Een organotypische Slice Assay voor High-Resolution Time-Lapse Imaging van neuronale migratie in de postnatale Brain
11 december 2010
Dit protocol beschrijft een organotypische slice assay geoptimaliseerd voor de postnatale hersenen en hoge-resolutie time-lapse beeldvorming van neuroblast migratie in de rostrale migratie stroom.
Ik ben Troy Gasai. We gaan het hebben over een organotypische plak-assay die de afgelopen jaren in mijn laboratorium is geperfectioneerd. Ben Jacket uit mijn laboratorium zal demonstreren hoe deze assay wordt uitgevoerd.
De organotypische slice-assay van de postnatale hersenen is een krachtige methode voor het testen van diverse factoren en hun rol bij neuronale migratie in de postnatale hersenen en de TRO-migratiestroom. Hallo, ik ben Ben Jakay. Ik ben postdoctoral fellow in het laboratorium van Dr. Troy gge aan het College of Veterinary Medicine van de North Carolina State University, en ik ben hier vandaag om u te laten zien hoe we weefsel-kruistransplantatie uitvoeren tussen organotypische muizenhersenslices om migrerende neuroblasten in de postnatale hersenen te visualiseren.
Alle in deze video beschreven technieken moeten in een steriele omgeving worden uitgevoerd, bij voorkeur in een laminaire flowkast met gesteriliseerde instrumenten. Een druppel van 150 µL slice-medium wordt met een wegwerpspuit voorzien van een naald van 23 gauge in het midden van het glazen bodemgedeelte van de schaal geplaatst. Er worden verschillende lijmpunten aangebracht buiten het cirkelvormige glazen bodomdeckglas, waarbij één zijde ongelijmd blijft voor vloeistofuitwisseling A. Een kernporie-membraan wordt vervolgens voorzichtig met micropincetten op het medium geplaatst, waarbij erop wordt gelet dat er geen luchtbellen onder het membraan gevangen raken.
De gebogen pincet wordt vervolgens gebruikt om de lijmpunten plat te drukken en het membraan op zijn plaats te fixeren. Er wordt één milliliter slice-medium bovenop het membraan toegevoegd, en tot slot worden de schaaltjes in een incubator geplaatst tot ze klaar zijn voor gebruik. De beste resultaten worden behaald wanneer coupes worden geprepareerd van jonge postnatale muizen, P1 tot en met P10; eerst wordt de kop gestabiliseerd door de snuit met micropincetten vast te houden.
De huid wordt longitudinaal ingesneden van de nek tot de snuit. De hoofdhuid wordt weggepeld om het bot bloot te leggen en de schedel wordt longitudinaal en anterieur doorgesneden, beginnend bij het sternum magna, door één mediale en twee laterale sneden te maken, één aan elke zijde. Er moet zorgvuldig worden gewerkt om contact met het onderliggende corticale weefsel tot een minimum te beperken.
Terwijl de schedelflappen worden verwijderd van de hersenen om de stabiliteit van het weefsel te verbeteren. Tijdens het vibrotoom-snijden worden de meest laterale en caudale aspecten van de hersenen met een scheermesje verwijderd. De twee hemisferen worden voorzichtig uit de schedel geschept en met het mediale oppervlak naar beneden in een inbedmal geplaatst.
Ze worden onmiddellijk bedekt met gesmolten 3% DNA-grade agarosegel, opgelost in weefselpreparatiebuffer die op 37 °C wordt gehouden. Na twee minuten stabilisatie op een vlak horizontaal oppervlak worden de mallen op ijs geplaatst om het stollen te voltooien en zo een gelijkmatige uitharding van de agarose te waarborgen.
Zodra de gel met de hemisferen is gestold, wordt deze uit de mal gehaald en rondom het hersenweefsel bijgesneden. Het in gel ingebedde weefsel wordt vervolgens op de monsterdisk van de vibratoom gemonteerd met het mediale oppervlak naar boven en vastgezet met cyanoacrylaatlijm. De disk wordt daarna geplaatst in de monsterbak van de vibratoom, gevuld met ijskoud weefselpreparatiemedium, waarna de hersenen worden gesneden met een dikte van 150 micrometer.
