Name: Heterokaryon Techniek voor de analyse van celtype-specifieke lokalisatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-11T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Leer de heterokaryon-techniek voor celtype-specifieke eiwitlokalisatie en nucleocytoplasmatisch transport met fluorescentie-microscopie. Deze methode biedt inzicht in kankerbiologie en celgedrag.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We willen graag het Worcester Polytechnic Institute departement chemie en biochemie bedanken voor financiering.

1. Transfectie van cellijnen Transfectie Methode 1 (Lonza Nucleofection voor een grotere primaire cel transfectie-efficiëntie) <ol><li> De cellen moeten zijn van de recente passage en in de log-fase voorafgaand aan de groei van transfectie. Was de cellen in fosfaatbuffer gebufferde zoutoplossing (PBS) en oogst cellen door behandeling met trypsine. </li><li> Verzamel cellen door centrifugeren bij 1500 xg gedurende 5 minuten. </li><li> Voeg gesteriliseerd dekglaasjes tot een 6-wells plaat. Dekglaasjes kunnen worden bekleed voor een betere celadhesie. Plaats 1,5 ml van de cultuur media (in dit geval Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM), 10% foetaal bovine serum (FBS)) in elk putje en evenwicht de media in de incubator. </li><li> Oogst de cellen door behandeling met trypsine en resuspendeer in een minimaal volume van fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). </li><li> Tel het aantal cellen en centrifuge de juiste hoeveelheid resuspensie tot ~ 5x10 5 cellen per monster. </li><li> Zorgvuldig Resuspendeer de cellen in 100 ul kamertemperatuur Nucleofector oplossing per monster. </li><li> Combineer 100 pi celsuspensie met 5 ug plasmide DNA en breng het monster op een Nucleofector Cuvette zorg dat u luchtbellen bevatten. </li><li> Selecteer de juiste Nucleofector Program (dit kan uit een vorige test nodig hebben om een ​​optimale transfectie-efficiëntie te stellen met minimale mortaliteit). </li><li> Plaats de cuvet met de cel / DNA suspensie in de Nucleofector cuvettehouder en beginnen met het gekozen programma. </li><li> Na voltooiing, verwijder de cuvette en voeg ~ 500 pi van de pre-evenwicht gebracht cultuur media om het (uit de 6-wells plaat). </li><li> Onmiddellijk overdracht het monster in de 6-well plaat met uiteindelijk volume van 1,5 ml per putje. De cellen moeten worden uitgeplaat in een mix van bevolkingsgroepen of afzonderlijk, voor de controles. </li></ol> Transfectie Methode 2 (Qiagen Effectene transfectie voor cellijnen) <ol><li> Bereid transfectie complexen met behulp van de Qiagen Effectene Reagens door eerst toe te voegen 0,8 ug van elk plasmide DNA monster 200 pi EG-buffer. </li><li> Voeg 6,4 ul enhancer reagens aan elk monster, kort mengen door flicking de buis, en incubeer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Voeg 20 ui Effectene reagens aan elk monster, meng door flicking de buis, en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Tijdens deze incubatie, bereiden de twee cellijnen van belang zijn voor transfectie. Was onlangs gepasseerde cellen (&lt;80% confluentie) een keer in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Voeg weer 1,5 mL verse verwarmd en in evenwicht groei medium (in dit geval Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM), 10% foetaal bovine serum (FBS)). </li><li> Zodra de transfectie complexen hebben geïncubeerd gedurende 15 minuten, overdracht 1,2 ml van media aan elk monster. Meng door pipetteren, en meteen ~ 700 pi van de complexen over te dragen aan elk van de twee putten in de 6-wells plaat. Voeg druppelsgewijs, en meng voorzichtig door werveling van de plaat. Laat cellen om te transfecteren voor minimaal 3 uur (kan variëren met celtype). </li><li> Voeg gesteriliseerd dekglaasjes tot een nieuwe 6-well plaat. Dekglaasjes kunnen worden bekleed voor een betere celadhesie. </li><li> Nadat de cellen zijn getransfecteerd, tweemaal wassen cellen met PBS en oogsten van de cellen door minimale trysinization door het toevoegen van circa 100 ul trypsine oplossing voor elk putje, kort schudden van de plaat om volledig vacht elk putje, en onmiddellijk opzuigen uit de trypsine. Zodra de cellen hebben opgeheven, toe te voegen 1,5 ml vers medium. </li><li> Op dit punt moet cellen worden uitgeplaat in een gemengde of gescheiden populaties (voor de controles) op het steriele dekglaasjes. </li><li> Laat cellen te herstellen gedurende 12 uur. </li></ol> 2. Celfusie <ol><li> Verwijder de cultuur media uit de cellen en was tweemaal met PBS. </li><li> Op dit punt, is het aanbevolen om de cellen met cycloheximide (100 ug / mL) te trakteren op eiwitsynthese te remmen. Laat de cellen om incubeer gedurende 2 uur en vervolgens twee keer was de cellen met PBS. </li><li> Zekering cellen door ze bloot te stellen aan een oplossing van 50% polyethyleenglycol 1000 (PEG 1000) in serum-vrij DMEM voor 125 seconden bij kamertemperatuur. </li><li> Was de cellen met PBS om de PEG 1000 oplossing te verwijderen, en 2 ml vers verwarmd en in evenwicht media toe te voegen. </li><li> Laat cellen om incuberen voor 18 - 24 uur. </li></ol> Fluorescentiemicroscopie <ol><li> Verwijder de cultuur media, en twee keer was de cellen in PBS. </li><li> Fix-cellen door het toevoegen van 1 ml van een 4% paraformaldehyde oplossing (in PBS) aan elk putje. Schud voorzichtig gedurende 15 minuten. </li><li> Was de vaste cellen twee keer in PBS. </li><li> Voorzichtig de dekglaasjes te verwijderen van de plaat, lont overtollige PBS. Omkeren op objectglaasjes geladen met een druppel van de montage medium (90% glycerol, 100mm Tris pH 7,5, 2% DABCO (1,4-diazabicoyclo-octaan) met DAPI (4 ',6-diamidino-2-phenylindole). </li><li> Verwijder overtollige montage medium van de dia's, en afdichting cover glijdt met nagellak. </li><li> Visualiseer de cellen via confocale microscopie of epifluorescentie. </li></ol> 3. Representatieve resultaten Figuur 2 toont een voorbeeld heterokaryon experiment met behulp van primaire fibroblasten en H1299 niet-kleincellig longcarcinoom cellen. Het eiwit van belang in dit experiment (kippen anemia virus-VP3) toont in de eerste plaats cytoplasmatische lokalisatie in de primaire celtypen en de nucleaire lokalisatie in getransformeerde celtypes zoals gevisualiseerd door epifluorescentie microscopie. Het eiwit wordt uitgedrukt als een fusie van beide GFP (pEGFP-N1 vector, Clontech) in primaire voorhuid fibroblasten (PFF) of DsRed (DsRed-N1 vector, Clontech) in de H1299-cellen. Controlemonsters met betrekking tot self-fusies (bovenste twee rijen) weer te geven meerkernige cellen met geen verandering in steady-state lokalisatie patronen. Dergelijke veranderingen zouden anders voordoen als gevolg van gevoeligheid voor fusie voorwaarden of de vorming van syncitia. Heterokaryon fusies (onderste rij) aan te tonen nucleaire ingang van de GFP-gefuseerde primaire cel afkomstige eiwitten en colocalization met de DsRed-gefuseerde eiwit in reactie op de introductie van de getransformeerde cel materiaal. Het getoonde voorbeeld is een relatief zeldzame heterokaryon fusie als gevolg van slechts twee cellen, een van elk type, zoals blijkt uit de aanwezigheid van beide fluoroprotein signalen. In aanvulling op het opsporen van deze vormen van lokalisatie overgangen, kan nucleocytoplasmic pendelen activiteit gemakkelijk worden gedetecteerd door de aanwezigheid van een fluorofoor in beide kernen. Dit type van de bepaling is duidelijk bij de behandeling van 01:01 cel fusies en zou afhangen van de remming van de vertaling. <img src="/files/ftp_upload/2488/2488fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Stroomschema van de heterokaryon methode met primaire fibroblasten en H1299 niet-kleincellig longcarcinoom cellen. Gen van belang is gekloond om een in-frame fusie produceren om een van de twee fluorescerende proteïne genen. Cellijnen zijn dan transient getransfecteerd met de aanleg en liet zich te herstellen. Heterokaryon vorming wordt veroorzaakt door korte behandeling met polyethyleenglycol (PEG), gevolgd door verdere incubatie. Ten slotte wordt de sub-cellulaire lokalisatie van het eiwit van belang waargenomen met behulp van verschillende vormen van fluorescentie microscopie. <img src="/files/ftp_upload/2488/2488fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Nucleocytoplasmic mensenhandel en shuttling activiteit van de kippen anemia virus VP3 eiwit gevisualiseerd door heterokaryon fusie. Bovenste rij: Representatieve beelden van zelf-gefuseerde H1299 cellen die DsRed-VP3 Middelste rij:.. Representatieve epifluorescentie beelden van primaire voorhuid fibroblast cellen (PFF) uitdrukken GFP-VP3 na PEG fusion Onderste rij: Heterokaryon fusie van PFF en H1299-cellen. Geel geeft colocalization van GFP en DsRed signalen. Cellen werden afgebeeld met behulp van een Leica AF6000E fluorescentie microscoop en Leica imaging software.

