Name: Imaging Cel Vorm wijzigen in Living Drosophila Embryos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Leer levende confocale beeldvorming van celvormveranderingen in Drosophila-embryo's. Deze methode maakt real-time observatie van cellularisatie en vroege embryonale ontwikkeling mogelijk voor onderzoekers.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij dankbaar erkennen Eric Wieschaus, die op voorwaarde dat de basis waarop dit protocol werd ontwikkeld. Ons werk wordt ondersteund door een Verna &amp; Marrs McLean Afdeling Biochemie en Moleculaire Biologie Start-up Award, Baylor College of Medicine.

1. Monteer embryoteams Cups <ol><li> Snijd de onderkant af van een 100 ml Tri-maïs beker met een scheermes, waardoor de rand zo soepel mogelijk verlopen. De cups zijn gemakkelijker te hanteren als je ook trimmen van de drie hoeken off van de top, al is dit niet absoluut noodzakelijk. </li><li> Knip een vierkant van gaas (6 cm x 6 cm). Op een voorverwarmde hete plaat, binnenkant van een zuurkast, laag het kwadraat van gaas op de top van een stuk van heavy-duty aluminium folie. Duw de cut onderste rand van de beker stevig op de hete mesh. Wacht een paar seconden, en til de beker met de mesh nu bevestigd. Als de folie ook sticks, maar schil het uit. </li><li> 'S nachts koel de beker. Verwijder overtollige gaas met een schaar, en zand uit alle scherpe randen met fijnkorrelig schuurpapier. </li></ol> 2. Maak Apple Juice agarplaten <ol><li> In een 6L kolf combineren 100 g Bacto Agar BD en 3L gedestilleerd water. Autoclaaf de agar gedurende 30 minuten op de langzame uitlaat instelling. </li><li> In een 2L kolf met een roerstaafje, combineer 100 g sucrose, 1L appelsap, en 6 g p-hydroxybenzoëzuur. Verwarm de oplossing aan de kook al roerend op een hete plaat. Niet koken voor meer dan 2 minuten. Laat het appelsap mengsel afkoelen, en vervolgens met roer bar tot de agar toe te voegen. Meng dit volledig. </li><li> Laat de gecombineerde oplossing in een 60 ° C waterbad afkoelen voordat gieten in 60x15 mm petrischaaltjes. Als alternatief kan een peristaltische pomp worden gebruikt om de agar afzien. Laat de platen tot kamertemperatuur afkoelen ten minste 4 uur. Stapel in Rubbermaid containers met een laag van natte papieren handdoeken en bewaren bij 4 ° C. </li></ol> Opmerkingen: <ul><li> In de herfst of de winter, kan het noodzakelijk zijn om een ​​extra 100 ml water toe te voegen aan de agar. </li><li> Het merk van de petrischalen is belangrijk! Alleen de BD Falcon gerechten passen bij de Tri-maïs bekers. Specifieke informatie over het bestellen vindt u in de Materials onderstaande tabel. </li></ul> 3. Voeg GFP vliegt naar de embryo Cups <ol><li> Uit te breiden GFP voorraden op basis van uw collectie moet door het opzetten van flessen vliegen ongeveer twee weken voorafgaand aan de beeldvorming. Een fles van vliegen is meestal meer dan voldoende om een ​​embryo kopje te vullen met een minimum van 50 vrouwen en 30 mannen. Voor de beste leggen, moet worden vliegt opnieuw eclosed (dat wil zeggen minder dan 5 dagen na het uitkomen). </li><li> Maak een gist pasta door het invullen van een klein kopje met ongeveer gelijke delen Red Star actieve droge gist en gedestilleerd water, en roer tot de gist is opgelost. De pasta moet ongeveer de consistentie van nat pindakaas. Meer gist of water kunnen worden toegevoegd aan de consistentie veranderen. Gist pasta kan gebruikt worden voor enkele dagen, en moet worden opgeslagen, overdekt, bij 4 ° C. </li><li> Zodra de gist pasta klaar is, verwijder dan appelsap platen van 4 ° C opgeslagen. Streak de appelsap platen met de gist plakken en laat ze