Name: Het laden van Drosophila zenuwuiteinden met Calcium-indicatoren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-30T00:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 16 s
Description: Leer een techniek voor het laden van calcium-indicatoren in Drosophila-zenuwuiteinden. Deze methode maakt het mogelijk om calciumdynamica en neurotransmissie in vivo te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li> Kies een schone dissectie gerecht dat niet is blootgesteld aan fixatieven. </li><li> Ontleden een zwervend 3 e instar Drosophila larven in Schneider Drosophila Medium met Ca 2 + en L-glutamine, (niet knippen geen zenuwen of schade spiervezels nrs. 7, 6, 13 of 12). </li><li> Selecteer een glazen invulling pipet met een 12 micron tip (inwendige diameter). </li><li> Met behulp van een spuit en slangen (negatieve druk uit te oefenen op de pipet) zorgen ervoor dat de pipet tip niet wordt belemmerd. </li><li> Selecteer een fijne plastic vulling-filament die kunnen worden ingevoegd over de lengte van de glazen pipet. </li><li> Teken ~ 1 cm van 5 mM dextran-geconjugeerd Ca 2 +-indicator in de plastic gloeidraad. </li><li> Snij alle segmenten zenuwen. </li><li> Ondersteuning van de pipet op een helling die het mogelijk maakt de pipet tip om het ventrale middellijn van het ontleed larve aanpak. </li><li> Teken het afgesneden uiteinde van een zenuw te segmenteren No.4, zonder te knellen de zenuw, in het uiteinde van de pipet (inclusief een kleine hoeveelheid van het medium Schneider). </li><li> Verwijder de slang en plaats de plastic gloeidraad in de pipet tot het einde van de gloeidraad wordt binnen 50 micron van het afgesneden uiteinde van de zenuw (vermijd het aanraken van de zenuw). </li><li> Eject voldoende Ca 2 +-indicator op de zenuwuiteinden om het volume van het medium Schneider te verhogen met ongeveer 33% (uiteindelijke concentratie moet worden &lt;2mm). Belangrijk - Dit moet binnen 5 minuten van het snijden van de zenuw. </li><li> Plaats de bereiding in het donker bij kamertemperatuur, terwijl de zenuw wordt geladen. </li><li> Na 40 minuten verwijderd van de Ca 2 +-indicator met behulp van de gloeidraad. </li><li> Laat de pipet op zijn plaats en vullen met verse medium Schneider, omdat dit zal worden gebruikt om het stimuleren van pulsen van toepassing op de zenuw. </li><li> Laat de Ca 2 +-indicator in de zenuw equilibreren voor ten minste 60 minuten, maar niet meer dan 4 uur, vóór de aanvang van Ca 2 +-imaging. </li><li> Spoel het preparaat met medium verse Schneider elke 30 minuten tijdens het equilibreren. </li><li> 20 minuten voor imaging vervangen Schneider medium met hemolymfe-Like No.6 oplossing (HL6; Macleod et al. 2002;. 2003). </li><li> L-glutaminezuur of glutaminaat kunnen worden toegevoegd aan HL6 oplossing bij 7 mm aan de postsynaptische glutamaat receptoren ongevoelig voor zenuw opgewekte spiercontractie te voorkomen (Macleod et al., 2004;. Reiff et al., 2002;. 2005). </li></ol>

<ol><li>Macleod, G. T., Hegstrom-Wojtowicz, M., Charlton, M. P., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+calcium+signals+in+Drosophila+motor+neuron+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Fast calcium signals in Drosophila motor neuron terminals.</a> J. Neurophysiol. 88, 2659-2663 (2002).</li>
<li>Macleod, G. T., Suster, M. L., Charlton, M. P., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+neuron+activity+in+the+Drosophila+larval+CNS+detected+with+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Single neuron activity in the Drosophila larval CNS detected with calcium indicators.</a> J. Neurosci. Methods. 127, 167-178 (2003).</li>
<li>Macleod, G. T., Marin, L., Charlton, M. P., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+vesicles%3A+test+for+a+role+in+presynaptic+calcium+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptic vesicles: test for a role in presynaptic calcium regulation.</a> J. Neurosci. 24, 2496-2505 (2004).</li>
<li>Reiff, D. F., Thiel, P. R., Schuster, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+active+zone+density+during+long-term+strengthening+of+Drosophila+neuromuscular+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of active zone density during long-term strengthening of Drosophila neuromuscular junctions.</a> J. Neurosci. 22, 9399-9409 (2002).</li>
<li>Reiff, D. F., Ihring, A., Guerrero, G., Isacoff, E. Y., Joesch, M., Nakai, J., Borst, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+performance+of+genetically+encoded+indicators+of+neural+activity+in+flies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo performance of genetically encoded indicators of neural activity in flies.</a> J. Neurosci. 25, 4766-4778 (2005).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te melden.