<ol><li>Belaya, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLIPing+heterokaryons+to+analyze+nucleo-cytoplasmic+shuttling+of+yeast+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">FLIPing heterokaryons to analyze nucleo-cytoplasmic shuttling of yeast proteins.</a> RNA. 12, 921-930 (2006).</li>
<li>Bhaumik, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+target+of+a+transcriptional+activator+revealed+by+fluorescence+resonance+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">In vivo target of a transcriptional activator revealed by fluorescence resonance energy transfer.</a> Genes Dev. 18, 333-343 (2004).</li>
<li>Cohen, H. R., Panning, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XIST+RNA+exhibits+nuclear+retention+and+exhibits+reduced+association+with+the+export+factor+TAP%2FNXF1%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">XIST RNA exhibits nuclear retention and exhibits reduced association with the export factor TAP/NXF1.</a> Chromosoma. 116, 373-383 (2007).</li>
<li>Gao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dapper1+is+a+nucleoplasmic+shuttling+protein+that+negatively+modulates+Wnt+signaling+in+the+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Dapper1 is a nucleoplasmic shuttling protein that negatively modulates Wnt signaling in the nucleus.</a> J. Biol. Chem. 51, 35679-3588 (2008).</li>
<li>Grespin, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thyroid+Hormone+Receptor+%CE%B11+Follows+a+Cooperative+CRM1%2FCalreticulin-mediated+Nuclear+Export+Pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Thyroid Hormone Receptor α1 Follows a Cooperative CRM1/Calreticulin-mediated Nuclear Export Pathway.</a> J. Biol. Chem. 283, 25576-25588 (2008).</li>
<li>Heilman, D. W., Teodoro, J. G., Green, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptin+Nucleocytoplasmic+Shuttling+Is+Required+for+Cell+Type-Specific+Localization%2C+Apoptosis%2C+and+Recruitment+of+the+Anaphase-Promoting+Complex%2FCyclosome+to+PML+Bodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virology%22%5BJournal%5D)">Apoptin Nucleocytoplasmic Shuttling Is Required for Cell Type-Specific Localization, Apoptosis, and Recruitment of the Anaphase-Promoting Complex/Cyclosome to PML Bodies.</a> J. Virology. 80, 7535-7545 (2006).</li>
<li>Jeffries, S., Capobianco, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neoplastic+transformation+by+Notch+requires+nuclear+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Neoplastic transformation by Notch requires nuclear localization.</a> Mol Cell Biol. 20, 3928-3941 (2000).</li>
<li>Keaton, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleocytoplasmic+trafficking+of+G2%2FM+regulators+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Nucleocytoplasmic trafficking of G2/M regulators in yeast.</a> Mol. Biol. Cell. 19, 4006-4018 (2008).</li>
<li>Ling, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear-Cytoplasmic+Shuttling+Is+Not+Required+for+the+Epstein-Barr+Virus+EBNA-LP+Transcriptional+Coactivation+Function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virology%22%5BJournal%5D)">Nuclear-Cytoplasmic Shuttling Is Not Required for the Epstein-Barr Virus EBNA-LP Transcriptional Coactivation Function.</a> J. Virology. 83, 7109-7116 (2009).</li>
<li>Lin, X. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RXR%CE%B1+acts+as+a+carrier+for+TR3+nuclear+export+in+a+9-cis+retinoic+acid-dependent+manner+in+gastric+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">RXRα acts as a carrier for TR3 nuclear export in a 9-cis retinoic acid-dependent manner in gastric cancer cells.</a> J. Cell Science. 117, 5609-5621 (2004).</li>
<li>Vissinga, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+Export+of+NBN+Is+Required+for+Normal+Cellular+Responses+to+Radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nuclear Export of NBN Is Required for Normal Cellular Responses to Radiation.</a> Mol Cell Biol. 29, 1000-1006 (2009).</li>
<li>Zimmerman, R. S., Rosenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+p19Arf+localization+accompany+apoptotic+crisis+during+pre-B-cell+transformation+by+Abelson+murine+leukemia+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Changes in p19Arf localization accompany apoptotic crisis during pre-B-cell transformation by Abelson murine leukemia virus.</a> J. Virol. 82, 8383-8391 (2008).</li>
</ol>

