voor hulp bij het verzamelen van gegevens, en Sarah Gelbard voor deskundige redactionele hulp. Het werk werd gefinancierd door exploitatiesubsidies van het Canadese Institute of Health Research (CIHR, MOP 62626) om SALB, een strategisch opleidingsbeleid initiatief in Health Research programma te verlenen aan SALB en SF (CIHR Training Program in Neurodegeneratieve Lipidomics, TGF 9.121), en infrastructuur steun van de Canadese Stichting Innovatie en Ontario innovatie Trust SF. SI ontvangen een Ontario Graduate Scholarship in wetenschap en technologie met bijdragen van de Parkinson Research Consortium. NV ontvangt een Institute of Aging en CIHR Training Program in Neurodegeneratieve Lipidomics post-professionele gemeenschap. Wij dankbaar erkennen de educatieve software en technische ondersteuning door AutoDesk Research.

<ol><li>Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Milestones+of+neuronal+development+in+the+adult+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Milestones of neuronal development in the adult hippocampus.</a> Trends Neurosci. 27, 447-452 (2004).</li>
<li>Campos, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurospheres%3A+insights+into+neural+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Neurospheres: insights into neural stem cell biology.</a> J Neurosci Res. 78, 761-769 (2004).</li>
<li>Imbeault, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix+controls+gap+junction+protein+expression+and+function+in+postnatal+hippocampal+neural+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix controls gap junction protein expression and function in postnatal hippocampal neural progenitor cells.</a> BMC Neurosci. 10, 13-13 (2009).</li>
</ol>

Alle experimenten op dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en voorschriften uiteengezet door de Universiteit van Ottawa Animal Care Comite en de Canadese Raad voor Dierenaangelegenheden Care set.

Dit protocol beschrijft een procedure om cultuur en serieel cryosection postnatale hippocampus NPCs, lokaliseren eiwit-expressie door immunodetectie, en tenslotte te reconstrueren en analyseren van de topografische positie van immunopositive cellen in de hele 3D-neurosphere. Door de combinatie van celbiologie cultuur en verwerkingstechnieken, microscopie beeldvorming (Openlab, Improvisatie en andere beeldanalyse software), grafische editing software capaciteiten (Adobe Photoshop), en 3D-animatie en compositing software capaciteiten (Autodesk Maya), presenteren we een methodiek om de te reconstrueren gehele cellulaire samenstelling van de 3D-culturen uit serie 2D beelden waardoor de getrouwe reconstructie van cellulaire functie en eiwit expressie gedurende een neurosphere cultuur. Dit protocol kan gecombineerd worden met gelijk doeltreffendheid om de registratie en de wederopbouw van epifluorescerende dunne seriële secties of confocale Z-stacks door dikkere seriële secties. Omdat de klonale expansie van enkele NPC&#39;s in neurosphere cultuur recapituleert veel van de podia die gedurende de loop van de neurogenese en gliogenesis in post-natale hersenen, de impact van zijn 3D-structuur is een belangrijke NPC lot determinant in het nageslacht blootgesteld aan dezelfde experimentele milieu 1. Divergentie in afkomst en proteïne-expressie in de kern en de periferie van de seriële neurosphere secties suggereert dat meerdere fysieke factoren, waaronder de cel positie, mechanische stress, en dwarskracht een belangrijke rol spelen in het reguleren van NPC biologie 2. Bovendien heeft connexine eiwit expressie, geanalyseerd hier, is aangetoond dat ze veranderen afhankelijk van wanneer NPC&#39;s worden gekweekt als 3D neurospheres in suspensie of uitgeplaat op een laminine substraat met functionele connexine-gemedieerde communicatie veranderde of cellen worden gekweekt op plastic en substraat of in 3D gratis -drijvende culturen 3. De impact van cellulaire positie op NPC lot blijft onduidelijk. Het is technisch een uitdaging om de impact van de ruimtelijke locatie te analyseren binnen de 3D-cultuur op de NPC biologie gezien het feit dat antigene beoordeling van de afstamming en signaaleiwitten vereist verstoring van de 3D-architectuur in staat te stellen cel permeabilisatie en antilichaam toegang tot alle cellen. Hier laten we zien dat een hybride visualisatie methodiek een middel om te bepalen of bepaalde eiwitten unieke positie lokalisaties tentoonstelling in 3D cultuur biedt, kan worden afgeleid en eiwit functie en regulatie test met betrekking tot de regionale lokalisatie binnen de neurosphere, en, misschien wel het allerbelangrijkste , biedt de positionele gegevens die nodig zijn om de impact van 3D topografie en cellulaire positionering op NPC lot in 3D cultuur te bestuderen.

