Het laden van Drosophila zenuwuiteinden met Calcium-indicatoren

Hallo, mijn naam is Greg McLeod. Mijn laboratorium bestudeert calciumregulatie in zenuwuiteinden en de impact hiervan op neurotransmissie. We doen dit bij Oph Melanogaster.

De fruitvlieg is een aantrekkelijk model voor neurowetenschappers vanwege de genetische kneedbaarheid en het eenvoudige, toegankelijke zenuwstelsel. In dit zenuwstelsel zijn genetisch gecodeerde fluorescente indicatoren beschikbaar om calciumveranderingen in zenuwuiteinden te detecteren. Deze indicatoren hebben echter een beperkte gevoeligheid voor calcium en vertonen vaak een niet-lineaire respons.

Synthetische indicatoren zijn beter geschikt voor het meten van de snelle calciumveranderingen die gepaard gaan met zenuwactiviteit. We demonstreren een techniek voor het laden van met dextrine geconjugeerde synthetische calciumindicatoren in levende zenuwuiteinden in oph lava. Dextrine-conjugatie helpt te voorkomen dat calciumindicatoren worden vastgelegd in organellen zoals mitochondriën.

De laadtechniek kan op dezelfde wijze worden toegepast op larven, embryo's en adulten. We zullen een larve dissekeren in een klein badje met cigarillo-vorm op een glazen objectglas. De blauwe dentale was dient ter ondersteuning van het glazen laadbed.

Neem een derde stadium dwalende larve uit sterlava aan de zijkant van een onbezet vial. Plaats de larve in enkele druppels gekoelde Schneider-oplossing en zet deze vast via de kop en staart met de dorsale middellijn naar boven. Gebruik een scherp paar microschaartjes om een inkeping te maken.

Maak een kleine incisie tussen de tra hier, groot genoeg om het onderste blad van de schaar door te laten dringen. Snijd door de cuticula langs de dorsale middenlijn tussen de traia helemaal tot aan de kop. Draai de larve 180 graden en breid de incisie uit tot aan de staart.

Het is belangrijk dat het onderste mes niet te diep in de viscera dringt, maar bij de larve blijft, aangezien dit de spieren en zenuwen beschadigt die men wil onderzoeken. Het grootste deel van de viscera zal door de incisie naar boven komen; knip hier het traject dicht bij de staart door, en knip vervolgens door de onderliggende trachea helemaal tot aan de kop. Herhaal dit aan de andere zijde.

Verwijder het grootste deel van de viscera door deze weg te snijden en uit het bad te halen. Leg de schaar neer en pak een tweede pincet. Pak de gesneden rand van de cuticula vast en zet deze aan één zijde vast.

Herhaal dit voor de andere zijde. Ga vier segmenten richting de kop om de procedure te herhalen. Trim eventuele overgebleven viscerale resten in deze fase. Zorg ervoor dat er geen schade is toegebracht aan spieren 7, 6, 13 of 12 in een van de segmenten.

Indien er beschadigingen zijn ontstaan, dissecteer dan een andere lava, aangezien deze schade onvermijdelijk leidt tot genische contracties die elke daaropvolgende beeldvorming problematisch maken. De hersenhemisferen, het ventrale ganglion en de segmentzenuwen zijn nu zichtbaar in de volgende stappen. We trekken het door druk gesneden uiteinde van de segmentzenuw in een glazen FOP-bed en gebruiken een plastic vulfilament om een calciumindicator aan te brengen op het blootgestelde uiteinde van de zenuw.

Maar eerst demonstreren we hoe u de vuldraad en het vuleffect maakt om de vuldraad te vervaardigen. De tweestaps-trektechniek wordt toegepast op een geel defect exemplaar, dat langzaam tot over de helft van de lengte wordt verhit totdat het plastic zacht en transparant wordt. Stop op dit punt met het verhitten en trek onmiddellijk de punt omhoog om deze tot een fijne draad uit te trekken.