De hier gepresenteerde heterokaryon protocol biedt een efficiënte en eenvoudig interpreteerbaar methode voor de karakterisering van celtype-specifieke lokalisatie gedrag en nucleocytoplasmic shuttling activiteit. Deze methode maakt gebruik van de gevoeligheid van fluorescentie analyse, alsmede de mogelijkheid om beeld levende cellen en het uitvoeren van studies van eiwitten dynamiek. De techniek is eenvoudig aan te passen voor veel verschillende celtypes en vatbaar is voor zowel live als vaste cell imaging. Zo kan bijvoorbeeld omgekeerde fluorescentie microscopie gebruikt worden voor live beeldvorming en time lapse video vast te leggen. Daarentegen kan gemonteerd cellen worden gebruikt in een van beide epifluorescentie microscopie voor de bepaling van de steady-state lokalisaties of meer gedetailleerde confocale beeldvorming van discrete lokalisaties. Bovendien kunnen technieken, zoals fluorescentie herstel na fotobleken (FRAP), of fluorescentie verlies in fotobleken (FLIP) worden gebruikt in de bepaling van de lokalisatie kinetiek 1. De integratie van alternatieve fluoroforen in het protocol mogelijk zou maken eiwit interactie experimenten zoals fluorescentie resonantie energie-overdracht (FRET) uit te voeren in concert 2. Verschillende remmers van cellulaire mensenhandel, zoals leptomycin B of dominant negatieve Ran GTPase constructen kunnen worden gebruikt om de afhankelijkheid van bepaalde importeren of exporteren paden 5,6,9 vast te stellen. <ul><li> In bepaalde experimenten met pendelen activiteit, moet erop worden gelet dat lokalisatie effecten als gevolg van de synthese van nieuwe eiwitten te voorkomen. In deze gevallen moet vertaling remmers of beperkte tijdstippen worden gebruikt. Echter, artefacten te wijten aan translationeel remming blijft een mogelijkheid. Cel fusies met een van elk celtype zijn het meest gewenst zijn voor duidelijke interpretatie van shuttling en lokalisatie gedrag. Optimalisatie van het aantal cellen en fusie voorwaarden (timing en concentratie) kan nodig zijn om een ​​dergelijke gunstige 1:01 fusie evenementen te promoten. </li><li> Het is belangrijk op te merken dat het optimaliseren van bepaalde stappen in het protocol noodzakelijk zijn, afhankelijk van de specifieke gebruikte cel types. Aspecten in de experimentele procedure, zoals fusie-efficiëntie, transfectie-efficiëntie, en de levensvatbaarheid na fusie kan sterk variëren tussen celtypen. In het bijzonder, kunnen primaire celtypen een uitdaging te beheren als gevolg van complexe kweekomstandigheden en lage transfectie efficiëntie. Het gebruik van technologieën zoals de Lonza Nucleofector apparaat kan zorgen voor een snelle verwerking van de cellen en sterk toegenomen transfectie efficiëntie. Bovendien, elektroporatie methoden zorgen voor een gemakkelijke overdracht van cellen in suspensie tot de fusie stappen die volgen. </li></ul>

<table><tbody><tr><td>Effectene-reagens</td><td>Qiagen</td><td>301425</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3023602</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s modified Eagle&amp;rsquo;s medium (DMEM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30243FS</td><td>Hoge glucoseconcentratie</td></tr><tr><td>paraformaldehyde</td><td>Fisher Scientific</td><td>O4042-500</td><td></td></tr><tr><td>4&amp;rsquo;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone serum (foetaal rundenserum)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SH3008803HI</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 6-wells platen</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1B</td><td></td></tr><tr><td>Polyethyleenglycol 1000</td><td>Fisher Scientific</td><td>528875-25GM</td><td></td></tr><tr><td>Dekglasjes</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-85</td><td></td></tr><tr><td>DABCO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2522-25G</td><td></td></tr><tr><td>Nucleofector HDF-kit</td><td>Lonza Inc.</td><td>VPD-1001</td><td></td></tr></tbody></table>

