Name: Gesloten systeem Cultuur van de Cel Protocol gebruik HyperStack Schepen met een zuurstofdoorlatende Material Technology (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-29T17:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: Leer het gesloten systeem protocol voor celkweek met Corning HYPERStack vaten met gasdoorlatende technologie. Deze methode maximaliseert oppervlakte voor celgroei en verbetert oogstefficiëntie aanzienlijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs willen graag Lonza Walkersville bedanken voor hun hulp bij het gesloten systeem van kennis, tas ontwerpen, lening van de tas sealers en lassers, evenals het creëren van de zak aan HyperStack schema&#39;s.

1. HyperStack Vessel - zuurstofdoorlatende Material Technology Achtergrond <ol><li> De HyperStack Schip is een meerlaags vat voor gesloten systeem kweken van cellen die op gas uitwisseling steunt door middel van een 76.2micron gasdoorlatend polymeerfilm voor cellulaire stofwisseling. </li><li> De HyperStack schip onderscheidt zich van de meer traditionele celkweek schepen in dat het niet over een "head space" boven de cellen in het vat. In plaats van met deze "headspace" voor gas-uitwisseling binnen het vaartuig, de zuurstofdoorlatende producten zijn voorzien van ruimtes (aangeduid als "tracheale" spaties) onder elke cultuur kamer die open is naar de atmosfeer. </li><li> Deze tracheale ruimte maakt de cellen groeien in elke cel cultuur compartiment van het schip gelijkwaardige gasuitwisseling hebben. </li><li> Het gas permeabele laat gasuitwisseling plaatsvinden met behoud van een steriele omgeving. Alle vloeistof manipulaties voor elk van de meerdere lagen plaatsvinden door middel van een single entry poort. </li></ol> 2. HyperStack Vessel Component Summary <ol><li> De Stackette is de individuele cel cultuur compartiment dat bestaat uit de bovenste plaat en zuurstofdoorlatende film. De cellen worden gekweekt in dit compartiment. </li><li> De Liquid Manifold verbindt elk van de 12 stackette lagen samen in een HyperStack module. Modules zijn verbonden met de buis aan schepen vorm in veelvouden van 12 lagen. Het spruitstuk kan de gebruiker een vloeistof manipulatie aan te brengen in het gehele vaartuig. </li><li> De Air Manifold verbindt ook de stackette lagen aan elkaar, maar het gebruikt om de lucht te verplaatsen van het schip als vloeistof aanvullingen optreden. Het bevat een vullijn voor gebruik tijdens het vullen. </li><li> De Tracheale Space is de open lucht ruimte tussen elke stackette laag, waardoor gasuitwisseling plaatsvinden door elke lagen 'zuurstofdoorlatende film. </li><li> De Liquid handling slang is verbonden met de vloeistof en het spruitstuk wordt gebruikt om alle gesloten systeem vloeistof manipulaties te maken. Deze component kan worden aangepast. </li><li> De Vent slang is verbonden met de lucht spruitstuk, bevat een luchtfilter, en wordt gebruikt om overtollige lucht vrij met behoud van steriliteit. </li><li> De achtervolging buis heeft een filter en klem en zijn verbonden met de liquid handling slangen en worden gebruikt om de vloeistof te evacueren uit het hanteren van vloeistoffen slang na het vullen van het schip. </li><li> De Corning Stack Manipulator of CSM is een handling-apparaat om te helpen bij het plaatsen van de schepen in de juiste positie tijdens het gebruik. </li><li> Het vullen van Wedge is een roestvrij stalen assisteren gebruikt bij het handmatig vullen van de HyperStack schepen. </li></ol> 3. Gas Diffusion Resultaten door zuurstofdoorlatende Film gebruikt in de HyperStack Vessels <ol><li> In traditionele celgroei systemen met geventileerde headspace, wordt de zuurstof in de media uitgeput een gemiddelde van 50% over 3 dagen in cultuur. (Figuur 1) </li><li> In dezelfde cel groei van het systeem, de zuurstof gradiënt in een 3 mm hoogte van de media is bijna 50% groter is bij de media om kopruimte knooppunt dan is het op de cel-laag. (Figuur 2) </li><li> De diffusie van zuurstof door het 76.2micron zuurstofdoorlatende polystyreen film is gelijk aan de verspreiding door middel van 2,6 mm van de media. Het gas permeabele gebruikt in de HyperStack vaten kan de gasuitwisseling zullen optreden bij de cel-laag. </li><li> Het% van de zuurstof in de tracheale ruimte van de HyperStack schepen blijft constant als cellen groeien tot confluentie. (Figuur 3) </li></ol> 4. Media-Bag Voorbereiding <ol><li> De HyperStack-12 laag schip duurt 1,3 van media en de HyperStack-36 laag schip duurt 3,9 l van de media. </li><li> Voorafgaand aan inenten van uw zakken media, als het serum wordt gebruikt, buis lassen het serum zak om de media-zak en meng goed. </li><li> Klem uit ongeveer 300 ml van media in de zak met behulp van grote tas klemmen. Dit zal ervoor zorgen dat alle geënte cellen worden gebruikt tijdens het vullen en niemand zijn die nog in de media zak. Leg media