Name: Het meten van Caenorhabditis elegans Levensduur in 96 Well microtiterplaten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 23 s
Description: Leer de levensduur van Caenorhabditis elegans meten in 96-well microtiterplaten met deze methode. Dit protocol maakt snelle identificatie van levensduurverlengende verbindingen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit protocol werd oorspronkelijk ontwikkeld bij Fred Hutchinson Cancer Research Center in Seattle door Xiaolan Ye en Michael Petrascheck in het Laboratorium voor Linda Buck. De gedetailleerde versie van bovenstaande is opgesteld om de gehele procedure ter beschikking van de bredere gemeenschap te maken. Wij danken Carol Taylor, Sarah LeBoeuf en Andy Tomacelli voor het kritisch lezen van het protocol. Dit is manuscript # 2866 van het Scripps Research Institute. De Petrascheck Lab is gefinancierd door het Novartis ADI-programma.

Overzicht: Het protocol is opgesplitst in vier delen. Deel 1 beschrijft hoe voor te bereiden de voeding bacteriën. Deel 2 beschrijft hoe de voorbereiding van de worm cultuur. Deel 3 beschrijft hoe om te scoren levensduur. Part 4 toont een aantal representatieve resultaten, en in deel 5 wordt beschreven hoe u de voorbereiding van de gewenste oplossingen. Levensduur experimenten enkele weken in beslag. Voor elke stap van het protocol week, is dag en tijd van de dag opgenomen om de planning te vergemakkelijken. De L4 stadium (dag 0) wordt gebruikt als referentiepunt voor de gehele protocol. 1. De voorbereiding van Feeding bacteriën Dit gedeelte beschrijft de bereiding van de voeding bacteriën. De specifieke E. coli-stam gebruikt om C.elegans feed is genoemd OP50. Voorafgaand aan dit protocol, om kruisbesmetting van de worm cultuur met andere bacteriën te voorkomen, is de OP50 stam is gemaakt carbenicilline / ampicilline resistente 21. Bereid de OP50 vier tot vijf dagen op voorhand. Alle materialen die in contact komen met OP50 moeten steriel zijn. Dag -7: donderdag (week 1): Inoculatie 5 ml TB met 100 ug / ml ampicilline en 0,1 ng / ml amfotericine B met een OP50 kolonie en incubeer overnacht bij 37 ° C in een bacteriële shaker. Dag -6: vrijdag (week 1). 'S ochtends 08:30. Inoculeer vroeg om voldoende tijd voor de cultuur tot verzadiging te bereiken <ol><li> Verdun de nacht cultuur van OP50 1:2000 in 300 ml TB met 50 ug / ml ampicilline. Incubeer de cultuur in een bacteriële shaker voor 8-12 uur bij 37 ° C tot verzadiging is bereikt. Sta niet toe dat de cultuur om te groeien langer dan 14 uur. </li><li> Breng de OP50 in een steriele, pre-gewogen centrifugebuis. Pellet de OP50 door centrifugatie gedurende 10 min bij 3500 rpm (2200 xg) in een tafelblad centrifuge. </li><li> Verwijder het supernatant en resuspendeer de OP50 pellet in steriel water en opnieuw pellet door centrifugeren. Twee keer Herhaal deze te wassen. </li><li> Na de tweede wasbeurt, verwijder zorgvuldig alle resterende water. Er mag geen water worden gelaten in de buis. Weeg de centrifugebuis met de pellet en aftrekken van het gewicht van de lege centrifugebuis om het gewicht van de pellet te bepalen. </li><li> Grondig resuspendeer de pellet in S-te voltooien tot een concentratie van 100 mg / ml. Geen klonten dient te worden overgelaten. </li><li> De concentratie van 100 mg / ml OP50 dienen te corresponderen met 2 x10 10 bacteriën / ml. Gebruik een foto spectrometer om het aantal bacteriën per ml te bepalen of de relatie tussen de optische dichtheid en het aantal bacteriën per ml is bekend. Indien nodig, de concentratie van de OP50 voeden oplossing voor 2 x10 10 bacteriën / ml. </li><li> Bewaar de OP50solution bij 4 ° C totdat het wordt gebruikt voor de worm cultuur. </li></ol> 2. De voorbereiding van een synchrone Worm Cultuur Deze paragraaf beschrijft de bereiding van de worm cultuur. Het doel is het genereren van een leeftijd-synchrone bevolking van wormen. Alle materialen die in contact komen met C.elegans na de behandeling bleekmiddel in stap 5 moeten steriel zijn. Platen zijn bewaard bij 20 ° C, tenzij anders aangegeven. Dag -6: vrijdag (week 1), 16u00: Transfer van de dieren om een nieuwe plaat <ol><li> Neem 5-10 dagen oud NGM plaat waarop de meerderheid van de worm bevolking bestaat uit uitgehongerd L1 larven. </li><li> Steriliseren een metalen spatel door kort te verwarmen boven een bunsenbrander. Laat het afkoelen. Gebruik de afgekoelde spatel te snijden agar stukken van het bord met de uitgehongerde wormen. Overdracht een aantal van deze brokken op een frisse 10 cm NGM plaat bezaaid met OP50. Incubeer ca.. 65 uur bij 20 ° C tot de meerderheid van de worm bevolking bestaat uit zwangere volwassenen. De tijd die het duurt voor de uitgehongerde L1 dieren uit te groeien tot zwangere volwassenen kan variëren van stam tot stam. </li></ol> Dag -3: maandag (week 2) 10:00: Opzetten van een synchrone bevolking <ol start="3"><li> Verzamel wormen uit de 10 cm plaat door ze te wassen van de plaat met 5-10 ml steriel water. Breng de worm / water-oplossing in een 15 ml conische buis. </li><li> Was de wormen door centrifugeren 2 min in een tafelblad centrifuge bij 1200 rpm (280 xg). Gooi supernatant en voeg 10 ml water. Herhalen. </li><li> Verwijder supernatant en voeg 5 ml vers bereide bleekwater / NaOH-oplossing (2,5 ml bleekmiddel, 1 ml NaOH 10N, 6,5 ml H 2 O). Incubeer gedurende 5 minuten bij RT tot de wormen open te breken. Zorg ervoor dat u voorzichtig vortex elke minuut. De voortgang van de reactie onder de microscoop te ontleden. </li><li> Zodra alle volwassenen te ontbinden, voeg 5 ml M9 buffer om de reactie te neutraliseren. </li><li> Was de eieren