warm tot 22-25 ° C, die zal aanmoedigen eieren leggen. </li><li> Vouw een rond papieren filter in de helft, dan in half opnieuw. Trim naar 8-9 cm diameter, en maak accordeon plooien in de kwart cirkel. Vouw de cirkel, keer het, en plaats deze in een verzameling kop totdat deze de mesh. Zorg ervoor dat het papier stevig in de beker, zodat het niet valt en plet de vliegen. Het filtreerpapier is optioneel, maar biedt wel een gastvrije omgeving om te paren, en onderhoudt vochtigheid in de beker. </li><li> Label een beker met voorraad naam en datum. Overdracht de vliegen uit de fles aan de collectie cup door voorzichtig te schudden de omgekeerde fles over de beker, en meteen de beker te dekken met een voorbereide appelsap plaat. Bevestig de plaat om de beker met een rubberen band. Stel kopjes mesh kant naar boven in een gebied met direct licht. Zorg dat er geen schaduwen vallen op de beker, als vliegen zal niet goed lag in het donker. </li><li> Wijzig de appelsap plaat als dat nodig is. Twee uur collecties, bij kamertemperatuur, goed werken voor beeldvorming cellularization. </li></ol> 4. Bereid een Montage kamer <ol><li> Ter voorbereiding op een montage kamer voor de embryo's, snijd een stukje van de dubbelzijdige tape 2-3 cm lang en leg hem op een dia, het afstemmen van de lange as van de tape en glijbaan. Snijd een seconde 2-3 cm lang stuk van de dubbelzijdige tape en laag dat op de top van het andere stuk van de tape, zorg ervoor dat de randen zijn uitgelijnd. </li><li> Met behulp van een scheermesje, maak je twee sneden van ongeveer 3 mm van elkaar in het midden van de tape en loodrecht op de lange as van de dia. Verwijder de tape tussen de bezuinigingen op een kanaal te maken. Pipetteer een daling van 27 Halocarbon olie in het kanaal. Dit kanaal is waar de embryo's zal worden gemonteerd. </li></ol> Opmerkingen: <ul><li> Alleen de ½ inch Scotch dubbelzijdige tape is de juiste dikte om de embryo's tegemoet te komen. </li><li> Halocarbon 27 Olie is zuurstof doorlaatbaar, en zo mogelijk zuurstof te wisselen, terwijl het voorkomen van embryo uitdroging. Door zijn brekingsindex, Halocarbon 27 Oil is ook ideaal voor het organiseren vanen imaging embryo's. </li></ul> 5. Dechorionate Embryo's <ol><li> Te verzamelen en te dechorionate embryo's, genoeg giet 50% bleekmiddel op het appelsap agarplaat volledig onder water het gehele oppervlak. Met behulp van een microscoop ontleden, zoals de Zeiss Discovery V8 met doorvallend licht, kijk uit voor de embryo's vrij te geven van hun chorion. Zodra de chorion los en geeft van een paar embryo's (30-60 seconden), giet bleekmiddel en embryo's in een cel zeef. </li><li> Was embryo's in de zeef onmiddellijk en krachtig met gedestilleerd water uit een spuit fles. Dep zeef op keukenpapier. Als een roze is te zien op de handdoek na het deppen, wassen blijven de embryo's met water. </li><li> Gebruik een vochtige penseel om 10 tot 50 embryo's over te dragen aan een schone appelsap plaat (zonder gist plakken). Wick weg water met de gescheurde rand van een papieren handdoek, en onmiddellijk de embryo's te dekken met een kleine hoeveelheid van Halocarbon 27 Oil. </li></ol> Opmerkingen: <ul><li> Gebruik geen Clorox bleekmiddel. Gebruik in plaats daarvan een merk zoals Austin's A-1 Commercial Bleach, dat is &lt;6% natriumhypochloriet. </li><li> Over-bleken of onvoldoende spoelen zal resulteren in papperig embryo's met onregelmatige cellularization. </li></ul> 6. Podium en Mount embryo's <ol><li> Met behulp van de ontleden microscoop met doorvallend licht, volg dan de richtlijnen van morfologische Bownes 20 tot embryo's op de plaat podium. Met behulp van een