tas op zak staan. </li></ol> 5. Enten Media <ol><li> Vul een spuit met slang bevestigd met celsuspensie. Buis lassen 3 / 16 "slang van een spuit met celsuspensie aan de media tas. </li><li> Injecteer de celsuspensie in de Media Bag en meng goed. </li></ol> 6. Vul Procedure <ol><li> Buis lassen het geënte medium zak om 3 / 8 "liquid handling buis. Van de HyperStack schip (met een steriele aansluiting of Multipurpose verbindt (MPL), kunt u de media tas ook hechten aan het schip). </li><li> Sluit de klemmen op de liquid handling en jagen buizen op de HyperStack. </li><li> Plaats de HyperStack 36 Layer Schip in de CSM in de belasting positie, haak de beluchtingsfilter buis in de holding klem op de CSM. Draai het deksel en zet de CSM op de vulling positie. Door het schip in de juiste positie te vullen, het luchtfilter is nu in de hoogste positie om nat te voorkomen tijdens de werking te vullen. De 10 ° hoek vergunningen equilibratie van de vloeistof die de lagen tijdens het vullen. De HyperStack-12 laag schip op zijn kant op de vulling wig is in de juiste positie voor het vullen. </li><li> Heldere lucht uit de vullijn door het plaatsen van de zak op hetzelfde niveau als de HyperStack schip (niet hoger). Het houden van de jacht slangklem dicht, open de liquid handling slangklem en de media tas klem om de vloeistof te laten het schip in te voeren. </li><li> Met behulp van de zak staan, verhogen de media zak om de celsuspensie stroom in het vat te helpen. </li><li> Vul het vaartuig te schorsen totdat het al het geënte medium komt het schip, de 300 ml van de media moeten nog steeds in het bovenste gedeelte van de media zak. Verwijder de klem van de media zak om verder te gaan vullen van het schip. Als vloeibare benadert de bovenste lucht-spruitstuk, vertragen de fill rate door het verlagen van de media zak om te voorkomen over de vulling. Langzaam breng de vloeistof niveau om de vullijn en klem de liquid handling slang. </li></ol> 7. Isolatie Procedure voor Liquid Lock in de lagen <ol><li> Breng de HyperStack schip in de CSM aan het isolement positie, zodat beide sets spruitstukken zijn in de hoogste stand en laat de media zak onder de hoogte van het schip. De HyperStack-12 laag schip kan worden opgeheven in de isolatie positie door het plaatsen van een hand op de zijkant van het schip en met de andere om de vulling wig lift. </li><li> Met de jacht filter gehouden in een rechtopstaande positie, opent de jacht slangklem. Dit zal leeg is of de media terug te jagen in de liquid handling buis in de media zak. Zodra de slang leeg is, sluit de klem op de media zak slang. </li><li> Het houden van de jacht buis filter in een rechtopstaande positie, opent u de klem op de liquid handling buis op de HyperStack om eventuele resterende vloeistof binnen te komen en evenwicht in het vat. Wacht 1-2 minuten om dit te laten gebeuren. </li><li> Draai de HyperStack schip in de CSM, zodat de spruitstukken worden aan de linkerkant. Verlagen van het schip om de belasting positie op de CSM. Het schommelen van de HYPEStack-12 laag schip iets naar links zal het mogelijk het verwijderen van de vulling wig. Sluit de klemmen op zowel de achtervolging en de liquid handling buizen. </li><li> De media zak kan nu worden verwijderd uit het schip of het kan blijven zitten voor later gebruik in de oogst procedure. Voor het opslaan van de bijgevoegde media zak, rolt de lege zak en de resterende media in de zak en plaats onder de het behoud van bands in het opbergvak van de HyperStack schip. </li><li> Verplaats de HyperStack schip naar de incubator. Bij de uitvoering van het schip zorg moeten worden genomen om vloeibaar te houden van het invoeren van de ontluchter filter. Dit wordt bereikt door tikken op de veelvuldige einde van de HyperStack lichtjes omhoog. </li></ol> 8. Oogst Protocol <ol><li> Om te beginnen de oogst procedure, tube elkaar lassen van de cel dissociatie oplossing en lessen zakken naar het oogsten zak geheel vormen. Zorg ervoor dat alle slangen klemmen zijn gesloten. (Gebruik cartoon om aan te tonen) </li><li> Verwijderen HyperStack schip uit de incubator, laat de media tas van onder de behouden bands, en hang op de zak staan. Plaats het schip in de CSM in de belasting positie en draai de deksel om het schip veilig te stellen. Haak de ontluchting slang in de holding klem en zet de CSM op de vulling positie. </li><li> Ervoor zorgen dat de media tas op de zak stand is opknoping lager is dan de HyperStack, open de klem op de media zak slang en het schip liquid handling slang om media te stromen in de bijgevoegde zak. </li><li> Zodra het schip over gaat ¾ leeg is, wijzigt u de CSM instellingen om de laatste lege positie. Wanneer de HyperStack schip en liquid handling slangen leeg zijn, de slang lift naar de media jagen voorbij de klem op de gebruikte media zak slang, sluit zowel de klem op de liquid handling