drie keer met 10 ml M9 buffer door het centrifugeren van 2 min bij 2500 rpm (1100 xg). </li><li> Was de eieren een keer met 10 ml S-te voltooien door centrifugeren 2 min bij 2500 rpm (1100 xg). </li><li> Verwijder de bovenstaande vloeistof, voeg 10 ml S-compleet en breng de oplossing om een ​​nieuwe 50 ml conische buis. Voeg 30 ml van de S-te voltooien tot een uiteindelijk volume van 40 ml. Zachtjes schudden 's nachts de buis bij kamertemperatuur op een nutator of soortgelijk apparaat. </li></ol> Dag -2: dinsdag (week 2), 12.00 uur: Zaad van de dieren in platen <ol start="10"><li> Onder het ontleden omvang, controleer dan of de wormen uitgekomen tijdens de nacht. Bepaal de concentratie van wormen in de S-complete oplossing door het tellen van het aantal wormen in 10 uL druppels met behulp van een dissectie scope. Tellen minstens 10 druppels voor elk monster. </li><li> Resuspendeer de wormen bij een concentratie van 80-100 wormen / ml in S-te voltooien. Voeg carbenicilline (stock 100 mg / ml) tot een uiteindelijke concentratie van 50 ug / ml en amfotericine B (stock 250 ug / ml) tot een uiteindelijke concentratie van 0,1 ug / ml. Schudden op een nutator. Als voorbereiding grotere hoeveelheden van wormen, gebruik dan een 600 ml nunclon kolf met filter cap. </li><li> Op 14:30 voeg de OP50 bereid in deel 1 tot een uiteindelijke concentratie van 6 mg / ml (= 1,2 x10 9 bacteriën / ml). Zet de OP50 tot 4 ° C. </li><li> Overdracht 120 pi van de worm/OP50 oplossing in elk putje van een 96 wells plaat. Gebruik platen met 96 putjes met een transparante bodem. Zorg ervoor dat de wormen in suspensie te houden tijdens het pipetteren. </li><li> Seal de plaat met behulp van een tape sealer om besmetting en verdamping te voorkomen. Schud de plaat op een microtiterplaat shaker gedurende 2 minuten en incubeer gedurende 2 dagen bij 20 ° C tot de dieren bij de L4 stadium. </li></ol> Dag 0: donderdag (week 2) voor de middag: Steriliseer dieren door het toevoegen van Fluorodeoxyuridine (FUDR) <ol start="15"><li> Voor het steriliseren van de dieren toe te voegen 30 ul van een 0,6 mM FUDR stockoplossing aan elk putje. Deze stap brengt de uiteindelijke volume in elk putje tot 150 pi en vermindert de uiteindelijke concentratie van OP50 van 6mg / ml tot 5 mg / ml (1x10 9 bacteriën / ml). Seal de plaat met behulp van tape jagers en schud het 2-3 minuten op een microtiterplaat shaker. Als de OP50 werd toegevoegd om 2:30 op dag -2, is het belangrijk dat de FUDR is toegevoegd voor de middag. Keer terug platen om de 20 ° C incubator </li></ol> Dag 1: vrijdag (week 2): Voeg drugs aan cultuur <ol start="16"><li> 09:00 door het merendeel van de dieren worden zwangere en bevat een aantal eieren per stuk. Voeg de geneesmiddelen waarvan het effect op levensduur is te testen op de gewenste concentratie. Als het oplossen van de drugs in DMSO de eindconcentraties van DMSO mag niet meer dan 0,6%, zoals DMSO concentraties van meer dan 0,6% verkorten C.elegans levensduur. Na toevoeging van het geneesmiddel, sluit de platen met tape sealer en schud het 2-3 minuten op een microtiterplaat shaker. Keer terug platen om de 20 ° C incubator </li><li> Het toevoegen van de drugs af en toe kan doden een paar dieren per plaat, vooral bij gebruik van een oplosmiddel anders dan water. Gebruik een omgekeerde microscoop om te controleren op dode dieren. Over het algemeen moet er minder dan 10 dode dieren per 96 wells plaat. Keer terug platen om de 20 ° C incubator. </li></ol> Dag 4: maandag (week 3): Change jagers <ol start="18"><li> Toe te staan ​​verse zuurstof aan de cultuur gaan de sealer te verwijderen, wacht een minuut en sluit de plaat. Schud de plaat gedurende 2-3 minuten op een microtiterplaat shaker. Herhaal dit een keer per week. </li></ol> Dag 5: dinsdag (week 3): Voeg nieuwe OP50 aan uithongering te voorkomen <ol start="19"><li> Voeg 5 pi van de 100 mg / ml OP50-oplossing dat was in deel 1 bereid om elk van de 96 putten hongersnood te voorkomen. </li></ol> 3. Scoren van de levensduur. Deze paragraaf beschrijft hoe de overleving van de gesynchroniseerde worm bevolking van deel 2 wordt bewaakt totdat de dieren stierven. Te houden aan de dieren in de platen met 96 putjes, gebruik dan een omgekeerde microscoop met een 2x of 2,5 x doelstelling. Record overleving gegevens drie keer per week, maandag, woensdag en vrijdag. Gebruik beweging om te bepalen of de dieren worden levend of dood. Sterk licht, met name blauw licht, induceert de dieren te verplaatsen. Verwijder geen dode dieren uit de test. Af en toe kan dieren die niet bewoog en werden bepaald dood in de vorige telling gaan later. <ol><li> Op dag 0, tellen aan het begin van het experiment het totale aantal wormen in elk putje. Censor putten die meer dan 18 dieren uit de analyse bevatten als dieren in deze putten niet genoeg OP50 en zal effecten van calorische restrictie. </li><li> Om de kans dat de dieren te verplaatsen schudden de 96 wells plaat op een microtiterplaat shaker gedurende 2 minuten te verhogen. vóór het tellen. </li><li> In elke sessie tellen, record datum en het aantal dieren datbewegen als levende dieren. Beweging in een vloeistof is veel gemakkelijker dan op vaste media en kan worden geïnduceerd door sterke lampen. Het gebruik van een hogere vergroting kan helpen om heel subtiele bewegingen zoals die van de top van de keelholte plek. Dergelijke subtiele bewegingen zijn vaak de enige beweging waargenomen in zeer oude dieren. </li><li> Keer terug platen om de 20 ° C incubator </li><li> Herhaal stappen 2-4 om de twee tot drie dagen totdat alle dieren zijn dood. </li></ol> 4. Representatieve