heterokaryon techniek voor de analyse van celtype-specifieke lokalisatie

Heterokaryon Technique for Analysis of Cell Type-specific Localization

Een groot aantal van de eiwitten worden gereguleerd door subcellulaire handel of nucleocytolasmic shuttling. Deze eiwitten vertonen een divers scala aan cellulaire functies, waaronder nucleaire import / export van RNA en eiwitten, transcriptionele regulatie, en apoptose. Interessant is dat de belangrijkste cellulaire reorganisaties waaronder de celdeling, differentiatie en transformatie, vaak sprake van dergelijke activiteiten 3,4,8,10. De gedetailleerde studie van deze eiwitten en hun regulerende mechanismen kan een uitdaging zijn als de stimulatie van deze lokalisatie veranderingen kunnen worden ongrijpbaar, en de bewegingen zelf kan heel dynamisch en moeilijk op te sporen. Studies met cellulaire oncogenese, bijvoorbeeld, blijven profiteren van het begrijpen van paden en eiwit activiteiten die verschillen tussen normale cellen en primaire getransformeerde cellen 6,7,11,12. As veel eiwitten tonen veranderd lokalisatie tijdens de transformatie of als gevolg van de transformatie, methodes om efficiënt te karakteriseren deze eiwitten en de wegen waaraan zij deelnemen staan ​​om het begrip van oncogenese en open nieuwe gebieden voor drug targeting te verbeteren. Hier presenteren we een methode voor de analyse van eiwit mensenhandel en pendelt activiteit tussen primaire en omgezette cellen van zoogdieren. Deze methode combineert de generatie van heterokaryon fusies met fluorescentie microscopie een flexibel protocol dat gebruikt kan worden om steady-state-of dynamische eiwit lokalisaties sporen te geven. Zoals weergegeven in figuur 1, zijn twee verschillende celtypen transient getransfecteerd met plasmide constructen met een fluoroprotein gen verbonden aan het gen van belang. Na expressie worden de cellen gefuseerd met behulp van polyethyleenglycol, en eiwit lokalisatie kan dan worden afgebeeld met behulp van verschillende methoden. Het protocol hier wordt gepresenteerd is een fundamentele benadering waarbij gespecialiseerde technieken kunnen worden toegevoegd.

Een flexibele en efficiënte methode voor de karakterisering van celtype-specifieke eiwit lokalisatie en nucleocytoplasmic pendelen wordt beschreven. Deze heterokaryon aanpak maakt gebruik van fluorescent gelabelde fusie-eiwitten om de afbeelding eiwit lokalisaties na celfusie. Het protocol vatbaar is voor steady-state lokalisaties of meer dynamische vaststellingen op basis van live-cell imaging.

Heterokaryon Techniek voor de analyse van celtype-specifieke lokalisatie

Een aanzienlijk aantal eiwitten wordt gereguleerd door subcellulair transport of nucleocytoplasmatische shuttling. Deze eiwitten vertonen een diverse reeks aan ...