slang en de klem op de gebruikte media zak buizen. </li><li> Vervang de gebruikte media tas met het oogsten zak montage door buis lassen en verhogen de hoogte van de cel dissociatie zak montage boven de hoogte van de HyperStack met behulp van de tas staan. </li><li> Plaats de CSM in het evenwicht positie. Open de cel dissociatie oplossing slangklem en de oplossing te zetten in de HyperStack. Wanneer de overdracht voltooid is, sluit de klemmen op de liquid handling slang en de cel dissociatie oplossing buizen. </li><li> Breng CSM om de lading positie. Door vast te houden de horizontale positionering hendel te openen, schud het schip van links naar rechts met behulp van het wiel, het verdelen van de oplossing over de cel lagen. Het schip kan incidenteel worden teruggegeven aan de equilibratie positie tijdens schommelen om een ​​gelijke verdeling van de oplossing te behouden. Het kan niet duidelijk zichtbaar dat de lagen volledig bedekt, maar de dissociatie oplossing zal gelijkelijk worden verdeeld over het oppervlak van de cellen. Zodra de oplossing is adequate verdeling, laat u de hendel op de CSM om de HyperStack sluis in de belasting positie. Laat de HyperStack in deze positietijdens de vereiste dissociatie tijd voor je cellen. </li><li> Zodra de cellen hebben losgemaakt, het gebruik van troebelheid als een gids, de CSM naar de equilibratie positie. Zorg ervoor dat u niet meer dan verteren de cellen. Open de quench tas klem en de HyperStack liquid handling slangklem om de quench media om het schip in te voeren. Sluit de klem op de HyperStack liquid handling buis nadat de overdracht is voltooid. </li><li> Zet de CSM om de belasting positie en houd de horizontale positionering hendel om het schip naast rock kant. </li><li> Met behulp van de zak staan, hoe lager de positie van de oogst zak montage onder het niveau van de HyperStack. Stel de CSM naar de lege positie, opent u het schip liquid handling buis terug klem en breng de cel oplossing in de quench zak. Zet de CSM om de belasting positie en verwijder de oogst zak montage van het schip met behulp van een buis sealer. De cel oplossing is klaar voor verwerking. </li></ol> 9. Representatieve resultaten <ul><li> Oogsten tijd moet worden geoptimaliseerd bij het converteren van een standaard polystyreen oppervlak om de gasdoorlatend polystyreen oppervlak. Cellen hebben de neiging om sneller te release op het HyperStack product. </li><li> Om cellen onder de microscoop van de opening en de liquid handling leidingen dient te worden afgeklemd. Plaats de HyperStack schip ondersteboven, met de manifolds naar beneden, op de microscoop podium. </li><li> Preventie maatregelen kunnen worden genomen om te voorkomen dat het bevochtigen van de filters tijdens het gebruik dat zal ervoor zorgen dat ze ophouden te werken. Door niet meer dan het vullen van het HyperStack schip en houden van de opening en de achtervolging slangen verhoogd wanneer de klemmen open zijn, mag geen nat optreden. </li><li> De druk van de gesloten klemmen op de slang zorgt ervoor dat het gesloten blijven na de klemmen worden geopend. Knijpen de slang in de tegenovergestelde richting zal openen. </li><li> Mediastroom tijd binnenkomen en verlaten van de HyperStack schip via de zwaartekracht is gebaseerd op het media hoogteverschil tussen het hoogste niveau van de media in de HyperStack vat en het hoogste niveau van de media in de media container. De grotere afstand, hoe sneller de stroming. Het maximale debiet is beperkt door de rating van de filters om 1.5L/min. </li><li> Behoud van een goede vullen volume in de HyperStack schip zal voorkomen dat er lucht belvorming in de cel groeikamers. Luchtbellen kunnen optreden als gevolg van bemonstering of incuberen in een unhumidified milieu door verdamping water verlies. De bemonstering hoeveelheid en de frequentie en incubatie-omstandigheden zal bepalen of extra vocht moet worden toegevoegd door de eindgebruiker. </li></ul><img src="/files/ftp_upload/2499/2499fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Zuurstof uitputting van de media in een standaard celkweek schip. De figuur toont de daling in mg / L van zuurstof op het niveau van de cellen meer dan 3 dagen. <img src="/files/ftp_upload/2499/2499fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Zuurstof gradiënt in de media in een standaard celkweek schip. De figuur toont de mg / L van zuurstof is het grootst bij de media om kopruimte kruispunt dan op de cel-laag. <img src="/files/ftp_upload/2499/2499fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Percentage zuurstof in de tracheale ruimte van de HyperStack tijdens de celgroei. De figuur laat zien dat meer dan 96 uur, het percentage van zuurstof tussen de lagen, die elk gas permeabele bodem benodigdheden, constant blijft. Dit toont het vermogen van de cellen om zuurstof toegang tijdens de groei tot confluentie.