resultaten. In dit gedeelte wordt een voorbeeld van hoe een verslag van de levensduur gegevens die zijn gegenereerd door deze test en een aantal representatieve resultaten te houden. Figuur 1A toont een voorbeeld van hoe de levensduur gegevens vast te leggen tijdens deze test. Een Excel-sheet wordt gebruikt om bij te houden van het voortbestaan ​​van de populaties in elk putje. Voor elke goed het te coördineren in de plaat, stam, drugs, concentratie van het geneesmiddel en het totale aantal dieren leven op dag 0 (X0) is opgenomen aan het begin van het experiment. Record date, evenals het aantal levende en dode dieren drie keer per week, om het overleven van de verschillende bevolkingsgroepen in elk putje te volgen. De grafiek van de resultaten, het berekenen van de fractie van de dieren levend voor elke dag en plot als een functie van de tijd in dagen. P-waarden moeten worden berekend met behulp van statistische pakketten zoals STATA of vergelijkbare software. Het medium levensduur van C.elegans is afhankelijk van de temperatuur. Figuur 1B laat zien dat afhankelijk van de temperatuur veranderingen in de levensduur nauwkeurig worden gereproduceerd door de microtiterplaat op basis van levensduur test 22. Ook de microtiterplaat test reproduceert veranderingen in de levensduur van de mutanten gemeld levensduur die verschillen van de wild-type N2 dieren 23 tot 24 25 (afb. 1C) hebben. De test kan ook worden gebruikt om meer kwantitatieve uitspraken te doen. In Fig1D betekenen levensduur is uitgezet als een functie van de concentratie Mirtazepine 7. Elk gegevenspunt vertegenwoordigt de gemiddelde levensduur van 7-12 bevolking, die elk in een andere goed. Ook al is het aantal dieren per goed is relatief laag (5-15 dieren) van de well-to-well variatie is relatief klein kan worden afgeleid uit de fout bars. <img src="/files/ftp_upload/2496/2496fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. De microtiterplaat gebaseerd levensduur test reproduceert accuraat veranderingen in de levensduur in de literatuur. (A) Sample verzamelde gegevens in een Excel-spreadsheet. Tijdens elke sessie het tellen van de datum, de coördinatie van de put en het aantal levende en dode dier werd opgenomen. Aan het begin van het experiment, was het totale aantal dieren in elke goed bepaald. (B) Survival curve van wild-type (N2) dieren gegroeid bij 20 ° C en 25 ° C. (C) overlevingscurven van stammen met mutaties die levensduur beïnvloeden. Alle vier de stammen werden getest in parallel op 20 ° C. (D) Dosis-respons curve van Mirtazepine behandelde N2 dieren. De gemiddelde levensduur is uitgezet als een functie van de Mirtazepine concentratie. Foutbalken geven de SEM van 8 wells per conditie. 5. Materialen. M9 buffer, 1000 ml <ul><li> 6 g Na 2 HPO 4 </li><li> 3 g KH 2 PO 4 </li><li> 5 g NaCl </li><li> 0,25 g MgSO 4 ∙ 7H 2 O </li><li> Voeg gedeïoniseerd water tot 1000 ml </li><li> Autoclaaf </li></ul> Potassiumphosphate buffer pH 6,0, 1000 ml <ul><li> 136 g KH 2 PO 4 </li><li> Voeg gedeïoniseerd water tot 900 ml </li><li> Pas de pH op 6.0 met 5M KOH </li><li> Voeg gedeïoniseerd water tot 1000 ml </li><li> Autoclaaf </li></ul> Trace metal-oplossing <ul><li> 1,86 g Na 2 EDTA </li><li> 0,69 g FeSO 4 ∙ 7H 2 O </li><li> 0,20 g MnCl 2 ∙ 4H 2 O </li><li> 0,29 g ZnSO 4 ∙ 7H 2 O </li><li> 0,016 g CuSO 4 </li><li> 1000 ml gedeïoniseerd water </li><li> Autoclaaf en op te slaan in het donker. </li></ul> S-basismedium, 1000 ml <ul><li> 5,9 g NaCl </li><li> 50 ml 1M kalium fosfaat, pH 6.0 </li><li> 1000 ml gedeïoniseerd water </li><li> Autoclaaf </li><li> Laat de oplossing afkoelen en voeg dan 1 ml van 5 mg / ml cholesterol (opgelost in Et-OH). </li></ul> Kaliumcitraat 1M, 1000 ml <ul><li> 268,8 g tripotassium citraat </li><li> 26,3 citroenzuur monohydraat </li><li> Voeg 900 ml gedeïoniseerd water </li><li> Pas de pH op 6.0 met 5M KOH </li><li> Voeg gedeïoniseerd water tot 1000 ml </li><li> Autoclaaf </li></ul> S-compleet medium, 1000 ml <ul><li> 977 ml S-basale </li><li> 10 mL 1M kaliumcitraat pH 6 (steriele) </li><li> 10 ml Trace metalen oplossing (steriel) </li><li> 3 ml 1M CaCl 2 (steriele) </li><li> 3 mL 1M MgSO 4 (steriele) </li></ul> NGM agar <ul><li> 3,0 g NaCl </li><li> 2,5 g pepton(Uit caseïne, alvleesklier verteren) </li><li> 17g Agar </li><li> Voeg gedeïoniseerd water tot 975 ml en een roerstaaf </li><li> Autoclaaf </li><li> Na het autoclaveren afkoelen tot 55 ° C en voeg de volgende onderdelen: <ul><li> 0,5 ml van 1 M CaCl 2 (steriele) </li><li> 1 ml van 5 mg / ml Cholesterol in ethanol </li><li> 1 ml 1M MgSO 4 (steriele) </li><li> 25 mL Potassiumphosphate buffer, pH 6,0 (steriele) </li></ul></li></ul> TB, 1000 ml <ul><li> 12g Bacto Trypton </li><li> 24 g Gist Extract </li><li> 4 mL glycerol </li><li> Voeg 900 ml gedeïoniseerd water </li><li> Autoclaaf </li><li> Na het autoclaveren afkoelen tot 55 ° C en voeg de volgende component: <ul><li> Voeg 100 ml 0.17M KH 2 PO 4 / 0.72MK 2 HPO 4 </li></ul></li></ul> 0,6 mM Fluorodeoxyuridine (FUDR, sigma cat # F0503), 1000 ml <ul><li> 100 mg FUDR </li><li> Los op in 670 ml steriele S-complete, maken 10 ml of 45 ml porties. </li><li> Bewaren bij -20 ° C. </li></ul> 100 mg / ml carbenicilline, 10 ml <ul><li> 1 g carbenicilline </li><li> 10 ml steriel gedeïoniseerd water </li><li> Steriel filtraat en aliquot </li><li> Bewaren bij -20 ° C. </li><li> Gebruik bij een uiteindelijke concentratie van 50 ug / ml </li></ul> 250ug / ml amfotericine B, 4 ml <ul><li> 1 mg amfotericine B </li><li> 4 ml Et-OH </li><li> Bewaren bij -20 ° C </li><li> Gebruik bij een uiteindelijke concentratie van 0,1 ug / ml </li></ul>

