Heterokaryon Techniek voor de analyse van celtype-specifieke lokalisatie

Het algemene doel van deze procedure is om de beweging van eiwitten te volgen door een enkel eiwit dat voorzien is van twee verschillende fluorforen te tot expressie te brengen in twee afzonderlijke cellijnen en deze cellijnen vervolgens met elkaar te fuseren. Dit wordt bereikt door eerst plasmiden die het gen van belang bevatten, gefuseerd aan één van de twee verschillende fluor-eiwitgenen, te transfecteren in twee afzonderlijke celtypen. De tweede stap van de procedure is om de cellen met elkaar te mengen en elk celtype de tijd te geven om eiwitten op te hopen.

De derde stap van de procedure is het remmen van de eiwitsynthese, waarna de cellen worden gefuseerd met behulp van polyethyleenglycol. De laatste stap van de procedure is het visualiseren van de eiwitlokalisatie via fluorescentiemicroscopie. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die via fluorescentiemicroscopie wijzigingen in de eiwitlokalisatie of het transportgedrag aantonen.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van de cancerbiologie, zoals de manier waarop discrete eiwitfuncties en -gedragingen veranderen wanneer cellen transformeren. Hoewel deze methode inzicht kan bieden in veranderingen die specifiek zijn voor getransformeerde cellen, kan ze ook worden toegepast in andere studies, zoals celdifferentiatie, ontwikkelingsbiologie en celsignalering.

Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite ondervinden, omdat optimalisatie van zowel de transfectiecondities als de fusiecondities vereist zal zijn voor elk verschillend celtype. De eerste methode die in dit protocol wordt gedemonstreerd voor de introductie van plasmide-DNA in cellen is de NU Nuclear Affection-methode; hierbij worden Lonza nuclear effector-oplossing gebruikt om cellen die onlangs zijn gepassaged en zich in de logaritmische groeifase bevinden, gewassen met fosfaatgebufferde zoutoplossing PBS en geoogst door trypsinisatie. Zodra de cellen hun adhesie hebben verloren, dient de trypsine te worden geneutraliseerd door toevoeging van serumbevattend medium, waarna de cellen worden verzameld door centrifugatie bij 1500 G gedurende vijf minuten terwijl de cellen worden gecentrifugeerd.

Voeg in de weefselkweekkap gesteriliseerde dekglasjes toe aan een six-well plaat en pipetteer vervolgens 1,5 milliliters compleet kweekmedium in elke well. Dek de plaat af en plaats deze in de celkweekincubator om te equilibreren.

Verplaats de buisjes na centrifugatie naar de zuurkast, aspireer het supernatant en resuspendeer de celpellets in een minimaal volume PBS. Tel vervolgens de cellen en verdeel het volume van de celsuspensie over steriele microcentrifugebuisjes. Dit levert ongeveer 5 × 10⁵ cellen per monster op; centrifugeer opnieuw bij 1500 G gedurende vijf minuten.

Zodra de centrifugatie is voltooid, plaatst u de buisjes in de celkweekkap, aspireert u de SNA en resuspendeert u deze zorgvuldig. Suspendeer de cellen in elk buisje met 100 µL nucleaire effectoroplossing op kamertemperatuur. Voeg vervolgens vijf µg plasmagedna toe aan elk monster en breng het monster over naar een nucleaire effector Q vete en dek dit af.

Zorg ervoor dat er geen luchtbellen ontstaan. Plaats de sample qve in de Q vet houder. Selecteer het juiste programma voor de nucleaire effector en start dit.

Het selecteren van het meest geschikte programma kan voorafgaand testen vereisen om de optimale transfectie-efficiëntie met minimale mortaliteit vast te stellen. Zaai vervolgens de cellen in de zes-wellplaat, óf als gemengde populaties, óf afzonderlijk als controles. Plaats de plaat terug in de incubator en laat de cellen 12 uur herstellen.

De tweede methode die wordt gedemonstreerd voor transiënte expressie van plasmiden is transfectie met kagen affecting reagent. Voeg om te beginnen 0,8 µg van elk plasmide-DNA-monster toe aan 200 µL EC-buffer in een steriele centrifugebuis. Voeg vervolgens 6,4 µL enhancer-reagens toe aan elk monster.

Meng kort door tegen de wand van de buis te tikken en laat twee minuten incuberen bij kamertemperatuur. Voeg na deze korte incubatie 20 µL van het beïnvloedende reagens toe aan elk monster. Meng elke buis door tegen de wand te tikken en laat 15 minuten incuberen bij kamertemperatuur.

Bereid tijdens de incubatie de twee cellijnen voor die in het experiment worden gebruikt. Voor transfectie moeten de cellen onlangs zijn gepassaged en in logaritmische groei zijn bij een confluentie van ongeveer 80%. Was de cellen eenmaal met PBS en voeg 1,5 milliliter vers DMEM met 10% FBS weer toe.