De HyperStack schip zuurstofdoorlatende technologie wordt gedekt onder US Patent #: 7745209. De auteurs zijn medewerkers van Corning Life Sciences, Inc, dat het instrument gebruikt in dit artikel oplevert.

HyperStack schip is succesvol uitgegroeid ontworpen, primaire en stamcellen. Vloeistof toevoegingen in het schip zijn uitgevoerd via een aseptische bag-verbindingen door de zwaartekracht voeden en ook door pompen uit een steriele media-container. Het schip biedt een groter dan 2,5 maal de stijging van de groei van een gebied ten opzichte van gestapelde plaat product van dezelfde volumetrische footprint. De HyperStack-12 is 6000 cm 2 groeigebied, de HyperStack-36 heeft 18.000 cm 2 groeigebied, en de HyperStack-120 heeft 60.000 cm 2 van de groei gebied. Door het vergroten van de oppervlakte, gebruikers in staat om meer cellen uit dezelfde cel bevolking of veel te produceren en variabiliteit te verminderen. Ze zijn ook in staat om ruimte en / of arbeid te besparen door het gebruik van minder schepen naar dezelfde cel uitgang te bereiken, of een mobiele productie toenemen zonder dat er mensen, cleanroom suites of incubators. Het systeem is geproduceerd met een laag fijn montage methoden en zonder het gebruik van lijmen. Het is een gesloten systeem dat is voorgemonteerd met slang sets en filters, drie zakken en steriel geleverd.

<table><tbody><tr><td>1.5L Medium in zak</td><td>Lonza Inc.</td><td>TBD</td><td>1350ml medium + 150ml serum (indien vereist)</td></tr><tr><td>4.0L Medium in zak</td><td>Lonza Inc.</td><td>TBD</td><td>3600ml medium + 400ml serum (indien vereist)</td></tr><tr><td>HYPERStack Vessel-12</td><td>Corning</td><td>10012</td><td></td></tr><tr><td>HYPERStack Vessel-36</td><td>Corning</td><td>10036</td><td></td></tr><tr><td>Vulwig</td><td>Corning</td><td>10040</td><td></td></tr><tr><td>Stack-manipulator</td><td>Corning</td><td>TBD</td><td></td></tr><tr><td>HyQtainer Sub-Assembly bemonsteringsapparaat</td><td>Hyclone</td><td>SH3B0324.01</td><td></td></tr><tr><td>600ml Quencher medium in zak (10% FBS IMDM)</td><td>Lonza Inc.</td><td>TBD</td><td></td></tr><tr><td>600ml Cel-dissociatie-oplossing</td><td>Lonza Inc.</td><td>TBD</td><td></td></tr></tbody></table>

gesloten systeem cultuur van de cel protocol gebruik hyperstack schepen met een zuurstofdoorlatende material technology

Closed System Cell Culture Protocol Using HYPERStack Vessels with Gas Permeable Material Technology