tang, transfer 5 mitotische cyclus van 11 of 12 embryo's, wat overeenkomt met Bownes fase 4, om het kanaal van de montage-kamer. Schik embryo's in een lijn, met dorsale en ventrale zijden zichtbaar en laterale zijde naar beneden. Embryo's worden gemakkelijk geregeld in deze oriëntatie in olie alleen. Geen menigte embryo's samen als ze ontnemen hun buren van zuurstof zodra het dekglas wordt hieronder toegepast. (Laat ongeveer de helft van een embryo lengte tussen hen). </li><li> Leg een rand van een 25x25 mm dekglas op de dubbelzijdige tape aan een kant van het kanaal. Laat de dekglas om het kanaal te dekken. Als er lucht is gevangen onder, breng een kleine hoeveelheid Halocarbon 27 Oil aan de rand van het dekglas. Capillaire werking trekt de olie in het kanaal en druk uit de lucht. </li></ol> Opmerkingen: <ul><li> Een andere uitstekende bron voor enscenering embryo's is het volgende: Campos-Ortega, JA en Hartenstein, V. (1985). De embryonale ontwikkeling van Drosophila melanogaster. Springer-Verlag, Berlijn. Hoewel dit boek is niet meer gepubliceerd, gebruikte exemplaren zijn regelmatig beschikbaar op Amazon.com. </li><li> Altijd spaarzaam gebruik maken van de Halocarbon 27 Oil. Dit maakt de montage makkelijker. Het zal ook voorkomen dat per ongeluk sijpelen van de olie op de microscoop doelstelling in de volgende imaging stappen. </li></ul> 7. Embryo's image <ol><li> Hoe je hier verder zal uiteraard bepaald worden door de cel van vorm te veranderen dat je beeldvorming, en de vraag die u aanpakken. Voor elke vorm te veranderen, plaatst u uw montage kamer op ofwel een rechte of omgekeerde microscoop, vind je embryo's door doorvallend licht, en vervolgens overschakelen naar confocale beeldvorming te concentreren op een gebied van belang. Zich te houden aan de beste praktijken voor confocale microscopie, zoals die besproken op Nikon's MicroscopyU ( <a href="http://www.microscopyu.com/articles/confocal">http://www.microscopyu.com/articles/confocal</a> ). Wees bijzonder streng in de blootstelling van uw levende embryo's om zo weinig laservermogen mogelijk, fotobleken en fototoxiciteit te voorkomen. </li><li> Voor cellularization, we beeld op een Zeiss 710 laser scanning confocale microscoop, met behulp van een C-Apochromat 40x/1.2 W Corr doelstelling. Deze microscoop is gehuisvest in een temperatuur-gecontroleerde ruimte, met temperaturen van 18-20 ° C. Terwijl de temperatuur is niet absoluut noodzakelijk is, is het beter voor de microscoop en maakt de beeldvorming meer consistent. We regelmatig afbeelding in een enkel vlak, in het midden van het embryo, de plasmamembraan invaginations in doorsnede (figuur 2) te volgen. Voor gewoon na invaginatie dynamiek, 30-60 seconden zijn voldoende voor time-lapse imaging, en embryo's moeten beeldvorming voor&gt; 90 minuten te weerstaan, zonder duidelijke tekenen van zuurstofgebrek. </li><li> Na de overname van de beelden, kunnen deze worden geanalyseerd met behulp van een aantal beeldanalyse-pakketten, waaronder freeware van de National Institutes of Health, de zogenaamde ImageJ ( <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij">http://rsbweb.nih.gov/ij</a> ). De gegevens kunnen dan worden gepresenteerd als films (Film 1), sequenties (figuur 2), of kymographs 21. </li></ol> Opmerking: <ul><li> De onderdompeling in water C-Apochromat 40x/1.2 W Corr objectief is zeer geschikt voor imaging de buurt van de embryo mid-section vanwege de hoge opening, die aberraties grenzen voor deep tissue imaging in waterige monsters, en geeft een hoge resolutie en hoge fluorescerend signaal. Daarnaast is deze doelstellingheeft een zeer lange afstand (220 