<ol><li>Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+life-span+of+age-1+mutants+in+Caenorhabditis+elegans+and+lower+Gompertz+rate+of+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Increased life-span of age-1 mutants in Caenorhabditis elegans and lower Gompertz rate of aging.</a> Science. 249, 908-912 (1990).</li>
<li>Kenyon, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The genetics of ageing.</a> Nature. 464, 504-512 (2010).</li>
<li>Finch, C. E., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genomics+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">The genetics of aging.</a> Annu Rev Genomics Hum Genet. 2, 435-462 (2001).</li>
<li>Wilson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blueberry+polyphenols+increase+lifespan+and+thermotolerance+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Blueberry polyphenols increase lifespan and thermotolerance in Caenorhabditis elegans.</a> Aging Cell. 5, 59-68 (2006).</li>
<li>Evason, K., Huang, C., Yamben, I., Covey, D. F., Kornfeld, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anticonvulsant+medications+extend+worm+life-span%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Anticonvulsant medications extend worm life-span.</a> Science. 307, 258-262 (2005).</li>
<li>McColl, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacogenetic+analysis+of+lithium-induced+delayed+aging+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Pharmacogenetic analysis of lithium-induced delayed aging in Caenorhabditis elegans.</a> J. Biol. Chem. 283, 350-357 (2008).</li>
<li>Petrascheck, M., Ye, X., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+antidepressant+that+extends+lifespan+in+adult+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An antidepressant that extends lifespan in adult Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 450, 553-556 (2007).</li>
<li>Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reserpine+can+confer+stress+tolerance+and+lifespan+extension+in+the+nematode+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Biogerontology%22%5BJournal%5D)">Reserpine can confer stress tolerance and lifespan extension in the nematode C. elegans.</a> Biogerontology. 9, 309-316 (2008).</li>
<li>Wood, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sirtuin+activators+mimic+caloric+restriction+and+delay+ageing+in+metazoans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Sirtuin activators mimic caloric restriction and delay ageing in metazoans.</a> Nature. 430, 686-689 (2004).</li>
<li>Evason, K., Collins, J. J., Huang, C., Hughes, S., Kornfeld, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Valproic+acid+extends+Caenorhabditis+elegans+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Valproic acid extends Caenorhabditis elegans lifespan.</a> Aging Cell. 7, 305-317 (2008).</li>
<li>Onken, B., Driscoll, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metformin+induces+a+dietary+restriction-like+state+and+the+oxidative+stress+response+to+extend+C.+elegans+Healthspan+via+AMPK%2C+LKB1%2C+and+SKN-1%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Metformin induces a dietary restriction-like state and the oxidative stress response to extend C. elegans Healthspan via AMPK, LKB1, and SKN-1.</a> PLoS One. 5, e8758-e8758 (2010).</li>
<li>Wu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ginkgo+biloba+extract+EGb+761+increases+stress+resistance+and+extends+life+span+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Biol+%28Noisy-le-grand%29%22%5BJournal%5D)">Ginkgo biloba extract EGb 761 increases stress resistance and extends life span of Caenorhabditis elegans.</a> Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 48, 725-731 (2002).</li>
<li>Kang, H. L., Benzer, S., Min, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+extension+in+Drosophila+by+feeding+a+drug%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Life extension in Drosophila by feeding a drug.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 838-843 (2002).</li>
<li>Avanesian, A., Khodayari, B., Felgner, J. S., Jafari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lamotrigine+extends+lifespan+but+compromises+health+span+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Biogerontology%22%5BJournal%5D)">Lamotrigine extends lifespan but compromises health span in Drosophila melanogaster.</a> Biogerontology. 11, 45-52 (2010).</li>
<li>Melov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extension+of+life-span+with+superoxide+dismutase%2Fcatalase+mimetics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Extension of life-span with superoxide dismutase/catalase mimetics.</a> Science. 289, 1567-1569 (2000).</li>
<li>Benedetti, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compounds+that+confer+thermal+stress+resistance+and+extended+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Compounds that confer thermal stress resistance and extended lifespan.</a> Exp. Gerontol. 43, 882-891 (2008).</li>
<li>Braungart, E., Gerlach, M., Riederer, P., Baumeister, R., Hoener, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+MPP%2B+model+of+Parkinson%27s+disease+for+high-throughput+drug+screenings%5BTitle%5D)+AND+%22Neurodegener+Dis%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans MPP+ model of Parkinson's disease for high-throughput drug screenings.</a> Neurodegener Dis. 1, 175-183 (2004).</li>
<li>Kwok, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small-molecule+screen+in+C.+elegans+yields+a+new+calcium+channel+antagonist%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A small-molecule screen in C. elegans yields a new calcium channel antagonist.</a> Nature. 441, 91-95 (2006).</li>
<li>Moy, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screen+for+novel+antimicrobials+using+a+whole+animal+infection+model%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">High-throughput screen for novel antimicrobials using a whole animal infection model.</a> ACS Chem Biol. 4, 527-533 (2009).</li>
<li>Kaletta, T., Hengartner, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finding+function+in+novel+targets%3A+C.+elegans+as+a+model+organism%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Finding function in novel targets: C. elegans as a model organism.</a> Nat Rev Drug Discov. 5, 387-398 (2006).</li>
<li>Chung, C. T., Niemela, S. L., Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+preparation+of+competent+Escherichia+coli%3A+transformation+and+storage+of+bacterial+cells+in+the+same+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">One-step preparation of competent Escherichia coli: transformation and storage of bacterial cells in the same solution.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86, 2172-2175 (1989).</li>
<li>Klass, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%3A+major+biological+and+environmental+factors+influencing+life+span%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Aging in the nematode Caenorhabditis elegans: major biological and environmental factors influencing life span.</a> Mech. Ageing Dev. 6, 413-429 (1977).</li>
<li>Ailion, M., Inoue, T., Weaver, C. I., Holdcraft, R. W., Thomas, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurosecretory+control+of+aging+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Neurosecretory control of aging in Caenorhabditis elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 7394-7397 (1999).</li>
<li>Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+C.+elegans+mutant+that+lives+twice+as+long+as+wild+type%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type.</a> Nature. 366, 461-464 (1993).</li>
<li>Lakowski, B., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+life-span+in+Caenorhabditis+elegans+by+four+clock+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Determination of life-span in Caenorhabditis elegans by four clock genes.</a> Science. 272, 1010-1013 (1996).</li>
</ol>