Het algemene doel van deze procedure is om de beweging van eiwitten te volgen door een enkel eiwit dat voorzien is van twee verschillende fluorforen te tot expressie te brengen in twee afzonderlijke cellijnen en deze cellijnen vervolgens met elkaar te fuseren. Dit wordt bereikt door eerst plasmiden die het gen van belang bevatten, gefuseerd aan één van de twee verschillende fluor-eiwitgenen, te transfecteren in twee afzonderlijke celtypen. De tweede stap van de procedure is om de cellen met elkaar te mengen en elk celtype de tijd te geven om eiwitten op te hopen.De derde stap van de procedure is het remmen van de eiwitsynthese, waarna de cellen worden gefuseerd met behulp van polyethyleenglycol. De laatste stap van de procedure is het visualiseren van de eiwitlokalisatie via fluorescentiemicroscopie. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die via fluorescentiemicroscopie wijzigingen in de eiwitlokalisatie of het transportgedrag aantonen.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van de cancerbiologie, zoals de manier waarop discrete eiwitfuncties en -gedragingen veranderen wanneer cellen transformeren. Hoewel deze methode inzicht kan bieden in veranderingen die specifiek zijn voor getransformeerde cellen, kan ze ook worden toegepast in andere studies, zoals celdifferentiatie, ontwikkelingsbiologie en celsignalering.Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite ondervinden, omdat optimalisatie van zowel de transfectiecondities als de fusiecondities vereist zal zijn voor elk verschillend celtype. De eerste methode die in dit protocol wordt gedemonstreerd voor de introductie van plasmide-DNA in cellen is de NU Nuclear Affection-methode; hierbij worden Lonza nuclear effector-oplossing gebruikt om cellen die onlangs zijn gepassaged en zich in de logaritmische groeifase bevinden, gewassen met fosfaatgebufferde zoutoplossing PBS en geoogst door trypsinisatie. Zodra de cellen hun adhesie hebben verloren, dient de trypsine te worden geneutraliseerd door toevoeging van serumbevattend medium, waarna de cellen worden verzameld door centrifugatie bij 1500 G gedurende vijf minuten terwijl de cellen worden gecentrifugeerd.Voeg in de weefselkweekkap gesteriliseerde dekglasjes toe aan een six-well plaat en pipetteer vervolgens 1,5 milliliters compleet kweekmedium in elke well. Dek de plaat af en plaats deze in de celkweekincubator om te equilibreren.Verplaats de buisjes na centrifugatie naar de zuurkast, aspireer het supernatant en resuspendeer de celpellets in een minimaal volume PBS. Tel vervolgens de cellen en verdeel het volume van de celsuspensie over steriele microcentrifugebuisjes. Dit levert ongeveer 5 × 10⁵ cellen per monster op; centrifugeer opnieuw bij 1500 G gedurende vijf minuten.Zodra de centrifugatie is voltooid, plaatst u de buisjes in de celkweekkap, aspireert u de SNA en resuspendeert u deze zorgvuldig. Suspendeer de cellen in elk buisje met 100 µL nucleaire effectoroplossing op kamertemperatuur. Voeg vervolgens vijf µg plasmagedna toe aan elk monster en breng het monster over naar een nucleaire effector Q vete en dek dit af.Zorg ervoor dat er geen luchtbellen ontstaan. Plaats de sample qve in de Q vet houder. Selecteer het juiste programma voor de nucleaire effector en start dit.Het selecteren van het meest geschikte programma kan voorafgaand testen vereisen om de optimale transfectie-efficiëntie met minimale mortaliteit vast te stellen. Zaai vervolgens de cellen in de zes-wellplaat, óf als gemengde populaties, óf afzonderlijk als controles. Plaats de plaat terug in de incubator en laat de cellen 12 uur herstellen.De tweede methode die wordt gedemonstreerd voor transiënte expressie van plasmiden is transfectie met kagen affecting reagent. Voeg om te beginnen 0,8 µg van elk plasmide-DNA-monster toe aan 200 µL EC-buffer in een steriele centrifugebuis. Voeg vervolgens 6,4 µL enhancer-reagens toe aan elk monster.Meng kort door tegen de wand van de buis te tikken en laat twee minuten incuberen bij kamertemperatuur. Voeg na deze korte incubatie 20 µL van het beïnvloedende reagens toe aan elk monster. Meng elke buis door tegen de wand te tikken en laat 15 minuten incuberen bij kamertemperatuur.Bereid tijdens de incubatie de twee cellijnen voor die in het experiment worden gebruikt. Voor transfectie moeten de cellen onlangs zijn gepassaged en in logaritmische groei zijn bij een confluentie van ongeveer 80%. Was de cellen eenmaal met PBS en voeg 1,5 milliliter vers DMEM met 10% FBS weer toe.Nu de DNA-transfectiereagentia 15 