pm). Echter, andere water of glycerine onderdompeling doelstellingen goed te presteren, met name als de cel van vorm veranderen van belang kan worden afgebeeld in de buurt van het embryo oppervlak. </li></ul> 8. Alternatieve methode: Mount Embryo's met 'embryo-lijm " <ol><li> Het imago van een cel van vorm te veranderen dan de andere cellularization, kan het nodig zijn om embryo's te monteren in een bepaalde oriëntatie die niet gemakkelijk in stand wordt gehouden in de olie alleen. Om dit te doen, gebruik maken van een alternatieve methode om de montage van een eerder beschreven. Begin met het maken van 'embryo-lijm "door het combineren van 20 cm van de dubbelzijdige tape met 250 ul van heptaan in een scintillatieflesje. Plaats de scintillatieflesje op een nutator of roterende platform, en meng gedurende de nacht. </li><li> Dip een gele pipettip in het embryo lijm, en vervolgens de tip trace langs een glijbaan, een spoor van lijm. Terwijl de heptaan is verdampt, uitlijnen geënsceneerd embryo's in de gewenste oriëntatie op een blok van agar. (Vergeet niet dat de embryo oppervlak af te beelden moet de agar worden geconfronteerd. Bijvoorbeeld, om de afbeelding te celvorm veranderen tijdens ventrale groef vorming, embryo's monteren met hun ventrale zijde van de agar.) </li><li> Omkeren van de dia met lijm, en zachtjes het spoor van lijm drukken tegen de embryo's op de agar te blokkeren. Nu weer keren de dia. De embryo's vast te zitten in de juiste oriëntatie. Voeg twee lagen van dubbelzijdige tape aan beide zijden van de embryo's, bedek ze met Halocarbon 27 Oil, en breng een dekglaasje aan. Ga verder met de beeldvorming zoals hierboven beschreven. </li></ol> 9. Representatieve resultaten: Als de embryo's gezond zijn en de beeldvorming is optimaal, dan cellularization moeten nemen 50-60 minuten, en de plasma membraan invaginations moet binnendringen bijna 40 micron. Echter, als de embryo's zijn over-gebleekt, zuurstof beroofd of beschadigd door fototoxiciteit, dan invaginatie zal ofwel vertragen of, stop met name in de verbeelde omgeving. Een dergelijke verslechtering van de gezondheid van embryo resulteert vaak in gewijzigde ontwikkeling, en een mislukking uit te komen als larven. Dus, voor een rigoureuze test test embryo gezondheid na imaging, houd je dia's in een bevochtigde kamer en kijk voor broedeieren van de volgende dag. <img src="/files/ftp_upload/2503/2503fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Workflow van het embryo naar beeldvorming. De workflow van het protocol kunnen worden onderverdeeld in vier grote fasen. In de eerste fase worden alle individuele voorraden en componenten voorbereid, en vervolgens de embryo's worden verzameld beker appelsap agar plaat en GFP vliegen zijn samengesteld om de embryo leggen omgeving te creëren. In de tweede fase worden de eicellen en embryo's die zijn gelegd op de appelsap agarplaten verzameld. In de derde fase, de embryo's worden verwijderd van de plaat, geënsceneerd en overgedragen aan de montage kamer. In de vierde fase worden de embryo's gemonteerd afgebeeld op een confocale microscoop. <img src="/files/ftp_upload/2503/2503fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Representatieve gegevens van time-lapse beeldvorming van cellularization. Embryo's zijn gemonteerd met dorsale (D) en ventrale (V) kanten duidelijk zichtbaar, en worden afgebeeld de buurt van hun midden naar de plasmamembraan invaginations volgen in doorsnede. Het embryo hier getoonde drukt een GFP-myosine-2 probe 6, die zich concentreert op de uiteinden van de plasmamembraan invaginations. Zo, het bijhouden van de invasie van dit front loop van de tijd