De gepresenteerde protocol maakt het meten van C.elegans levensduur in 96 goed microtiterplaten. Zoals getoond in de representatieve resultaten sectie is repliceert betrouwbaar eerdere bevindingen en geeft kwantitatieve informatie. Met behulp van deze test hebben we met succes meer dan 89.000 gescreende moleculen voor hun effect op C.elegans levensduur. Voor de toepassing van drug-screening, het meten van de levensduur in een 96 wells microtiterplaat formaat heeft verschillende voordelen ten opzichte van de klassieke vaste media assay. Het vermindert de arbeid die nodig is voor de media de voorbereiding, de hoeveelheid van incubatie ruimte, en de hoeveelheid van het geneesmiddel nodig is. De 96-well formaat en de microscopie setup mogelijk automatisering van de gehele test voor high throughput screening. Tijdens de ontwikkeling van de test meerdere waarden voor elke variabele en combinaties daarvan werden getest op hun effecten op C.elegans levensduur. Deze tests onder verschillende OP50 concentratie variërend van 3 tot 10 mg / ml (3, 4, 6, 8, 10 mg / ml), verschillend aantal wormen per well variërend van 7 tot 45 (7, 10, 15, 22, 45 wormen / well), andere cultuur volumes variërend van 40 tot 150 ul per putje (40, 60, 80, 100, 120, 150 pi), en veranderingen in de buffer samenstelling. Als je ze in met een carbenicilline-resistente OP50, noch carbenicilline of amfotericine B in de aangegeven concentraties bleken C.elegans levensduur beïnvloeden. Voortdurend zachtjes schudden van de platen, zoals vaak aanbevolen in C.elegans vloeibare cultuur, bleek overbodig voor de kleine volumes die in deze test. Zachtjes schudden is echter vereist als microtiterplaten met grotere putten worden gebruikt. De waarden die in dit protocol zijn zorgvuldig geselecteerd op basis van statistische vergelijking van de verschillende geteste condities. De meest verrassende kenmerk van deze test is waarschijnlijk het feit dat C.elegans kunnen worden bewaard in platen met 96 putjes die zijn afgedicht met tape. Side-by-side vergelijking is niet gebleken dat het verschil in levensduur van de dieren gekweekt in niet-gesloten platen, in platen afgedicht met een plastic sealer, of in platen afgedicht met jagers die uitwisseling van lucht mogelijk te maken. In alle drie de voorwaarden, de dieren ontwikkelde zich zeer homogeen van L1 aan zwangere volwassenen binnen 65 uur en toonde zeer vergelijkbaar zijn levensduur. Dieren gekweekt in parallel op NGM ontwikkeld iets sneller, maar dit verschil was onafhankelijk van de afwezigheid of aanwezigheid van een sealer. De gepresenteerde protocol is gebaseerd op levende bacteriën, maar kan worden aangepast voor dode bacteriën. Echter, in een vloeistof-test een enkele overlevende bacteriën kunnen zich snel vermenigvuldigen en opnieuw bevolken van de cultuur. In onze handen, de enige betrouwbare manier om bacteriën te doden in de mate dat ze kunnen worden gebruikt voor vloeibare cultuur wordt door langdurige behandeling van de bacteriën met gammastraling. Een belangrijk punt om te overwegen bij het plannen van een levensduur van experiment is de kracht van detectie. Afhankelijk van de grootte van het effect, moet het effect van het geneesmiddel van belang worden getest in meerdere putten. In een typische test 4 geneesmiddel behandeld en 4 controle putten, wat overeenkomt ruwweg op 40-50 dieren per stuk, moet voldoende zijn om een ​​30% toename van de levensverwachting in meer dan 95% van de experimenten op te sporen. Stijgt van 14% slechts aangetroffen in 60% van de gevallen en vereisen daarom meer repliceren putten. De rijkdom van de levensduur van gegevens die zijn gegenereerd door deze test kan worden gebruikt om te experimenteren ontwikkelen of stam specifieke parametrische Gompertz modellen 1. Deze Gompertz modellen zijn nuttig om de kracht van de opsporing te bepalen en om het aantal valse positieven en negatieven voor grootschalige schermen te schatten. We controleren de voorspellingen van deze modellen in blinde experimenten en gebruikte ze om het aantal valse negatieven in grote schermen (niet gepubliceerde resultaten) te schatten. Kortom, we verwachten dat de gepresenteerde analyse zal van groot nut om kleine moleculen die de levensduur van C.elegans uit te breiden en de onderliggende mechanismen studie te identificeren.

