Elektrofysiologische metingen van een Moth olfactorisch systeem

Het algemene doel van het volgende experiment is om aan te tonen hoe eenvoudig het is om olfactorische responsen van het zenuwstelsel van insecten te registreren. Dit wordt bereikt door een levende mot te fixeren en elektroden aan de antenne of aan een individueel neuron te koppelen om door geurstoffen geïnduceerde responsen vast te leggen. Als eerste stap wordt een met zoutoplossing gevulde glazen elektrode in het oog geplaatst als massa; als tweede stap wordt bij de gefixeerde motten een met zoutoplossing gevulde glazen elektrode ingebracht, wat de registratie van elektrische responsen in de vorm van een antennagram mogelijk maakt voor het vastleggen van single-unit responsen van een olfactorisch receptorneuron.

De registratie-elektrode wordt bij de basis van een sensillum geplaatst. Vervolgens wordt het antennesignaal versterkt en doorgegeven aan een analoog-digitaal converter om de signalen te registreren en op te slaan. De resultaten tonen dosisafhankelijke, door geurstoffen geïnduceerde reacties op basis van het geregistreerde elektrische signaal in de vorm van een EAG-signaal of een spike.

We hebben een nieuwe methode ontwikkeld voor het registreren van het enterogram van de gefixeerde levende mot van de Naval orange. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de preparatie lang houdbaar is, waardoor dezelfde mot meerdere keren kan worden gebruikt om diverse responsen te registreren; bovendien kan dezelfde mot worden ingezet voor het registreren van single-unit responsen van een individuele sensor op de antenne. We richten ons op de Naval orange omdat dit een belangrijk landbouwgewas is in Californië.

Deze methode kan echter worden gebruikt voor andere lepidoptera-insecten, niet alleen om fundamentele vragen over functies te beantwoorden, maar ook voor de ontwikkeling van nieuwe attractanten. Deze studie naar het olfactorische systeem van de mot maakt gebruik van de naval orange worm, Ullo Ella.

De insectenkolonie wordt onderhouden op een dieet van tarwezemelen in klimaatkamers bij ongeveer 28 °C, ongeveer 75% relatieve vochtigheid en onder een licht-donkerregime van 16 tot 8 uur; maak containers voor pas gearriveerde motten door maximaal 10 lagen met water verzadigde papieren handdoeken in een plastic bak te plaatsen. Verzamel en bepaal dagelijks het geslacht van de uitkomende motten en breng ze vervolgens over naar de plastic bak. Dek de bak af met een geperforeerd deksel om luchtcirculatie mogelijk te maken ter voorbereiding op de elektrofysiologische opnamen.

Maak eerst een houder voor de mot door een pipetpunt van 200 µL zo af te knippen dat de diameter van de punt ongeveer twee millimeter is. Selecteer voor EAG of SSR een mot die twee tot vier dagen na het uitkomen is. Plaats de mot via de opening tegenover de punt in de pipet met behulp van een stukje bevochtigd vloeipapier en duw de mot voorzichtig richting de pipetpunt.

Duw de mot verder totdat de antennes en een deel van de kop uit de punt steken. Immobiliseer de blootgestelde kop door deze te bedekken met een niet-uitdrogende klei, waarbij een klein deel van één oog en beide antennes vrij blijven. Plaats de preparaat van de mot op het platform van de electrogram micromanipulator tussen de twee電electrodehouders met glazen elektroden met tipdiameters van minder dan één micron. Vul de elektroden aan met centum limb ringer.

Door de microscoop kijkend, doorboort u met één elektrode het blootgelegde gebied van het oog. Deze dient als referentie-elektrode. De volgende stap is het plaatsen van registratie-elektroden op de antennes.

De antenne van de mannelijke naval orangeworm mot is meersegmentig, waarbij elk segment is voorzien van een groot aantal haarachtige structuren. De illa, de inzet is een scanning-elektronenmicrografie die details van de illa toont om opnames van de antennes te vergemakkelijken. Snijd de distale één tot twee antennesegmenten af.

Plaats vervolgens beide antennes in de registratie-elektrode. Voor registraties van een enkele sens kan de registratie-elektrode alternatief aan de basis van een sens worden geplaatst. De actiepotentialen van de sens worden versterkt door een voorversterker met een hoge impedantie en gevoed aan een USB-intelligente digitaal-analoge converter om offline te worden geanalyseerd met autos spike-software.

De volgende stap is het voorbereiden van de chemische stimulus met ZZ 1113 HEXA deca Now, een hoofdcomponent van het vrouwelijke feromoonmengsel van de navelappelsinerworm; verdun de chemische stof met hexaan om DIC-verdunningen te maken. Breng 10 µL van een stimulusoplossing aan op een Watman-filterpapier. Laat het oplosmiddel verdampen door het papier 10 seconden voorzichtig te schudden.

Plaats de strip in een zuigspuit van vijf milliliter van polypropyleen onder een zuurkast; een zuigspuit met enkel hexaan en een lege zuigspuit dienen als controles voor de preparatie. EAG of SSR wordt vastgehouden in een bevochtigde luchtstroom die wordt geleverd door de stimuluscontroller met een snelheid van 20 milliliter per seconde. Bevestig de zuigspuit met de chemische stimulus aan de luchtstroomcontroller.

Registreer twee seconden aan baselinesignalen. Voeg vervolgens een stimuluspuls van vier milliliter per seconde toe aan de luchtstroom gedurende 500 milliseconden. Ga door met het registreren van elektrische signalen voor nog eens acht seconden.

Laat ten minste één minuut tussen de stimulaties verstrijken. Deze figuur toont een robuuste dosisafhankelijke respons van de antennes van een gefixeerde mannelijke mot. Gestimuleerd met de vrouwelijke feromooncomponent, CZ 1113 hexaco.

De respons op hexaan. De voertuigcontrole wordt opeenvolgend weergegeven door de blauwe lijn. Grotere doses van het feromoon genereren opeenvolgend grotere electrogramregistraties.

Deze figuur toont de extracellulaire single-unit opnames van een trichodesmium als reactie op stimulatie door het vrouwelijke feromooncomponent. Deze opnames tonen een dosisafhankelijke exciterende respons. Zodra de techniek onder de knie is, kan deze, mits correct uitgevoerd, in enkele uren worden voltooid.

Zorg er bij het gebruik van deze methode voor dat contaminatie wordt vermeden en gebruik chemicaliën van de hoogst mogelijke zuiverheid.