Zodra de RMS-bevattende coupes van het mesje zijn vrijgemaakt, worden ze voorzichtig uitgeschept met een kleine platte spatel en plat in het midden van de kweekschalen geplaatst. Het is essentieel dat de manipulatie van de coupes tot een minimum wordt beperkt, aangezien het weefsel zeer fragiel is. De hoeveelheid medium in de kweekschalen wordt aangepast naar een niveau dat voldoende is om de hersendoorsneden te bedekken, terwijl wordt voorkomen dat ze verschuiven.
De schaaltjes worden gelabeld en overgebracht naar een incubator. Donorhersenen worden op een soortgelijke wijze voorbereid als de hersenen van de ontvanger, behalve dat de secties worden gesneden met een dikte van 250 µm en de plakjes op ijs worden verzameld.
Koude weefselpreparatie. Bufferplakjes worden onmiddellijk onder een dissectiemicroscoop met epi-fluorescentiecapaciteit geplaatst. De RMS is zichtbaar als een grijze U-vormige structuur die zich uitstrekt van de subependymale zone tot de bulbus olfactorius.
De RMS wordt voorzichtig gemicrodisseceerd met behulp van micropincetten. Eén pincet wordt gebruikt om de slice te stabiliseren, terwijl het andere wordt gebruikt om kleine sneden rond de RMS te maken totdat deze uit de slice is losgemaakt. De uitgesneden RMS wordt vervolgens in kleine stukjes van ongeveer 200 tot 500 micrometers in diameter gesneden.
In dit voorbeeld worden transplantaten voorbereid van muizen die het rode fluorescerende eiwit TD tomato glass tot expressie brengen. De schalen met gastheer-plakjes worden uit de incubator gehaald en onder een dissectiemicroscoop met zichtbaar licht geplaatst. Er wordt een kleine incisie gemaakt in het initiële segment van de RMS en met behulp van een pipetteerder uitgerust met een 20 µL tip wordt een enkel donor RMS-explantaat overgebracht naar de incisieplaats in de RMS van de gastheer.
Het explantaat wordt voorzichtig in de incisie geduwd om contact tussen de twee weefsels te vestigen. Om te zorgen dat dit contact stabiel is, worden de explanaten lichtjes tussen de plak en het nucleair arm membraan geduwd. De schaaltjes worden vervolgens gedurende ten minste één uur teruggeplaatst in de incubator om de secties op het membraan te laten hechten.
Neuroblasten zouden na ongeveer één tot twee uur vanuit het explantaat naar de RMS van de gastheer moeten migreren. Celmigratie kan het beste worden gevisualiseerd met behulp van 20x objectieven met een extra grote werkafstand. De weefselkweken worden vanuit de incubator overgebracht naar een bebroedingskamer op de microscoop.
Fluorescerende neuroblasten kunnen worden afgebeeld met intervallen variërend van nul tot 10 minuten, afhankelijk van het gewenste type analyse. Ons organotypische plakcultuurprotocol is de afgelopen jaren grondig getest en geoptimaliseerd voor consistentie in migratiepatroon en oriëntatie in de RMS. In dit voorbeeld onthult de analyse van cellen die vanuit het explantaat migreren, verkregen uit muizen waarin TD tomato wordt tot expressie gebracht onder de nestine-promotor, een sterk georiënteerde en snelle migratie naar de gast-RMS.
Hoge vergroting. Time-lapse-analyse toont een uitstekende resolutie van de volledige lengte van een migrerende neuroblast tijdens een beeldsessie van 20 minuten. Zodra de beeldvorming is voltooid, kunnen de coupes worden gefixeerd met ijskoud en vers bereid 4% paraformaldehyde, en immunostained voor verschillende componenten van de migratiestroom.
In dit geval worden GFAP-positieve astrocyten in blauw en CD 31-positieve bloedvaten in groen weergegeven met behulp van fluorescente immunohistochemie; een analyse bij hoge vergroting van coupes gekleurd voor de cytoskeletale eiwitten actine in blauw en tubuline in groen onthult een niet-uniforme expressie van deze componenten door een cel tijdens de migratie. Ons protocol brengt enkele uitdagingen met zich mee die geduld, oefening en tijdsinvestering vereisen voor zowel de voorbereiding als de analyse van uw resultaten.