A correction to the article Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates was made.

Erratum: Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

<table><tbody><tr><td>Amfotericine B</td><td>Calbiochem</td><td>cat# 171375</td><td>Ook wel Fungizone genoemd</td></tr><tr><td>FUDR</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>cat# F0503</td><td>FUDR wordt geïnactiveerd door hitte, ontdooien in koud water</td></tr><tr><td>Mianserin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2525-250MG</td><td>Gebruiken als positieve controle bij een eindconcentratie van 50&amp;#x03BC;M</td></tr><tr><td>Cyproheptadine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>cat#C6022-MG</td><td>Alternatieve positieve controle bij een eindconcentratie van 10 &amp;#x03BC;M</td></tr><tr><td>Afdichttape</td><td>Nalge Nunc international</td><td>cat# 236370</td><td>Polyester, niet steriel</td></tr><tr><td>96-wells plaat</td><td>Falcon BD</td><td>cat# 351172</td><td>Onbehandeld, transparant, steriel individueel verpakt, polystyreen</td></tr><tr><td>Nunclon-kolf</td><td>Nalge Nunc international</td><td>cat# 178883</td><td>gebruikt voor grote volumes</td></tr></tbody></table>

het meten van caenorhabditis elegans levensduur in 96 well microtiterplaten

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Levensduur is een biologisch proces gereguleerd door verschillende genetische paden. Een strategie om de biologie van het ouder worden te onderzoeken is het bestuderen van dieren die haven van mutaties in componenten van de leeftijd-regelgevende paden. Als deze mutaties verstoren de functie van de leeftijd-regelgevende weg en dus veranderen de levensduur van het gehele organisme, ze belangrijke mechanistische inzichten 1-3. Een andere strategie om de regulering van levensduur te onderzoeken is om kleine moleculen te gebruiken om verstoren leeftijd regelgeving paden. Tot op heden zijn een aantal moleculen waarvan bekend is dat de levensduur te verlengen in verschillende modelorganismen en worden gebruikt als instrumenten om de biologie van veroudering 4-16 studie. Het aantal geïdentificeerde moleculen tot nu toe is klein in vergelijking met de genetische &quot;toolset&quot; die beschikbaar is voor de biologie van veroudering te bestuderen. Caenorhabditis elegans is een van de belangrijkste modellen die gebruikt worden om te studeren veroudering omwille van zijn uitstekende genetica en korte levensduur van drie weken. Meer recent heeft C.elegans ontpopt als een modelorganisme voor fenotype based drug-schermen 5,7,16-20 vanwege zijn kleine formaat en de mogelijkheid om te groeien in microtiterplaten. Hier presenteren wij een test om te C.elegans levensduur te meten in 96 goed microtiterplaten. De test werd ontwikkeld en met succes gebruikt om grote bibliotheken scherm voor moleculen die C.elegans levensduur 7 uit te breiden. De betrouwbaarheid van de test werd geëvalueerd in meerdere tests: ten eerste, door het meten van de levensduur van de wild-type dieren gekweekt bij verschillende temperaturen, ten tweede, door het meten van de levensduur van de mutanten met gewijzigde levensduur, ten derde, door het meten van veranderingen in de levensduur in reactie op verschillende concentraties van het antidepressivum Mirtazepine. Mirtazepine al eerder is aangetoond dat de levensduur te verlengen C.elegans 7. De resultaten van deze tests tonen aan dat de test in staat is om eerdere bevindingen te repliceren van andere testen en is kwantitatief. De microtiterplaat formaat maakt ook deze levensduur test compatibel met geautomatiseerde liquid handling systemen en staat de integratie in geautomatiseerde platforms.

In dit protocol presenteren we een methode om te meten<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Levensduur in 96 goed microtiterplaten.

Het meten van Caenorhabditis elegans Levensduur in 96 Well microtiterplaten

De levensduur is een biologisch proces dat wordt gereguleerd door verschillende genetische pathways. Een strategie om de biologie van veroudering te onderzoeken, is het bestuderen van dieren die ... bevatten.