<table><tbody><tr><td>Schneider&amp;rsquo;s Insect Medium</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0146</td><td>moet L-glutamine en calcium bevatten</td></tr><tr><td>L-glutaminezuur mononatriumzouthydraat</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1626</td><td></td></tr></tbody></table>

het laden van drosophila zenuwuiteinden met calcium-indicatoren

Loading Drosophila Nerve Terminals with Calcium Indicators

Calcium speelt vele rollen in het zenuwstelsel, maar niemand meer indrukwekkend dan als de trigger voor neurotransmitter release, en niemand meer diepgaand dan als de boodschapper van essentieel belang voor de synaptische plasticiteit dat leren en het geheugen ondersteunt. Om verder ophelderen van de moleculaire onderbouwing van Ca 2 +-afhankelijke synaptische mechanismen, is een model-systeem vereist dat zowel genetisch kneedbaar en fysiologisch toegankelijk. Drosophila melanogaster voorziet in een dergelijk model. In dit systeem, genetisch gecodeerde fluorescerende indicatoren zijn beschikbaar om Ca 2 + de opsporing van wijzigingen in de zenuwuiteinden. Echter, deze indicatoren beperkt de gevoeligheid voor Ca 2 + en vertonen vaak een non-lineaire respons. Synthetische fluorescerende indicatoren zijn beter geschikt voor het meten van de snelle Ca 2 + veranderingen die gepaard gaan met de activiteit van de nervus. Hier laten we zien een techniek voor het laden van dextran-geconjugeerde synthetische Ca 2 +-indicatoren in live zenuwuiteinden in Drosophila larven. Bijzondere nadruk wordt gelegd op die aspecten van het protocol het meest kritisch voor het succes van de techniek, zoals hoe je statische elektriciteit ontladingen te voorkomen langs de geïsoleerde zenuwen, het handhaven van de gezondheid van de voorbereiding tijdens lange laad-periodes, en te zorgen voor axon overleven door het verstrekken van Ca 2 + het bevorderen van afdichten van afgehakte axon einde. Lage affiniteit dextran-geconjugeerd Ca 2 +-indicatoren, zoals fluo-4 en Rhod, zijn beschikbaar die een hoge signaal-ruisverhouding zien, terwijl minimaal te verstoren presynaptische Ca 2 + dynamiek. Dextran-conjugatie helpt te voorkomen dat Ca 2 +-indicatoren worden afgezonderd in de organellen, zoals mitochondriën. De laad-techniek kan ook toegepast worden op larven, embryo&#39;s en volwassenen.

Calcium is een alomtegenwoordige boodschapper in het zenuwstelsel, essentieel voor het activeren van vrijkomen van neurotransmitters en veranderingen in de synaptische sterkte. Hier laten we zien een techniek voor het laden van Ca 2 +-indicatoren in Drosophila zenuwuiteinden. We tonen ook aan de fabricage van de benodigde apparatuur en benadrukken punten van cruciaal belang voor het succes van de techniek is.

Het laden van Drosophila zenuwuiteinden met Calcium-indicatoren

Calcium vervult vele rollen in het zenuwstelsel, maar geen enkele is indrukwekkender dan die als trigger voor de afgifte van neurotransmitters, en geen enkele is ingrijpender dan als ...

Hallo, mijn naam is Greg McLeod. Mijn laboratorium bestudeert calciumregulatie in zenuwuiteinden en de impact hiervan op neurotransmissie. We doen dit bij Oph Melanogaster.De fruitvlieg is een aantrekkelijk model voor neurowetenschappers vanwege de genetische kneedbaarheid en het eenvoudige, toegankelijke zenuwstelsel. In dit zenuwstelsel zijn genetisch gecodeerde fluorescente indicatoren beschikbaar om calciumveranderingen in zenuwuiteinden te detecteren. Deze indicatoren hebben echter een beperkte gevoeligheid voor calcium en vertonen vaak een niet-lineaire respons.Synthetische indicatoren zijn beter geschikt voor het meten van de snelle calciumveranderingen die gepaard gaan met zenuwactiviteit. We demonstreren een techniek voor het laden van met dextrine geconjugeerde synthetische calciumindicatoren in levende zenuwuiteinden in oph lava. Dextrine-conjugatie helpt te voorkomen dat calciumindicatoren worden vastgelegd in organellen zoals mitochondriën.De laadtechniek kan op dezelfde wijze worden toegepast op larven, embryo's en adulten. We zullen een larve dissekeren in een klein badje met cigarillo-vorm op een glazen objectglas. De blauwe dentale was dient ter ondersteuning van h

loading-drosophila-nerve-terminals-with-calcium-indicators

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We structurele kenmerken van de Glia-neuromusculaire synapsen beschreven in een roman Inside-out het prepareren van weefsels van levende larven gebruik van fluorescerende kleurstoffen met confocale microscopie. We leven zenuwuiteinden gelabeld met fluorescente primaire antilichamen tegen HRP, en ook gevisualiseerd het perisynaptic ruimte met fluorescerende dextranen.