Dat is ongeveer een halve millimeter in diameter. Snijd het filament op een lengte van 50 millimeters. Plaats het filament nu onder een dissectiemicroscoop en veranker het uiteinde.

Eindig met een nagel en trek het andere uiteinde weg om een fijne filament van één centimeter lang uit te trekken. Deze moet met een nieuw scheermesje op vloeipapier worden doorgesneden om te voorkomen dat het filament wordt platgeduwd, om de vulling gereed te maken. Begin met een dunwandige capillair zonder filament.

Trek het uit tot een fijne, taps toelopende punt met een pet-puller. Neem dit voorbereide onderdeel naar een dissectiescoop en kras het taps toelopende gedeelte in met een stukje schuurpapier. Duw de punt distaal van de inkeping weg van de kant van de inkeping, zodat de punt recht afbreekt.

De binnendiameter van de breuk moet groter zijn dan de buitendiameter. Gebruik aan het einde van de vulfilament gebruik een micro-foet om de breuk in het glas te krimpen tot een binnendiameter van ongeveer 12 micron is bereikt. Gebruik een Bunsenbrander om het stompe uiteinde van de pipette te polijsten.

Er kan onderdruk worden uitgeoefend op het stompe uiteinde van het effect met behulp van een nauw aansluitende Celtic-buis, gekoppeld aan stijve polyline-slangen en een injectiespuit. Dezelfde buis en spuit worden gebruikt om de calciumindicator uit de filament op te zuigen en uit te stoten. De calciumindicator moet worden opgelost in gedestilleerd water tot een concentratie van vijf milli.

Verdeel deze oplossing in aliquots van vijf microliters. Bewaar deze bij vier graden. Vries deze aliquots niet om ze onbevroren te houden tot ze nodig zijn.

Zuig nu één tot twee centimeter van de calciumindicator op in de filament en u bent klaar om over te gaan naar de meest kritische stap van deze laadtechniek. Gebruik uw schaar en pincet om de meest anterieure segmentzenuwen individueel en dicht bij de ventrale ganglia door te knippen. De meest anterieure segmentzenuwmassa vanuit de ventrale zijde.

Verwijder eventuele resten. Plaats het vullingsfilament op de tandheelkundige washelling met de punt in het centrum van de larve. Bevestig de scholastische slang en spuit.

Zuig een kleine hoeveelheid Schneider-oplossing op in een perfect-tip. Zuig vervolgens het uiteinde van de zenuw op in de perfect-tip. De passing moet nauwsluitend zijn, maar niet te strak.

Het moet verdere toegang van de Schneiders tot het protect blokkeren. Verwijder over het algemeen de scholastische buis en spuit en bevestig deze aan het F-filament. Raak met de zijkant van het filament de Schneiders in het bad aan om eventuele statische elektriciteit te ontladen en voeg het filament-gom-effect onmiddellijk binnen 50 microns bij de doorsnede van de zenuw in zonder deze daadwerkelijk aan te raken.

Voeg langzaam calciumindicator toe om het volume van de Schneider-oplossing met ongeveer een derde te vergroten. Dit resulteert in een uiteindelijke calciumindicatorconcentratie van net onder 2 mM; bewaar het preparaat vervolgens gedurende ongeveer 40 minuten op kamertemperatuur op een donkere, vochtige plek. Hierbij wil ik twee belangrijke punten benadrukken.

Ten eerste moet er een fysiologische oplossing in de tip aanwezig zijn om de calciumindicator te verdunnen, aangezien de calciumindicator enkel in water werd opgelost. De fysiologische oplossing moet calcium bevatten in een concentratie van enkele millimolar, omdat axon-sealing een calciumafhankelijk proces is en axon-sealing essentieel is om de gezondheid van de zenuwuiteinden te behouden.

Het tweede punt is dat er niet meer dan vijf minuten mogen verstrijken tussen het doorsnijden van de zenuwen en het aanbrengen van de kleurstof op het doorgesneden uiteinde van de zenuw. Na vijf minuten zullen de uiteinden van de axonen de met dextrine geconjugeerde calciumindicatoren met molecuulgewichten van 10.000 uitsluiten. Het halen van deze tijdslimiet zal enige oefening vereisen.