Het algemene doel van deze procedure is het meten van de levensduur van Caenorhabditis elegans-wormen die zijn behandeld met de betreffende geneesmiddelen. Dit wordt bereikt door eerst OP 50 voor te bereiden, een bacteriële stam die wordt gebruikt om de wormen te voeden. Vervolgens wordt een leeftijdgesynchroniseerde populatie wormen gegenereerd en samen met de voedingsbacteriën OP 50 in 96-wells platen gezaaid.Gedurende de volgende twee dagen groeien de wormen naar het L4-larvale stadium en wordt het geneesmiddel FUDR toegevoegd om reproductie te voorkomen. De volgende dag bereiken de wormen de volwassen fase en worden de betreffende geneesmiddelen aan de individuele putjes toegevoegd. Vanaf dit moment wordt het aantal levende en dode wormen elke twee tot drie dagen bepaald totdat alle wormen zijn gestorven.De observatie wordt uitgevoerd met een omgekeerde microscoop en het aantal dode en levende wormen wordt per sessie genoteerd. Hallo, ik ben Greg Solis. Ik bevind me in het Petro Lab van de afdeling Chemische Fysiologie aan het Scripps Research Institute.Vandaag laat ik u zien hoe u wormen synchroniseert en deze verdeelt over 96-wells microtiterplaten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van uw bestaande methoden is dat het een snelle identificatie mogelijk maakt van moleculen die de levensduur van C. elegans verlengen. Laten we beginnen.Om voedingsbacteriën voor C. elegans voor te bereiden, begint u op dag min zeven door vijf milliliter TB bevatten 100 µg/mL ampicilline en 0,1 µg/mL spectinomycine te inoculeren met een enkele OP50-kolonie; incubeer dit overnacht bij 37 °C in een bacteriële schudincubator. De volgende ochtend vroeg wordt de overnachtkweek van OP50 verdund in 300 milliliter TB bevatten 50 µg/mL ampicilline. Incubeer de kweek gedurende 8 tot 12 uur bij 37 °C in een bacteriële schudincubator totdat verzadiging is bereikt. Laat de kweek niet langer dan 14 uur groeien.Breng de OP 50 over naar een steriele, vooraf gewogen centrifugebuis. Pelleteer de OP 50 door centrifugatie gedurende 10 minuten bij 3.500 RPM of 2.200 ×g in een tafelcentrifuge. Verwijder het supernatant, resuspendeer de OP 50-pellet in steriel water en pelleteer opnieuw door centrifugatie. Herhaal deze wasstap tweemaal na de tweede keer.Was zorgvuldig en verwijder al het resterende water volledig. Weeg de centrifugebuis met het pellet en trek het gewicht van de lege centrifugebuis ervan af om het gewicht van het pellet te bepalen. Resuspendeer het pellet vervolgens grondig in S Complete tot een concentratie van 100 mg/mL.Er mogen geen klontjes achterblijven. Een concentratie van 100 mg/mL OP 50 zou moeten overeenkomen met 2 × 10¹⁰ bacteriën per milliliter. Gebruik de fotospectrometer om het aantal bacteriën per milliliter te bepalen als de relatie tussen de optische dichtheid en het aantal bacteriën per milliliter bekend is.Pas indien nodig de concentratie van de OP 50 voedingsoplossing aan naar 2 × 10¹⁰ bacteriën per milliliter. Bewaar de OP 50 oplossing vervolgens bij 4 °C tot deze wordt gebruikt voor de wormcultuur om een leeftijdssynchrone populatie wormen te genereren. Begin laat in de middag op dag min zes met een 5 tot 10 dagen oude NGM-plaat waarop de wormpopulatie hoofdzakelijk bestaat uit uitgehongerde L1-larven.Steriliseer een metalen spatel door deze kortstondig te verhitten boven een bunsenbrander. Laat de spatel afkoelen. Gebruik vervolgens de afgekoelde spatel om stukjes agar uit de plaat met de uitgehongerde wormen te snijden.Breng enkele van deze stukjes over naar een nieuwe NGM-plaat van 10 centimeter die is geënt met OP 50. Incubeer de wormen gedurende ongeveer 65 uur bij 20 graden Celsius totdat het grootste deel van de wormpopulatie uit grave volwassenen bestaat. De tijd die de uitgehongerde L1-dieren nodig hebben om uit te groeien tot grave volwassenen kan per stam verschillen.Verzamel na de incubatie de wormen van de plaat van 10 centimeter door ze met vijf tot 10 milliliter steriel water van de plaat af te spoelen. Breng de worm-wateroplossing over in een conische buis van 15 milliliter. Was de wormen door deze twee minuten te centrifugeren in een tafelcentrifuge bij 1.200 RPM of 280 ×g. Verwijder het supernatant en voeg 10 milliliter water toe.Herhaal de wasstap, verwijder het supernatant en voeg vijf milliliter vers bereide bleekmiddel toe. Incubeer de natriumhydroxide-oplossing gedurende vijf minuten bij RT totdat de wormen openbreken. Zorg ervoor dat u elke minuut voorzichtig vortex mixt.Houd het verloop van de reactie onder de dissectiemicroscoop in de gaten zodra alle volwassenen zijn opgelost. Voeg vijf milliliter M nine buffer toe om de reactie te neutraliseren. Was de eitjes drie keer met 10 milliliter M nine buffer door twee minuten te centrifugeren bij 2.500 RPM of 1.100 ×g. Was de eitjes vervolgens één keer met 10 milliliter S complete door twee minuten te centrifugeren bij 2.500 RPM of 1.100 ×g. Verwijder het supernatant.Voeg 10 milliliter S compleet toe en overbreng de oplossing naar een schone conische buis van 50 milliliter. Voeg 30 milliliter S compleet toe tot een eindvolume van 40 milliliter. Schud de buis voorzichtig overnacht bij kamertemperatuur op een mutator of een soortgelijk apparaat om de volgende dag rond het middaguur de dierplaten te enten.Controleer onder een dissectiemicroscoop of de wormen gedurende de nacht zijn uitgekomen. Bepaal de concentratie wormen in de S complete oplossing door het aantal wormen in druppels van 10 µL te tellen. Tel met behulp van een dissectiemicroscoop ten minste 10 druppels per monster. Resus.Suspendeer de wormen in een concentratie van 80 tot 100 wormen per milliliter. Voeg aan S compleet medium carbenicilline toe tot een eindconcentratie van 50 µg/mL en amphotericine B tot een eindconcentratie van 0,1 µg/mL. Schud het mengsel op een mutator.Bij het bereiden van grotere hoeveelheden wormen wordt een non-clon kolf van 600 milliliter met een filterdop gebruikt. Voeg om 14:30 uur de OP 50, bereid in deel één, toe tot een eindconcentratie van zes milligram per milliliter. Bewaar de OP 50 opnieuw bij vier graden Celsius. Breng 120 microliters van de worm-OP 50-oplossing over in elke well van een 96-well plaat met een transparante bodem.Zorg ervoor dat de wormen en de suspensie behouden blijven tijdens het pipetteren; verzegel de plaat met een tape-sealer om contaminatie en verdamping te voorkomen. Schud de plaat gedurende twee minuten op een microtiterplaat-schudder en incubeer gedurende twee dagen bij 20 °C totdat de dieren het L4-stadium bereiken. Voeg vervolgens, om de dieren te steriliseren, 30 µL van een 0,6 mM FUDR-stamoplossing toe aan elke well.Deze stap brengt het uiteindelijke volume in elke put naar 150 µL en verlaagt de uiteindelijke concentratie van OP 50 van 6 mg/mL naar 5 mg/mL. Sluit de plaat af met tape-sealers en schud deze twee tot drie minuten op een microt-plaatshaker. Als de OP 50 op dag min twee om 02:30 is toegevoegd, is het belangrijk dat de FUDR vóór het middaguur wordt toegevoegd; plaats de platen uiterlijk de volgende dag om 09:00 uur terug in de incubator van 20 °C.De meeste dieren moeten volwassen zijn en meerdere eieren bevatten. Voeg aan elk de geneesmiddelen toe waarvan het effect op de levensduur moet worden getest, in de gewenste concentratie. Indien de geneesmiddelen in DMSO worden opgelost, mogen de uiteindelijke DMSO-concentraties 0,6% niet overschrijden, aangezien DMSO-concentraties hoger dan 0,6% de levensduur van de worm verkorten na toevoeging van het geneesmiddel.Verzegel de platen met een tape-sealer en schud ze twee tot drie minuten op een microtiterplaat-schudder. Plaats de platen vervolgens terug in de incubator op 20 °C. Het toevoegen van de geneesmiddelen kan af en toe leiden tot de dood van enkele dieren per plaat, vooral bij het gebruik van een ander oplosmiddel dan water.Gebruik een omgekeerde microscoop om te controleren op dode dieren. Over het algemeen mogen er minder dan 10 dode dieren per 96-wells plaat aanwezig zijn. Plaats de platen twee dagen terug in de incubator op 20 °C om verse zuurstof in de cultuur te laten komen. Verwijder de sealer.Wacht één minuut en sluit de plaat opnieuw af. Schud de plaat twee tot drie minuten op een microtighter plate shaker, herhaal dit één keer per week op dag vijf van de levensduur van de volwassen wormen, voeg vijf µL van de eerder bereide 100 mg/mL OP 50-oplossing toe aan elk van de 96 wells om uithongering te voorkomen. De levensduur van de wormen wordt drie keer per week beoordeeld op basis van hun beweging, vanaf het begin van het experiment tot aan hun dood.Gebruik een omgekeerde microscoop met een 2 x of 2,5 x objectief om de wormen in 96-wells platen te observeren op dag nul aan het begin van het experiment. Tel het totale aantal wormen in elke well.Sensorputjes die meer dan 18 dieren uit de analyse bevatten, aangezien dieren in deze putjes onvoldoende OP 50 zullen hebben en in elke telsessie effecten van dieetrestrictie zullen vertonen. Noteer de datum en het aantal dieren dat beweegt als levende dieren. Beweging in vloeistof is veel gemakkelijker dan op vaste media en kan worden geïnduceerd door fel licht.Het gebruik van een hogere vergroting kan helpen om zeer subtiele bewegingen op te merken, zoals die aan de punt van de pharynx. Dergelijke subtiele bewegingen zijn vaak de enige bewegingen die worden waargenomen bij zeer oude dieren. Plaats de platen terug in de incubator van 20 degrees Celsius.Herhaal de teltellingen om de twee tot drie dagen totdat alle dieren dood zijn. Dit is een ontwerp van een Excel-blad om de levensduurgegevens voor elke put vast te leggen. De coördinaten in de plaat, de stam, de drugconcentratie van het middel en het totale aantal levende dieren op dag nul worden aan het begin van het experiment genoteerd.Noteer drie keer per week de datum en het aantal levende en dode dieren om de overleving van de verschillende populaties in elke put te volgen. Deze figuur toont de resultaten van de levensduurcurves van sea elegance, vastgelegd bij 20 °C en 25 °C. De op microtiterplaten gebaseerde levensduuranalyse reproduceert nauwkeurig temperatuurafhankelijke veranderingen in de levensduur.Similarly, zoals hier wordt getoond, reproduceert de microtiterplaat-assay veranderingen in de levensduur van mutanten waarvan is gerapporteerd dat hun levensduur verschilt van die van wildtype N2-dieren. Deze figuur laat zien hoe toenemende doses mirtazapine de gemiddelde levensduur van C. elegans beïnvloeden. De gegevens verkregen met de microtiterplaat-assay zijn kwantitatief genoeg om dosis-responscorrelaties vast te stellen. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze worden gebruikt om grote chemische bibliotheken te screenen op moleculen die de levensduur van C. elegans verlengen.Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