Het visualiseren van de Live- Drosophila Gliale-neuromusculaire Junction met fluorescente kleurstoffen

We beschrijven een gevestigde techniek om te meten en geur-opgeroepen calcium antwoorden te analyseren in de antennaal kwab van het...

Calcium Imaging van Geur-reacties van de consument in de Drosophila Antennaal Lobe

Deze video beschrijft in vivo calcium beeldvorming in Drosophila neuronen met behulp van GCaMP. De aanbevolen protocolclip laat zien hoe u veranderingen in GCaMP-fluorescentie van paddestoellichaamneuronen kunt registreren tijdens een olfactorisch conditioneringsexperiment.

Drosophila In Vivo Calcium imaging: een methode voor functionele beeldvorming van neuronale activiteit

This video demonstrates a method for detecting sensory neuron responses in Drosophila using ligand binding and fluorescence imaging. Ligands bind to neuron receptors, causing calcium influx. The calcium binds to indicator complexes, leading to fluorescence emission, which confirms the neuronal response to the ligand.

Detecting Physiological Responses from Sensory Neurons in Drosophila

In this video, Drosophila larvae nerve fibers are immersed in FM dye, which binds to cell membrane lipids. Suction microelectrode and electrical pulses stimulate the endocytosis process, incorporating the FM dye into newly formed endocytic vesicles. This method, which visualizes presynaptic stages of neurotransmission, is useful for studying synaptic function and neurotransmitter release.

Microelectrode-Mediated FM Dye Loading and Unloading in Drosophila Larvae Nerve Cells

This video demonstrates a protocol to study synaptic vesicle recycling at neuromuscular junctions in channelrhodopsin-expressing Drosophila larvae using a fluorescent dye. Blue light activates the channelrhodopsins, causing calcium influx and synaptic vesicle exocytosis. The dye integrates into the neuronal membranes and is internalized during endocytosis, resulting in enhanced fluorescence. Further blue light stimulation induces exocytosis and dye release, which is shown by reduced...

Analyzing Synaptic Vesicle Recycling and Fluorescent Dye Uptake in Drosophila Larvae

This video demonstrates a method for in vivo calcium imaging using synaptically localized calcium sensors in flies. It outlines the steps for preparing the flies for microscopy, conducting olfactory conditioning, and visualizing odor-induced calcium influx.

In Vivo Calcium Imaging Using Synaptically Localized Calcium Sensors in Drosophila melanogaster

Source: Ishimoto, H. et. al., Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila. J. Vis. Exp. (2018) This video demonstrates calcium imaging to study Drosophila brain responses to neuropeptides. Neurons expressing a fluorescent calcium indicator reveal intracellular calcium dynamics and functional responses to signaling molecules.

Ex Vivo Calcium Imaging to Study Drosophila Brain Responses to Neuropeptides

De voorpoten en slurf van Drosophila bevatten een rijk repertoire van gustatoire sensorische neuronen. Hier presenteren we een methode met behulp van calciumbeeldvorming om fysiologische reacties van sensorische neuronen in de voorpoot en slurf van levende vliegen te meten na exogeen aanbrengen van een gustatoir feromoon.

Meten van fysiologische reacties<em&gt; Drosophila</em&gt; Sensorische neuronen te Lipid Feromonen met Live Calcium Imaging

Hier beschrijven we een methode voor het laden van een calciumgevoelige kleurstof door de kikker zenuwstomp in de zenuwuitgangen. We presenteren ook een protocol voor de opname en analyse van snelle calcium transiënten in de perifere zenuw eind.

Een calciumkleurstofverf in de zenuwlengte van de kikker laden door de zenuwstomp: Calcium Transient Registratie in de Kikker Neuromusculaire Junction

Dit protocol beoordeelt functionele synaptische activiteit tussen gedefinieerde neuronale partners in vivo in het centrale zenuwstelsel van Drosophila melanogaster-larven met behulp van genetisch gecodeerde instrumenten. CsChrimson-gemedieerde optogenetische stimulatie van presynaptische cIVda-sensorneuronen induceert calciumafhankelijke fotoconversie van CaMPARI in postsynaptische Basin-4 interneuronen.

Functionele karakterisering van individuele pre- en postsynaptische partners in het centrale zenuwstelsel van de Drosophila-larve met behulp van CaMPARI

Leer een techniek voor het laden van calcium-indicatoren in Drosophila-zenuwuiteinden. Deze methode maakt het mogelijk om calciumdynamica en neurotransmissie in vivo te bestuderen.

Het laden van Drosophila zenuwuiteinden met Calcium-indicatoren

Meer video's verkennen