minuten hebben geïncubeerd, voegt u 1,2 milliliters DMEM plus 10%FBS medium toe aan elk monster, mengt u dit door te pipetteren en brengt u onmiddellijk druppelsgewijs ongeveer 700 microliters van de complexen over naar elk van de twee putjes in de zes-wellplaat. Meng door de plaat te zwenken. Laat de cellen ten minste drie uur transfecteren in de incubator in de celkweekkap; indien gewenst plaatst u één gesteriliseerd dekglas per putje in de zes-wellplaat.Gecoate dekglasjes kunnen worden gebruikt om de celadhesie te verbeteren. Was vervolgens de getransfecteerde cellen tweemaal met PBS en oogst de cellen door minimale trypsinisatie. Dit wordt bereikt door 100 µL trypsinoplossing aan elke put toe te voegen en de plaat te schudden om volledige dekking te garanderen.Zuig vervolgens onmiddellijk het resterende trypsine af. Neutraliseer het overgebleven trypsine door de cellen opnieuw te suspenderen in 1,5 milliliters vers DMEM met 10%FBS en zaai de cellen uit, ofwel als gemengde populaties of afzonderlijk als controles. Laat de cellen in de zeswellsplaat met dekglasjes 12 uur herstellen in de celkweekincubator.Ongeacht de transfectiemethode is de procedure voor het genereren van hetero carry-infusies hetzelfde. Verwijder na transfectie het kweekmedium uit de wells en was de cellen tweemaal met PBS. Vervolgens wordt aanbevolen de cellen te behandelen met cyclo heximide om verdere eiwitsynthese te remmen.Voeg cycloheximide toe aan het kweekmedium in een concentratie van 100 µg/mL om de cellen te bedekken en incubeer gedurende twee uur in de celkweekincubator. Haal de cellen na twee uur uit de incubator en was de cellen tweemaal met PBS. Om de fusie te initiëren, bedek de cellen met een oplossing van 50% polyethyleenglycol 1000 in serumvrij DMEM en incubeer gedurende 125 seconden.Verwijder bij kamertemperatuur de PEG-oplossing en was de cellen met PBS om resterende PEG te verwijderen. Voeg vervolgens twee milliliters DMEM plus 10% FBS toe, opgewarmd tot 37 °C. Incubeer de cellen gedurende 18 tot 24 uur in de celcultuurbroedmachine.Haal na de incubatie van 18 tot 24 uur de plaat uit de incubator en was de cellen twee keer met PBS. Pipetteer vervolgens één milliliter 4% paraformaldehyde in PBS in elke put en agiteer voorzichtig gedurende 15 minuten.Bereid tijdens de incubatie de microscopiepreparaten voor door één druppel monteermiddel met dpi toe te voegen. Was vervolgens de gefixeerde cellen tweemaal met PBS en verwijder voorzichtig elk dekglas met een kleine pincet. Absorbeer resterende PBS met een stukje weefsel voordat het met de celzijde naar beneden op een microscopiepreparaat met monteermiddel plus tappi wordt geplaatst.Verwijder het overtollige medium voor het inklaren van de objectglasplaat met absorberend papier en kit de randen van de dekglasplaatjes af. Met nagellak kunnen de cellen nu worden gevisualiseerd met behulp van confocale of epi-fluorescentiemicroscopie. In dit stroomschema wordt de hetero-methode voor de analyse van celtypspecifieke lokalisatie van eiwitten in drie basisstappen weergegeven.Transfectie van het plasmide dat een fluorescent gelabeld eiwit-cel-fusieproduct tot expressie brengt met polyethyleenglycol 1000 en fluorescentiemicroscopie-imaging, zoals te zien is in deze epifluorescentiebeelden; primaire voorhuidfibroblasten, zelfgefuseerde controles die het GFP-gelabelde chicken anemia virus VP3-eiwit tot expressie brengen, vertonen primair een cytoplasmatische lokalisatie van het eiwit in de niet-kleincellige longcarcinoomlijn H1299. Zelfgefuseerde controles met hetzelfde VP3-eiwit gelabeld met DsRed vertonen primair een nucleaire lokalisatie. Heterofusie van de primaire voorhuidfibroblast en H1299-cellen resulteert in de introductie van getransformeerd celmateriaal in de primaire voorhuidfibroblast en veroorzaakt een verandering in de lokalisatie van GFP-gelabeld, uit primaire cellen afgeleid VP3 naar de nucleus.Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat het succes sterk afhankelijk zal zijn van de transfectie-efficiëntie in de specifieke gebruikte celtypen, evenals van het optimaliseren van de fusiecondities voor deze specifieke cellen. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals flip en frap, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden met betrekking tot de real-time analyse van lokalisatiedynamiek. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe celtype-specifieke eiwitlokalisaties kunnen worden beoordeeld door fluorescentie-gelabelde eiwitten te introduceren en celfusies te genereren.