Groot volume aanhanger celcultuur is op dit moment gestandaardiseerd op gestapelde plaat celgroei producten die op de microdrager kralen niet een optimale keuze. HyperStack recipiënten gesloten systeem opschalen van de huidige gestapelde plaat producten en levert&gt; 2,5 maal meer cellen in dezelfde volumetrische footprint. De HyperStack schepen functie via gas doorlatend materiaal waardoor gasuitwisseling optreden, dus het elimineren van de noodzaak van interne vrije ruimte in een schip. De eliminatie van headspace kan het compartiment waar de celgroei plaatsvindt tot een minimum beperkt om ruimte te verminderen, waardoor meer lagen van de celgroei oppervlakte binnen hetzelfde volumetrische footprint. Voor vele toepassingen, zoals cel-therapie of productie van vaccins, is een gesloten systeem die nodig zijn voor celgroei en oogsten. De HyperStack schip maakt cel en reagens toevoegen en verwijderen via de slang van de media zakken of andere methoden. Dit protocol geeft uitleg over de technologie achter de gas doorlatend materiaal dat wordt gebruikt in de HyperStack schepen, gasdiffusie resultaten aan de metabole behoeften van de cellen, gesloten systeem celgroei protocollen, en verschillende oogstmethoden te voldoen.

Een inleiding in de techniek, het protocol en de behandeling van de Corning HyperStack Schepen en toebehoren gebruikt voor het hoog rendement aanhanger celcultuur. Het protocol zal laten zien hoe het gesloten systeem vaten voor het vergroten van cel-oogst te gebruiken dan de huidige gestapeld plaat producten.

Gesloten systeem Cultuur van de Cel Protocol gebruik HyperStack Schepen met een zuurstofdoorlatende Material Technology

Adherente celkweek in groot volume is momenteel gestandaardiseerd op celgroeiproducten met gestapelde platen wanneer microcarrier-beads geen optimale keuze zijn.