Hier zijn enkele nuttige suggesties die u zullen helpen om de beste resultaten uit uw experimenten te halen. Op basis van onze ervaring leveren muizen in de leeftijdscategorie P1 tot P10 de beste resultaten. Het matchen van de leeftijd tussen donor- en recipientenhersenen verbetert bovendien de reproduceerbaarheid van de experimenten.
Omdat de meeste reagentia en kweekschaaltjes vers moeten worden bereid, vereist onze slice-assay enkele uren aan ononderbroken preparatie en beeldvorming op één dag. Zodra de hersenen zijn geoogst, moeten de daaropvolgende stappen zo snel mogelijk worden uitgevoerd. Tussen de decapitatie en de bereiding van de slices moeten alle stappen op ijs worden uitgevoerd, met koude reagentia, en moet de manipulatie van het weefsel tot een minimum worden beperkt om anatomische verstoringen te voorkomen.
De instrumenten die voor deze dissecties worden gebruikt, moeten steriel zijn en uitsluitend worden gereserveerd voor manipulaties aan levend weefsel. Gebruik nooit instrumenten die in contact zijn geweest met fixatiemiddelen zoals formaldehyde. De plakjes zijn over het algemeen tot 36 uur levensvatbaar, waarbij tussen 24 en 36 uur een zichtbare afname in migratie, snelheid en oriëntatie optreedt.
Houd rekening met deze beperking bij het plannen van uw experimenten en analyses.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een organotypische slice-assay die is geoptimaliseerd voor de postnatale hersenen en high-resolution time-lapse imaging van neuroblastmigratie in de rostrale migratiestroom. De methode maakt de visualisatie van migrerende neuroblasten in de postnatale hersenen mogelijk via weefselcross-transplantatie tussen organotypische hersenslices van muizen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Neurobiologie
- Celmigratie
Achtergrond
- Organotypische slice-assays zijn krachtige instrumenten voor het bestuderen van neuronale migratie.
- De rostrale migratiestroom is cruciaal voor het begrijpen van neurogenese in de postnatale hersenen.
- Beeldtechnieken met een hoge resolutie verbeteren de observatie van het gedrag van neuroblasten.
- Deze studie richt zich op de postnatale hersenen, die minder zijn onderzocht in vergelijking met embryonale stadia.
Doel van de studie
- Het optimaliseren van een organotypische plak-assay voor de postnatale hersenen.
- Het onderzoeken van de factoren die de neuronale migratie in de rostrale migratiestroom beïnvloeden.
- Het visualiseren van neuroblast-migratie met behulp van geavanceerde beeldvormingstechnieken.
Gebruikte methoden
- Organotypische coupespreparatie van postnatale muizenhersenen.
- Weefselkruistransplantatie tussen hersencoupes.
- Hoge-resolutie time-lapse beeldvorming.
- Analyse van migratiepatronen van neuroblasten.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle visualisatie van neuroblastmigratie in de postnatale hersenen.
- Demonstratie van de effectiviteit van de organotypische slice-assay.
- Inzichten in de dynamiek van neuronale migratie.
- Potentiële implicaties voor het begrijpen van neurodevelopmentele processen.
Conclusies
- De organotypische plak-assay is een waardevolle methode voor het bestuderen van neuroblastmigratie.
- Deze benadering kan leiden tot een beter begrip van de postnatale hersenontwikkeling.
- Toekomstige studies kunnen voortbouwen op deze bevindingen om therapeutische wegen te verkennen.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor executives
Deze organotypische slice-assay maakt high-resolution time-lapse imaging van neuronale migratie in de postnatale hersenen mogelijk, waardoor een fysiologisch relevant systeem ontstaat om de celautonome en niet-autonome regulatie van de beweging van neuroblasten te evalueren. Door cross-transplantatiebenaderingen vanuit verschillende genetische achtergronden te ondersteunen, faciliteert de assay doelvalidatie en mechanistische risicoreductie in de vroege ontdekkingsfase. Het biedt voorspellend vertrouwen bij het prioriteren van therapeutische kandidaten die invloed hebben op neuronale migratiepaden bij neuro-ontwikkelingsstoornissen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door de georiënteerde en snelle migratie van neuroblasten in de rostrale migratiestroom te visualiseren onder nagenoeg fysiologische extracellulaire condities.