heterokaryon-technique-for-analysis-of-cell-type-specific-localization

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

The video demonstrates a method for isolating intact nuclei from glial and stem cells in the mouse hippocampal dentate gyrus (DG). The DG tissue is mechanically dissociated in a cold homogenization buffer to release the nuclei. Tissue debris and other released organelles are discarded, and the nuclei are stained with a DNA stain and a fluorophore-conjugated antibody specific for the neuronal nuclear antigen (NeuN). Fluorescence-activated nuclei sorting is then employed to isolate the...

A Technique to Isolate Nuclei from Non-neuronal Cells in the Hippocampal Dentate Gyrus

We beschrijven een robuuste en veelzijdige protocol voor de analyse nucleaire architectuur door 3D DNA FISH met direct gelabelde fluorescerende probes.

Robuuste 3D DNA FISH behulp direct gemerkt Probes

Drosophila weefsels bevatten vaak een heterogeen mengsel van celtypen. Om genexpressie in bepaalde celtypes van een bepaald weefsel te onderzoeken, kan kernen genetisch gemerkt en vervolgens geïsoleerd met behulp van een op affiniteit gebaseerde benadering. Geïsoleerde kernen kan worden gebruikt voor verdere toepassingen zoals genexpressie analyse en chromatine immunoprecipitatie.