Het algemene doel van deze procedure is om het correcte gebruik van de Corning Hypers stack vessels als gesloten systeem te demonstreren. Dit wordt bereikt door de vaten eerst te inoculeren en te vullen met medium via de zwaartekrachtmethode. Vervolgens wordt de celsuspensie in elke laag geïsoleerd en worden de cellen geïncubeerd.Na de incubatie wordt het gebruikte medium verwijderd. De laatste stap van de procedure is het oogsten van de cellen uit de hypers stack-vaten. Uiteindelijk worden gasdiffusieresultaten verkregen om aan te tonen dat cellen toegang hebben tot zuurstof tijdens de groei naar confluentie bij gebruik van het gesloten hypers stack-systeem.Het belangrijkste voordeel van het hypers stack vessel met gasdoorlatend materiaal is dat het een vergroot oppervlak biedt voor celgroei. Door de headspace in het vat te elimineren, zal mijn collega p pardo nu een protocol voor een gesloten systeem demonstreren voor het gebruik van het hypers stack vessel. Het hypers stack vessel bestaat uit een stat, wat het individuele celkweekcompartiment is dat is samengesteld uit de bovenplaat en de gasdoorlatende film.De cellen worden in dit compartiment gekweekt. De vloeistofmanifold verbindt elke ette-laag binnen een module met elkaar. Modules zijn via slangetjes verbonden om reservoirs te vormen in veelvouden van 12 lagen.De manifold stelt de gebruiker in staat om één vloeistofmanipulatie op het gehele vat uit te voeren. De luchtmanifold verbindt ook de stat-lagen met elkaar, maar wordt gebruikt om lucht uit het vat te verdrijven wanneer vloeistoffen worden toegevoegd en bevat een vullijn voor gebruik tijdens het vullen tussenbeidse stappen. De stat-laag is een open luchtruimte, genaamd de tracheale ruimte, waardoor gasuitwisseling kan plaatsvinden via de gasdoorlaatbare film van elke laag.De slang voor vloeistofbehandeling is verbonden met het vloeistofverdeelstuk en is een aanpasbaar component dat wordt gebruikt voor alle vloeistofmanipulaties in een gesloten systeem om overtollige lucht te laten ontsnappen terwijl de steriliteit behouden blijft. De ontluchtingsslang wordt gebruikt. De ontluchtingsslang is verbonden met het luchtverdeelstuk en bevat een luchtfilter.Aan de slangen voor vloeistofbehandeling zijn de aandrijfslang en het filter verbonden, die worden gebruikt om de vloeistof uit de slangen voor vloeistofbehandeling te trekken nadat het vat is gevuld. In dit protocol wordt ook de Corning Stack manipulator of CSM gebruikt, een hanteerapparaat dat helpt bij het plaatsen van de vaten in de juiste posities tijdens het gebruik. In deze demonstratie wordt celkweek in een gesloten systeem getoond voor een gasdoorlatend vat met 36 lagen.Bij het gebruik van een CSM kunnen details voor het uitvoeren van deze procedure op een vat met 12 lagen met behulp van een vulwig worden gevonden in het bijbehorende schriftelijke protocol. Begin met het bereiden van 3,9 liters bagged media voordat de mediatube wordt geïnoculeerd. Voeg de serumzak toe aan de mediapzak en meng grondig om de gewenste serumconcentratie te verkrijgen.Klem ongeveer 300 milliliter medium in de zak af met grote zakkenklemmen. Dit zorgt ervoor dat alle geïnoculeerde cellen tijdens het vullen worden gebruikt en dat er geen cellen in de mediumzak achterblijven. Plaats het medium op een zakkenstandaard om het medium te inoculeren.Vul een spuit die is verbonden met slang met de cel-suspensie. Bevestig de spuit met de cel-suspensie aan de mediumzak middels tube welding. Gebruik een stuk slang van 3 over 16 inch van de spuit naar de zak.Injecteer de celsuspensie in de mediazak en meng dit goed. De geïnoculeerde mediazak kan met behulp van tube welding of multifunctionele connectoren worden bevestigd aan de drie over acht inch vloeistofbehandelingsslang van het vat. Vandaag maken we gebruik van tube welding.Sluit de klemmen op de vloeistofbehandeling- en spoeltubuli van het vat. Plaats het vat met 36 lagen in de laadpositie van de CSM. Bevestig de ontluchtingsfiltertubulus in de houderklem op de CSM.Draai het deksel vast en breng de CSM naar de vulpositie, zodat het luchtfilter in de hoogste positie komt te staan om bevochtiging tijdens de vuloperatie te voorkomen. De hoek van 10 graden maakt tevens een equilibratie van de vloeistof naar de lagen mogelijk tijdens het vullen, waarbij lucht uit de vullijn wordt verdreven. Positioneer de mediabag op hetzelfde niveau als het vat, terwijl de klem van de chase-tube gesloten blijft.Open de klem van de vloeistofoverdrachtbuis en de klem van de mediumzak om vloeistof in het vat te laten stromen. Til de mediumzak met behulp van het zakkenstatief omhoog om de cel-suspensie in het vat te laten vloeien. Vul het vat totdat al het geïnoculeerde medium in het vat is gestroomd.Het bovenste gedeelte van de mediabag moet nog 300 milliliters medium bevatten. Verwijder de klem van de mediabag om het vat verder te vullen naarmate de vloeistof het bovenste luchtverdeelstuk nadert. Verlaag de mediabag om de vulsnelheid te vertragen en overvulling te voorkomen.Breng het vloeistofniveau langzaam tot aan de vullijn en klem de slang voor vloeistofbehandeling af. Breng het vat in de CSM naar de isolatiepositie en plaats beide sets manifolds in de hoogste positie. Laat de mediabag zakken