Nu de DNA-transfectiereagentia 15 minuten hebben geïncubeerd, voegt u 1,2 milliliters DMEM plus 10%FBS medium toe aan elk monster, mengt u dit door te pipetteren en brengt u onmiddellijk druppelsgewijs ongeveer 700 microliters van de complexen over naar elk van de twee putjes in de zes-wellplaat. Meng door de plaat te zwenken. Laat de cellen ten minste drie uur transfecteren in de incubator in de celkweekkap; indien gewenst plaatst u één gesteriliseerd dekglas per putje in de zes-wellplaat.

Gecoate dekglasjes kunnen worden gebruikt om de celadhesie te verbeteren. Was vervolgens de getransfecteerde cellen tweemaal met PBS en oogst de cellen door minimale trypsinisatie. Dit wordt bereikt door 100 µL trypsinoplossing aan elke put toe te voegen en de plaat te schudden om volledige dekking te garanderen.

Zuig vervolgens onmiddellijk het resterende trypsine af. Neutraliseer het overgebleven trypsine door de cellen opnieuw te suspenderen in 1,5 milliliters vers DMEM met 10%FBS en zaai de cellen uit, ofwel als gemengde populaties of afzonderlijk als controles. Laat de cellen in de zeswellsplaat met dekglasjes 12 uur herstellen in de celkweekincubator.

Ongeacht de transfectiemethode is de procedure voor het genereren van hetero carry-infusies hetzelfde. Verwijder na transfectie het kweekmedium uit de wells en was de cellen tweemaal met PBS. Vervolgens wordt aanbevolen de cellen te behandelen met cyclo heximide om verdere eiwitsynthese te remmen.

Voeg cycloheximide toe aan het kweekmedium in een concentratie van 100 µg/mL om de cellen te bedekken en incubeer gedurende twee uur in de celkweekincubator. Haal de cellen na twee uur uit de incubator en was de cellen tweemaal met PBS. Om de fusie te initiëren, bedek de cellen met een oplossing van 50% polyethyleenglycol 1000 in serumvrij DMEM en incubeer gedurende 125 seconden.

Verwijder bij kamertemperatuur de PEG-oplossing en was de cellen met PBS om resterende PEG te verwijderen. Voeg vervolgens twee milliliters DMEM plus 10% FBS toe, opgewarmd tot 37 °C. Incubeer de cellen gedurende 18 tot 24 uur in de celcultuurbroedmachine.

Haal na de incubatie van 18 tot 24 uur de plaat uit de incubator en was de cellen twee keer met PBS. Pipetteer vervolgens één milliliter 4% paraformaldehyde in PBS in elke put en agiteer voorzichtig gedurende 15 minuten.

Bereid tijdens de incubatie de microscopiepreparaten voor door één druppel monteermiddel met dpi toe te voegen. Was vervolgens de gefixeerde cellen tweemaal met PBS en verwijder voorzichtig elk dekglas met een kleine pincet. Absorbeer resterende PBS met een stukje weefsel voordat het met de celzijde naar beneden op een microscopiepreparaat met monteermiddel plus tappi wordt geplaatst.

Verwijder het overtollige medium voor het inklaren van de objectglasplaat met absorberend papier en kit de randen van de dekglasplaatjes af. Met nagellak kunnen de cellen nu worden gevisualiseerd met behulp van confocale of epi-fluorescentiemicroscopie. In dit stroomschema wordt de hetero-methode voor de analyse van celtypspecifieke lokalisatie van eiwitten in drie basisstappen weergegeven.

Transfectie van het plasmide dat een fluorescent gelabeld eiwit-cel-fusieproduct tot expressie brengt met polyethyleenglycol 1000 en fluorescentiemicroscopie-imaging, zoals te zien is in deze epifluorescentiebeelden; primaire voorhuidfibroblasten, zelfgefuseerde controles die het GFP-gelabelde chicken anemia virus VP3-eiwit tot expressie brengen, vertonen primair een cytoplasmatische lokalisatie van het eiwit in de niet-kleincellige longcarcinoomlijn H1299. Zelfgefuseerde controles met hetzelfde VP3-eiwit gelabeld met DsRed vertonen primair een nucleaire lokalisatie. Heterofusie van de primaire voorhuidfibroblast en H1299-cellen resulteert in de introductie van getransformeerd celmateriaal in de primaire voorhuidfibroblast en veroorzaakt een verandering in de lokalisatie van GFP-gelabeld, uit primaire cellen afgeleid VP3 naar de nucleus.

Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat het succes sterk afhankelijk zal zijn van de transfectie-efficiëntie in de specifieke gebruikte celtypen, evenals van het optimaliseren van de fusiecondities voor deze specifieke cellen. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals flip en frap, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden met betrekking tot de real-time analyse van lokalisatiedynamiek. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe celtype-specifieke eiwitlokalisaties kunnen worden beoordeeld door fluorescentie-gelabelde eiwitten te introduceren en celfusies te genereren.