-Affiniteit gebaseerde Isolatie van Tagged Kernen uit<em&gt; Drosophila</em&gt; Tissues voor de analyse van genexpressie

Het doel van dit protocol is om de techniek van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) te gebruiken om specifieke typen neurale cellen te sorteren voor daaropvolgende analyse van celtype-specifieke genexpressie, epigenetische markers en/of eiwitexpressie.

Met behulp van fluorescentie-geactiveerde Cell Sorting voor Onderzoek Cell-type-specifieke genexpressie in Rat Brain Tissue

Hier beschrijven we protocollen om endogene en exogene centromeer-kinetochoor-eiwitten in menselijke cellen te detecteren en deze eiwitniveaus op centromeren-kinetochoren te kwantificeren door indirecte immunofluorescente kleuring door het gebruik van fixatie (paraformaldehyde, aceton of methanol fixatie).

Immunofluorescentie analyse van endogene en exogene Centromere-kinetochoor Eiwitten

Hier presenteren we een combinatorische aanpak voor het classificeren van neuronale celtypes voorafgaand aan isolatie en voor de daaropvolgende karakterisering van enkelvoudige transcriptomen. Dit protocol optimaliseert de voorbereiding van monsters voor succesvolle RNA Sequencing (RNA-Seq) en beschrijft een methodologie die speciaal is ontwikkeld voor een beter begrip van cellulaire diversiteit.

Single-cell RNA-Seq van gedefinieerde subsetjes van retinale Ganglion-cellen

Dit protocol beschrijft een gemakkelijke en handige methode om te etiketteren en visualiseren van levende chromosomen in mitotische cellen met behulp van Histone2B-GFP BacMam 2.0 label en een draaiende schijf confocale microscopie systeem.

Levende cel beeldvorming van chromosoom segregatie tijdens de mitose

Hier presenteren we een protocol voor Multi-Color lokalisatie van één membraaneiwitten in organellen van levende cellen. Als u wilt koppelen fluorophores, worden zelf labeling eiwitten gebruikt. Eiwitten, gelegen in verschillende membranen compartimenten van de dezelfde organel, kunnen worden gelokaliseerd met een nauwkeurigheid van ~ 18 nm.

Multi-Color lokalisatie microscopie van één membraaneiwitten in organellen van de cellen van levende zoogdieren

Bulk gen expressie metingen wolk individuele cel verschillen in heterogene cel populaties. Hier beschrijven we een protocol voor hoe eencellige gen expressie analyse en index Sorteren door bloeien geactiveerd Cell Sorting (FACS) kan worden gecombineerd om te bakenen heterogeniteit en immunophenotypically karakteriseren moleculair afzonderlijke cel populaties.

Een combinatorische eencellige aanpak te karakteriseren de moleculaire en Immunophenotypic heterogeniteit van menselijke stamcellen en voorlopercellen populaties

We presenteren een driekleurig chromatine single molecule localization microscopy (SMLM) kleurings- en analyseprotocol dat reproduceerbare mapping van euchromatine, heterochromatine en RNAP II mogelijk maakt voor ruimtelijke analyse. Dit protocol maakt efficiënte meerkleurige etikettering mogelijk in dichte nucleaire omgevingen, inclusief chromatine-geassocieerde doelen, waardoor betrouwbare gelijktijdige detectie mogelijk is.

Een multilabel Single Molecule Localization Microscopieprotocol voor het Onderzoek van Chromatine in de dichte nucleaire omgeving

We rapporteren een DNA-FISH metafaseverspreidingsprotocol dat visueel het aantal locuskopieën en locatie binnen het genoom detecteert. Deze aanpak maakt enkelcelresolutie van amplificatietoestanden mogelijk, specifiek in kankercellijnen die extrachromosomaal DNA bevatten en gebieden homogeen kleuren.

DNA-FISH-metafase verspreidt zich om extrachromosomaal DNA te onderscheiden van homogene kleuringsgebieden in menselijke kankercellijnen

Leer de heterokaryon-techniek voor celtype-specifieke eiwitlokalisatie en nucleocytoplasmatisch transport met fluorescentie-microscopie. Deze methode biedt inzicht in kankerbiologie en celgedrag.

Heterokaryon Techniek voor de analyse van celtype-specifieke lokalisatie

Meer video's verkennen