tot onder de hoogte van het vat.Open de klem van de spoelbuis terwijl het spoelfilter in een rechtopstaande positie wordt gehouden. Hierdoor wordt het medium in de vloeistofbehandelingsbuis geleegd of teruggespoeld naar de mediumzak. Zodra de slang leeg is, sluit u de klem op de slang van de mediumzak.Houd het filter van de chase-buis in een rechtopstaande positie. Open de klem op de vloeistofbehandelingsbuis van het vat om eventuele resterende vloeistof in het vat te laten stromen en te laten equilibreren. Wacht één tot twee minuten tot dit is gebeurd.Draai vervolgens het vat in de CSM zodat de manifolds zich aan de linkerkant bevinden. Breng het vat naar de laadpositie op de CSM. Sluit de klemmen op zowel de chase- als de vloeistofbehandelingsslangen.De mediabag kan nu uit het vat worden verwijderd, of hij kan bevestigd blijven voor later gebruik tijdens de oogstprocedure. Om de bevestigde mediabag op te bergen, rolt u de mediabag op en plaatst u deze onder de bevestigingsbanden in de opbergtray van het vat. Plaats het vat tot slot in de incubator. Let er bij het transporteren van het vat op dat er geen vloeistof in het luchtventilatiefilter terechtkomt.Dit wordt bereikt door het uiteinde van het manifold lichtjes omhoog te kantelen. Om de oogstprocedure te starten, last u de cellenassociatie-oplossing en de quench-zakken aan elkaar om de oogstzak-assemblage te vormen; zorg ervoor dat alle slangkenmerken gesloten zijn. Verwijder het vat uit de incubator en plaats het in de CSM in de laadpositie.Maak de mediumzak los van onder de bevestigingsbanden en hang deze aan het statief. Draai vervolgens het deksel vast om het vat te verzegelen. Bevestig de ontluchtingsslang in de klem en verplaats de CSM naar de vulpositie.Zorg ervoor dat de mediabaag aan het bagstatief lager hangt dan het vat. Open de klem op de slang van de mediabaag en de vloeistofbehandelingsslang van het vat om het medium in de aangekoppelde baag te laten stromen. Zodra het vat voor ongeveer driekwart leeg is, wijzigt u de CSM-instellingen naar de definitieve lege positie.Wanneer het vat en de slangen voor vloeistofbehandeling leeg zijn, til de slangen op om het medium voorbij de klem op de slang van de zak voor verbruikt medium te duwen. Sluit vervolgens zowel de klem op de slang voor vloeistofbehandeling als de klem op de slang van de zak voor verbruikt medium. Vervang de zak voor verbruikt medium door de oogstzak-assemblage middels tube welding.Verhoog de montage van de cel-dissociatiezak met behulp van de zakhouder tot boven de hoogte van het vat. Plaats de CSM in de vulpositie. Open de klem van de buis voor de cel-dissociatieoplossing en de klem van de oogstzakmontage en overbreng de oplossing naar het vat.Wanneer de overdracht is voltooid, sluit u de klemmen op de slang voor vloeistofbehandeling en de slang voor de cel-dissociatieoplossing. Breng vervolgens de CSM naar de laadpositie terwijl u de hendel voor de horizontale positionering openhoudt. Schommel het vat voorzichtig heen en weer met behulp van het wiel, zodat de oplossing over de cellagen wordt verdeeld.Om een gelijkmatige verdeling van de oplossing te waarborgen, kan het vat tijdens het schudden af en toe worden teruggebracht naar de vulpositie. Zodra de oplossing adequaat is verdeeld, laat u de hendel van de CSM los om deze in de vulpositie te vergrendelen. Laat het vat in deze positie staan gedurende de vereiste dissociatietijd voor de cellen.Gebruik de troebeling als richtlijn om de loslating van de cellen te bepalen. Zodra de cellen zijn losgelaten, verplaatst u het CSM naar de laadpositie. Open de klem van de quench-zak en de klem van de vloeistofbehandelingsslang om het quench-medium in het vat te laten stromen.Sluit de klem op de slang voor vloeistofbehandeling. Zodra de overdracht is voltooid, brengt u de CSM terug naar de laadpositie en houdt u de hendel voor de horizontale positionering vast om het vat van links naar rechts te kantelen. Verlaag met behulp van de zakhouder de positie van de oogstzakassemblage tot onder het niveau van het vat.Zet de CSM in de lege positie. Open de klem van de vloeistofbehandelingsbuis van het vat en breng de celoplossing terug naar de quench-zak. Zet de CSM terug in de laadpositie en ontkoppel de oogstzakassemblage van het vat met behulp van een buisdichter.De celoplossing is nu gereed voor verwerking in traditionele celgroeisystemen. Bij Headspace raakt de zuurstof in het medium gedurende drie dagen met gemiddeld 50% uitgeput. In de cultuur laat deze figuur de afname in milligram per liter zuurstof op het niveau van de cellen over tijd zien in hetzelfde groeisysteem; de zuurstofgradiënt over een mediumhoogte van drie millimeter is bij de overgang van medium naar Headspace bijna 50% groter dan bij de cellaag.Het zuurstofpercentage in de tracheale ruimte van de hypers-stack tijdens de celgroei wordt weergegeven. De figuur laat zien dat over 96 uur het zuurstofpercentage tussen de lagen, dat elke gasdoorlatende filmbodem van zuurstof voorziet, constant blijft. Dit demonstreert het vermogen van de cellen om toegang te krijgen tot zuurstof tijdens de groei tot confluentie.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een Corning Hypers stack vessel in het gesloten systeem vult en oogst.