* Alle andere standaard chemische reagentia die in het protocol zijn van Sigma-Aldrich. Alle andere standaard weefselkweek reagentia zijn van Invitrogen.

het lokaliseren van eiwit in 3d neural stem cell culture: een hybride visualisatie methodologie

Localizing Protein in 3D Neural Stem Cell Culture: a Hybrid Visualization Methodology

Het belang van 3-dimensionale (3D) topografie in het beïnvloeden van neurale stamcellen en voorlopercellen cel (NPC) fenotype is algemeen bekend toch uitdagend om te studeren. Bij het los van embryonale of postnatale brein, zal enkele NPC&#39;s verspreiden in suspensie te neurospheres te vormen. Dochter cellen binnen deze culturen spontaan vast te stellen verschillende ontwikkelings lineages (neuronen, oligodendrocyten en astrocyten) in de loop van de uitbreiding ondanks het feit dat bloot aan dezelfde extracellulaire milieu. Deze progressie recapituleert veel van de podia die gedurende de loop van de neurogenese en gliogenesis in post-natale hersenen en wordt vaak gebruikt om elementaire NPC biologie studeren binnen een gecontroleerde omgeving. Het beoordelen van de volledige impact van 3D topografie en cellulaire positionering binnen deze culturen op NPC lot is echter moeilijk. Te lokaliseren doelwit eiwitten en NPC lijnen door middel van immunocytochemie te identificeren, moet vrij zwevende neurospheres worden uitgeplaat op een substraat of serie coupes. Deze verwerking is nodig om gelijkwaardige cel permeabilisatie en antistoffen in het hele gebied te garanderen. Als gevolg hiervan kan 2D epifluorescerende beelden van vriescoupes of confocale reconstructies van 3D Z-stacks alleen ruimtelijke informatie over de cel positie in discrete fysieke of digitale 3D-plakken en niet te visualiseren cellulaire positie in het intacte sfeer. Hier, aan de topografie van het neurosphere cultuur herhalen en laten ruimtelijke analyse van proteïne-expressie in de hele cultuur, presenteren we een protocol voor isolatie, uitbreiding, en seriële snijden van post-natale hippocampus neurospheres geschikt voor epifluorescerende of confocale immunodetectie van target eiwitten. Connexin29 (Cx29) is geanalyseerd als een voorbeeld. Vervolgens met een hybride van grafische bewerking en 3D-modeling software streng toegepast op biologisch detail te behouden, beschrijven we hoe de 3D-structurele positionering van deze beelden opnieuw te monteren en digitaal kaart gelabelde cellen binnen de gehele neurosphere. Deze methodologie maakt visualisatie en analyse van de cellulaire positie van target eiwitten en cellen in het gehele 3D-cultuur topografie en vergemakkelijkt een meer gedetailleerde analyse van de ruimtelijke relaties tussen de cellen in de loop van neurogenese en gliogenesis in vitro. Zowel Imbeault en Valenzuela droegen gelijk en moeten worden beschouwd joint eerste auteurs.

Hier beschrijven we hoe te produceren, uit te breiden, en immunolabel postnatale hippocampus neurale progenitor cellen (NPC&#39;s) in drie-dimensionale (3D) cultuur. Vervolgens met behulp van hybride visualisatie technieken, laten we zien hoe digitale beelden van immunolabelled vriescoupes kunnen worden gebruikt om te reconstrueren en in kaart van de ruimtelijke positie van immunopositive cellen in het gehele 3D-neurosphere.

Het lokaliseren van Eiwit in 3D Neural Stem Cell Culture: een hybride Visualisatie Methodologie

Het belang van driedimensionale (3D) topografie bij het beïnvloeden van het fenotype van neurale stam- en progenitorcellen (NPC) is algemeen erkend, maar vormt een uitdaging om ...

localizing-protein-3d-neural-stem-cell-culture-hybrid-visualization

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Hier beschrijven we het gebruik van een zelf-assemblage drie-dimensionale steiger aan de cultuur menselijke neurale stamcellen. We presenteren een protocol bij de cellen van de steigers vrij te worden geanalyseerd vervolgens bijvoorbeeld door flowcytometrie. Dit protocol kan worden aangepast aan andere soorten cellen om gedetailleerde mechanistisch studies uit te voeren.

Teelt van menselijke neurale progenitorcellen in een 3-dimensionale Zelf-assemblage Peptide Hydrogel

This video showcases the development and differentiation of human neural stem cells within a three-dimensional scaffold. A laminin coating on the scaffold promotes cell attachment, while a growth factor-free neural medium induces cell differentiation into neural progenitor cells, which extend their processes within a porous architecture in multiple directions, forming a three-dimensional...

Differentiating Human Neuronal Stem Cells into 3D Culture Using a Porous Scaffold

Source: Gómez-Villafuertes, R., et. al., Live Imaging Followed by Single Cell Tracking to Monitor Cell Biology and the Lineage Progression of Multiple Neural Populations. J. Vis. Exp. (2017) The video demonstrates the process of preparing, imaging, and tracking adult neural stem cells in real time to study cellular behaviors, including division and differentiation.