- Operationele waarde: Maakt functionele targetvalidatie mogelijk via kwantitatieve beoordeling van de migratiesnelheid, oriëntatie en het patroon als reactie op genetische of farmacologische perturbaties.
- Predictieve waarde: Ondersteunt de triage van portfolio's door meetbare, reproduceerbare resultaten te leveren die correleren met biologische activiteit in een ziekterevlevant systeem.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream screening door uniforme extracellulaire condities te handhaven die de in vivo omgeving voor migrerende neuroblasten nabootsen.
- Operationele waarde: Levert gestandaardiseerde, reproduceerbare preparaten met minimale manipulatie, waardoor variabiliteit in de resultaten van time-lapse imaging wordt verminderd.
- Schaalbaarheid: Ondersteunt hergebruik van het platform over meerdere experimentele condities, wat een consistente vergelijking van migratie-fenotypen mogelijk maakt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziektebeelden: Modelleert postnatale neurogenese-domeinen — de subependymale zone, de rostrale migratiestroom en de bulbus olfactorius — om mechanismen te bestuderen die direct toepasbaar zijn op mechanismen van neurodevelopmentele stoornissen.
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen ontdekking en preklinische validatie door een ziekterelevant systeem te bieden waarin migratiedynamiek longitudinaal kan worden gemonitord.
- Risico-gecorrigeerde vooruitgang: Informeert go/no-go-beslissingen door niet-uniforme expressie van cytoskeletale eiwitten tijdens migratie bloot te leggen, wat potentiële off-target effecten op het cellulaire mechanisme benadrukt.
Integratie van Pipeline & Workflow
De assay past binnen het ontdekkingscontinuüm van het testen van doelwit-hypothesen via lead-identificatie tot preklinische validatie, in het bijzonder voor modifiers van neuronale migratie tijdens de postnatale hersenontwikkeling.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en padverduidelijking door directe observatie van neuroblastmigratie in reactie op experimentele variabelen mogelijk te maken.
- Screening: Zorgt voor assay-gereedheid via gestandaardiseerde slice-preparatie en transplantatie, wat leidt tot kwantitatieve output met betrekking tot migratietraject en snelheid.
- Analytics: Genereert time-lapsegegevens met een hoge resolutie en immunohistochemische read-outs, waardoor teams condities kunnen vergelijken op basis van migratie-integriteit en cytoskeletdynamiek.
- Translationeel Onderzoek: Sluit aan bij preklinisch werk door een ziekterelevante systeemmodellering waarbij neuronale migratie een sleutelproces is in de pathofysiologie.
- Enterprise Hergebruik: Fungeert als een herbruikbare capaciteit over projecten heen, waardoor redundante modelontwikkeling wordt verminderd en cross-studievergelijking van migratie-fenotypes mogelijk wordt.
Operationele impact en impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen door mechanistische ambiguïteit in neurale migratie-assays te verminderen via directe, hoge-resolutie visualisatie.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie en reproduceerbaarheid via geoptimaliseerde protocollen voor slice-culturen en minimale weefselhandtering.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door vroege risicoreductie van targets die de migratie beïnvloeden, waardoor faalrisico's in een laat stadium door onvoorziene biologische effecten worden verminderd.
- Impact op de portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering door kwantitatieve, op imaging gebaseerde eindpunten te leveren die beslissingen over verdere ontwikkeling in neuro-ontwikkelingspipelines informeren.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in postnatale hersensectie, vibratiesectie en steriele weefselverwerking om de levensvatbaarheid van de coupes te behouden.
- Is afhankelijk van fluorescentiemicroscopie met objectieven met een extra lange werkafstand en omgevingsbeheersing voor time-lapse imaging.
- Maakt cross-team standaardisatie van coupepreparatie, transplantatie en imaging-timing noodzakelijk om reproduceerbare migratie-uitkomsten te garanderen.
- Omvat overwegingen voor aanpassing bij het toepassen van de assay op verschillende genetische achtergronden of ziektemodellen, met name met betrekking tot het koppelen van donor en ontvanger op basis van leeftijd.
- Wordt beperkt door een levensvatbaarheid van de coupes tot maximaal 36 uur, waarbij de migratiesnelheid en oriëntatie na 24 uur afnemen, waardoor de experimenten op dezelfde dag voltooid moeten worden.