closed-system-cell-culture-protocol-using-hyperstack-vessels-with-gas

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Fabricage en validatie van een add-on platform dat betere controle over de ruimtelijke en temporele oxygenatie in een 6-wells plaat biedt. Het apparaat is aan te passen aan een aantal cultuur-systemen en kan worden gebruikt om de effecten van zuurstof op wondgenezing te onderzoeken.

Fabricage en exploitatie van een zuurstof Inzetstuk voor hechtend Cellular Culturen

Een compartimentering microfluïdische apparaat voor het onderzoeken van kanker stamcellen migratie wordt beschreven. Deze roman platform creëert een levensvatbare cellulaire micro-omgeving en maakt microscopische visualisatie van levende cellen voortbewegen. Zeer beweeglijke kankercellen worden geïsoleerd om moleculaire mechanismen van agressieve infiltratie, wat kan leiden tot een meer doeltreffende toekomstige therapieën te bestuderen.

Evaluatie van kankerstamcel Migratie Met behulp van compartimentering microfluïdische apparaten en live cell imaging

Een roterende celcultuur die het mogelijk maakt epitheliale cellen om te groeien onder fysiologische omstandigheden resulteert in 3-D cellulaire totale formatie wordt beschreven. De aggregaten gegenereerde...

Kweken en Toepassingen van Rotating muur Schip Bioreactor Afgeleid 3D epitheelcellen modellen

We hebben een geautomatiseerde celkweek en verhoor platform ontwikkeld voor micro-schaal cel stimulatie experimenten. Het platform biedt eenvoudige, veelzijdige en precieze controle in het cultiveren en stimuleren van kleine populaties van cellen en het terugwinnen van lysaten voor moleculaire analyses. Het platform is geschikt voor studies die kostbare cellen en / of reagentia.

Een veelzijdige Geautomatiseerde platform voor micro-schaal cel stimulatie Experimenten

Dit protocol beschrijft een werkwijze voor de tijdelijke permeabilisatie van hechtende cellen met een inert gas jet. Deze techniek bevordert de overdracht van genetisch materiaal en biomoleculen in hechtende zoogdiercellen door het gebruik van mechanische krachten op het plasmamembraan verstoren.

Permeabilisatie van Gekleefd cellen met behulp van een inert gas Jet

Hier is een protocol om pluripotente stamcellen (PSC) en neurale stamcellen (NSC) te kweken in een gesloten celkweeksysteem dat maximale steriliteit en reproduceerbaarheid mogelijk maakt, waardoor de traditionele bioveiligheidskast en incubator worden vervangen. Deze apparatuur voldoet aan de richtlijnen voor goede klinische fabricagepraktijken (cGMP) en goede laboratoriumpraktijken (cGLP).

Het kweken van pluripotente menselijke en neurale stamcellen in een afgesloten cel Cultuur System for Basic en preklinisch onderzoek

Hier presenteren we een protocol voor het isoleren en kweken van enkele cellen met een microfluïdische platform, dat een nieuw microwell-ontwerpconcept gebruikt om hoogwaardige isolatie van enkele cellen en langdurige klonale kweek mogelijk te maken.

Een microfluïdische platform voor High-throughput Single-cell Isolatie en Cultuur

We presenteren een microfluïdische Cancer-on-chip-model, de "Evolution Accelerator"-technologie, die een controleerbaar platform biedt voor langdurige realtime kwantitatieve studies van kanker dynamiek binnen goed gedefinieerde omgevingscondities op de eencellige Niveau. Deze technologie wordt verwacht te werken als een in vitro model voor fundamenteel onderzoek of pre-klinische ontwikkeling van de drug.

Generatie van heterogene drugs gradiënten over kanker populaties op een Microfluïdische evolution Accelerator voor real-time observatie

Hier presenteren we een protocol om aanhangende cellen uit meerlaagse kolven op een gesloten semi-geautomatiseerde manier te oogsten met behulp van een tegenstroomcentrifugatiesysteem. Dit protocol kan worden toegepast voor het oogsten van zowel adherente als suspensiecellen van andere celexpansieplatforms met weinig aanpassingen aan de bestaande stappen.

Menselijke mesenchymale stamcelverwerking voor klinische toepassingen met behulp van een gesloten semi-geautomatiseerde workflow

Hier presenteren we een protocol om de grootschalige productie van aanhangende cellen te bereiken via een volledig gesloten systeem op basis van GMP-kwaliteit oplosbare microdragers. De kweek van menselijke mesenchymale stamcellen, HEK293T cellen en Vero-cellen werd gevalideerd en voldeed aan zowel de kwantiteitseisen als de kwaliteitscriteria voor de cel- en gentherapie-industrie.

Grootschalige celproductie op basis van GMP-kwaliteit oplosbare poreuze microdragers

Leer het gesloten systeem protocol voor celkweek met Corning HYPERStack vaten met gasdoorlatende technologie. Deze methode maximaliseert oppervlakte voor celgroei en verbetert oogstefficiëntie aanzienlijk.

Gesloten systeem Cultuur van de Cel Protocol gebruik HyperStack Schepen met een zuurstofdoorlatende Material Technology

Meer video's verkennen