measuring-caenorhabditis-elegans-life-span-96-well-microtiter

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

In dit artikel geven we een algemeen protocol voor het meten van de levensduur van nematoden gehouden op vaste media met UV-gedode bacteriën voedsel.

Het meten van Caenorhabditis elegans Levensduur over Solid Media

Deze video beschrijft een traditionele, op platen gebaseerde methode om de levensduur van C. elegans te meten. Het voorbeeldprotocol meet de levensduur van wormen die met RNAi worden behandeld.

Levensduuranalyse: Het meten van de levensduur van C. elegans

C. elegans is een aantrekkelijk modelorganisme om signaaltransductieroutes te bestuderen die betrokken zijn bij oxidatieve stressresistentie. Hier bieden we een protocol om oxidatieve stressresistentie van C. elegans dieren in vloeibare fase te meten, met behulp van verschillende oxiderende agentia in 96-wells platen.

Het meten van oxidatieve stress Weerstand van<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; In 96-well microtiterplaten

Hier presenteren we een kader hebben betrekking op breed scala dieet beperking genexpressie en levensduur. We beschrijven de protocollen voor breed scala dieet beperking en voor kwantitatieve beeldvorming van genexpressie onder dit paradigma. We schetsen verder computationele analyses te onthullen de functies van information processing van de genetische circuits onderliggende betrokken bij voedsel-sensing.

Kwantificering van informatie gecodeerd door Gene Expression niveaus tijdens levensduur modulatie onder breed-scala dieet beperking in C. elegans

Een basisprotocol te beoordelen van de giftigheid van chemische stoffen in een model dier, Caenorhabditis elegans, wordt beschreven. De methode is geschikt en nuttig is voor de ontwikkeling van geneesmiddelen, alsook wat betreft de risico-evaluatie van verschillende milieuverontreinigende stoffen.

Meten van het Effect van chemische stoffen op de groei en voortplanting van Caenorhabditis elegans

Hier beschrijven we een eenvoudig protocol voor het snel produceren van honderden nematode groei media agar, 96-Wells cultuur platen met een consistent aantal Caenorhhabditis elegans per putje. Deze culturen zijn nuttig voor de fenotypische screening van hele organismen. Hier richten we ons op met behulp van deze culturen op scherm chemicaliën voor Pro-levensduur effecten.

Een eenvoudige methode voor High Throughput chemische Screening in Caenorhabditis Elegans

Hier beschrijven we de replicaset methode, een benadering tot kwantitatief maatregel C. elegans levensduur/overleving en de healthspan in een high-throughput en robuuste manier, waardoor screening van vele voorwaarden zonder in te boeten op kwaliteit van de gegevens. Dit protocol details van de strategie en biedt een software-instrument voor de analyse van gegevens van de replicaset.

De Replica Set, methode: Een High-throughput benadering van kwantitatief maatregel Caenorhabditis elegans levensduur

Caenorhabditis elegans dienen als een uitstekend modelsysteem met robuuste en goedkope methoden voor het onderzoeken van de gezondheid, levensduur en veerkracht tegen stress.

Onderzoek naar goedkope methoden om levensduur en gezondheid te meten in Caenorhabditis elegans

Hier wordt een geoptimaliseerd protocol gepresenteerd voor het kweken van geïsoleerde individuele nematoden op vaste media in microgefabriceerde multi-well-apparaten. Met deze aanpak kunnen individuele dieren gedurende hun hele leven worden gevolgd op een verscheidenheid aan fenotypen die verband houden met veroudering en gezondheid, waaronder activiteit, lichaamsgrootte en -vorm, bewegingsgeometrie en overleving.

Langetermijnkweek en monitoring van geïsoleerde Caenorhabditis elegans op vaste media in multiwell-apparaten

Hier presenteren we een algemene methode om de embryonale levensvatbaarheid en het totale aantal geproduceerde embryo's (broed) te bepalen met behulp van het modelorganisme C. elegans.

Het meten van de embryonale levensvatbaarheid en broedgrootte bij Caenorhabditis elegans

Dit protocol beschrijft een test om de voedingssnelheid van Caenorhabditis elegans te kwantificeren op basis van het meten van de klaring van bacteriën in vloeibare cultuur.

Kwantificering van de voedselinname bij Caenorhabditis elegans door de bacteriële klaring te meten

Leer de levensduur van Caenorhabditis elegans meten in 96-well microtiterplaten met deze methode. Dit protocol maakt snelle identificatie van levensduurverlengende verbindingen mogelijk.

Het meten van Caenorhabditis elegans Levensduur in 96 Well microtiterplaten

Meer video's verkennen