Probeer de axonale ceiling niet te vertragen door de calciumspiegels te verlagen, aangezien dit de toekomstige fysiologische functie van de zenuwbeschadiging in gevaar zal brengen. Na de incubatie van 40 minuten in Schneiders-medium, raak met de vullingsfilament de zijkant van het bad aan en voer deze opnieuw in om het grootste deel van de calciumindicatoroplossing uit de tip en de starter te verwijderen. Gebruik vervolgens de filament opnieuw om vers Schneiders-medium uit het bad op te zuigen en vul het bed volledig met Schneiders-medium.

Er mogen geen luchtbellen in het bed aanwezig zijn, aangezien de Schneider-oplossing als een van de geleiders zal dienen en geïsoleerd moet zijn van het bad. Terwijl de glazen pet de zenuw stimuleert, dient het preparaat opnieuw gedurende ten minste 60 minuten, maar niet langer dan vier uur, op een donkere plek te worden geplaatst; spoel het preparaat tijdens de incubatie elke 30 minuten met verse Schneider-oplossing. De calciumindicator wordt getransporteerd. Het axon concentreert zich in de zenuwuiteinden 20 minuten voordat u het preparaat wilt onderzoeken. Spoel het vervolgens met HL 6-oplossing.

Houd het gewenste calciumgehalte aan wanneer het calciumgehalte boven ongeveer 0,4 millimolair ligt, bij glutamaat of L-glutaminezuur in de HL6 op zeven millimolair om zenuwopwekkende spiercontractie te stoppen. Schneider's oplossing is niet geschikt voor calcium-imaging, aangezien deze al hoge concentraties van zowel glutamaat als calcium bevat. Deze concentraties zult u willen aanpassen.

Tate is ook aanwezig, waardoor Schneider's autofluorescerende laden en beeldvorming kunnen worden uitgevoerd in HL zes, zolang er tijdens het laden calcium aanwezig is van ten minste 2 miljoen. Bij het opstellen van de preparatie op een compoundmicroscoop voor beeldvorming, moet u opnieuw ervoor zorgen dat alle statische elektriciteit wordt ontladen. Raak vervolgens met een pincet zowel de oplossing in het bad als het objectief aan.

Als het objectief een immersie-objectief is, breng dit dan naar het bad, en stel de basis kortstondig in, of plaats er één in het bad en voeg de andere toe door het bed te vullen. DC-pulsen van minder dan drie volt en een duur van 300 microseconden zullen betrouwbaar een actiepotentiaal in de zenuw opwekken. Hier zien we dat twee sets zenuwuiteinden in de spleet tussen spier zes en zeven zichtbaar zijn gemaakt door de cytosolische expressie van GFP aan te sturen. Ze zijn daarnaast voorvuld met de calciumindicator Rod Dextrin, die andere excitatie- en emissiespectra heeft dan GFP.

Dit gezichtsveld bevat nog steeds de zenuwuiteinden, maar Rod Rin heeft een lage affiniteit voor calcium en is bijna onzichtbaar terwijl de zenuw in rust is. Het is echter zeer responsief voor het calcium dat de uiteinden binnentreedt tijdens enkele actiepotentialen of korte stimulusreeksen van twee seconden. Zoals hier te zien is in de fluorescentieanalyse van de zojuist getoonde, dicht op elkaar volgende 80 hertz-reeksen, zijn de responsen in de type 1 S-uiteinden gewoonlijk groter dan die in de type 1 B-uiteinden.

Calciumindicatoren met een lage affiniteit zoals rod dextrine en flu. Een vier-dextrine vertoonde een bijna lineaire respons op zenuwstimulatiefrequenties in deze terminals over een bereik van 10 tot 80 hertz. Het hier getoonde voorbeeld is afkomstig van een zenuwterminal op spier nummer vier, geladen met rod dextrine.