 Live Imaging and Single-Cell Tracking to Monitor Neural Lineage in Adult Neural Stem Cells

Neurale stamcellen geoogst uit de volwassen hersenen worden steeds gebruikt in toepassingen, variërend van het fundamenteel onderzoek van de ontwikkeling van het zenuwstelsel aan het verkennen van potentiële klinische toepassingen in de regeneratieve geneeskunde. Dit maakt strenge controle op de isolatie en kweekomstandigheden gebruikt om deze cellen cruciaal voor experimentele resultaten goed groeien.

Groeiende neurale stamcellen uit Conventionele en Niet-conventionele Regio&#39;s van de Adult knaagdierhersenen

Met het doel om veranderingen in miRNA's in gedifferentieerde menselijke neurale stamcellen (hNSC's) te karakteriseren, beschrijven we hNSC-differentiatie op een driedimensionaal systeem, de evaluatie van veranderingen in microRNA-expressie door miRNA PCR-array en computationele analyse voor miRNA-doelwitvoorspelling en de validatie ervan door middel van een dual luciferase-assay.

Differentiatie van een menselijke neurale stamcellen Line op Three Dimensional Culturen, Analyse van MicroRNA en vermeende doelwit-genen

Dendritische stekels van piramidale neuronen zijn de sites van de meest prikkelende synapsen in de hersenen van zoogdieren cortex. Deze methode beschrijft een 3D-kwantitatieve analyse van de wervelkolom morfologie in menselijke corticale piramidale glutamaat neuronen afgeleid van geïnduceerde pluripotente stamcellen.

Driedimensionale Kwantificering van Dendritische stekels van Piramidale Neuronen afgeleid van menselijk geïnduceerde pluripotente stamcellen

Levende imaging is een krachtig hulpmiddel om te studeren van cellulaire gedrag in real-time. Hier beschrijven we een protocol voor time-lapse video-microscopie van primaire hersenschors cellen waarmee een gedetailleerd onderzoek van de fasen die onder de progressie van de bloedlijn van primaire neurale stamcellen gedifferentieerde neuronen en glia werden.

Live beeldvorming van primaire hersenschors cellen met behulp van een systeem van 2D cultuur

De beschreven pijplijn is ontworpen voor de segmentatie van elektronenmicroscopie datasets groter dan gigabytes, om hele celmorfologieën te extraheren. Zodra de cellen zijn gereconstrueerd in 3D, kan aangepaste software die is ontworpen rond individuele behoeften worden gebruikt om een kwalitatieve en kwantitatieve analyse rechtstreeks in 3D uit te voeren, ook met behulp van Virtual Reality om de zicht occlusie te overwinnen.

Een methode voor 3D reconstructie en Virtual Reality analyse van gliale en neuronale cellen

De hier gepresenteerde methode maakt gebruik van micropatterning samen met kwantitatieve beeldvorming om de ruimtelijke ordening binnen de zoogdier culturen te onthullen. De techniek is gemakkelijk vast te stellen in een standaard laboratorium voor celbiologie en biedt een Tractable systeem om patronen in vitro te bestuderen.

De opkomende ruimtelijke ordening van zoogdiercellen in kaart brengen met behulp van micro patronen en kwantitatieve beeldvorming

Hier presenteren we een eenvoudig te gebruiken co-cultuurtest om glioblastoom (GBM) migratie op neuronen met patronen te analyseren. We ontwikkelden een macro in FiJi-software voor eenvoudige kwantificering van GBM-celmigratie op neuronen en merkten op dat neuronen GBM-celinvasieve capaciteit wijzigen.

Co-cultuur van Glioblastoom Stam-achtige cellen op patroonneuronen om migratie en cellulaire interacties te bestuderen

We presenteren gedetailleerde protocollen voor de generatie en karakterisering van 2D en 3D human induced pluripotent stamcel (hIPSC)-gebaseerde modellen van neocorticale ontwikkeling, evenals complementaire methodologieën die kwalitatieve en kwantitatieve analyse van primaire cilium (PC) biogenese en functie mogelijk maken.

2D en 3D humane geïnduceerde pluripotente stamcelgebaseerde modellen om primaire ciliumbetrokkenheid tijdens neocorticale ontwikkeling te ontleden

Leer hoe je eiwitten lokaliseert in 3D-neurale stamcelculturen van postnatale hippocampus. Deze hybride visualisatiemethode combineert immunokleuring met driedimensionale reconstructie voor inzicht in eiwitfunctie.

Het lokaliseren van Eiwit in 3D Neural Stem Cell Culture: een hybride Visualisatie Methodologie

Meer video's verkennen