geeft de snelheid waarmee de plasmamembraan invaginates. De 00:00 minuten tijd komt overeen met cellularization begin. Kort na de 56:00 minuten tijdstip, gastrulatie begint op de ventrale zijde van het embryo. Bar is 40 micron. Film 1. Vertegenwoordiger film van time-lapse beeldvorming van cellularization. Deze film komt overeen met figuur 2. Voor het opnemen van het hele proces van cellularization, imaging begon in de voorafgaande mitotische cyclus 13, het vastleggen van pseudocleavage groef regressie, en het duurde tot de gastrulatie bewegingen waren te zien op de ventrale zijde van het embryo. Beelden werden verzameld bij intervallen van een minuut. De intensiteiten werden verhoogd na de overname om het gemakkelijker maken om de gastrulatie bewegingen te zien. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2503/Movie%201.mov">Klik hier voor filmpje</a> <table border="1"><tbody><tr><td> Ontwikkelings-evenement en de timing * </td><td> Celvorm wijzigingen met betrekking tot </td><td> Een link naar de ziekte of gezondheid van de mens </td><td> Recente referenties met live imaging </td></tr><tr><td> Pseudo-splitsing vore formatie (4; 90 minuten pf) </td><td> Cytokinese </td><td> Polyploïdie en progressie van kanker een </td><td> Mavrakis et al.., 2009 8 Cao et al.., 2010 9 </td></tr><tr><td> Cellularization (5, 130 minuten pf) </td><td> Cytokinese </td><td> Polyploïdie en progressie van kanker een </td><td> Cao et al.., 2008 10 Sokac &amp; Wieschaus, 2008 11 </td></tr><tr><td> Ventrale groef formatie; Mesoderm invaginatie (6, 180 minuten pf) </td><td> Apicale constrictie, Epitheliale-mesenchymale transitie </td><td> Kanker metastase 2 </td><td> Fox &amp; Peifer, 2007 12 Martin et al.., 2009 13 </td></tr><tr><td> Germband uitbreiding (7, 195 minuten pf) </td><td> Convergent uitbreiding </td><td> Neurale buis defecten 3 </td><td> Bertet et al.., 2004 14 Blankenship et al.., 2006 15 </td></tr><tr><td> Tracheogenesis (11; 320 minuten pf) </td><td> Epitheliale buis vorming en vertakking </td><td> Angiogenese 4 </td><td> Caussinus et al.., 2008 16 Gervais &amp; Casanova, 2010 17 </td></tr><tr><td> Dorsale sluiting (14; 620 minuten pf) </td><td> Apicale constrictie </td><td> Wondgenezing 5 </td><td> Gorfinkiel et al.., 2009 18 Solon et al.., 2009 19 </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Voorbeelden van celvorm veranderingen afgebeeld in levende vlieg embryo's * Het Bownes podium nummer en de tijd na de bevruchting (PF), wanneer elk evenement begint, zijn gerangschikt volgens de Campos-Ortega, 1985. <table border="1"><tbody><tr><td> Fly voorraad </td><td> Labels </td><td> Oorspronkelijke referentie </td></tr><tr><td> Spider-GFP (95-1) </td><td> Plasmamembraan </td><td> Morin et al.., 2001 22 </td></tr><tr><td> Resille-GFP (117-2) </td><td> Plasmamembraan </td><td> Morin et al.., 2001 22 </td></tr><tr><td> GAP43-Venus </td><td> Plasmamembraan </td><td> Mavrakis et al.., 2009 8 </td></tr><tr><td> Spaghetti Squash-GFP (Sqh-GFP) </td><td> Myosine-2 </td><td> Royou et al.., 2002 6 </td></tr><tr><td> E-cadherine-GFP (ECAD-GFP) </td><td> Cel-cel verbindingen </td><td> Oda et al.., 2001 23 </td></tr><tr><td> GFP-Moesin </td><td> F-actine </td><td> Kiehart et al.., 2000 24 </td></tr><tr><td> Utrofine-Venus (utro-Venus) </td><td> F-actine </td><td> Sokac et al.., Niet-gepubliceerde resultaten </td></tr></tbody></table> Tabel 2. Nuttig voorraden voor de beeldvorming celvorm verandering in de vlieg embryo's

<ol><li>Sagona, A. P., Stenmark, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokinesis+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Cytokinesis and cancer.</a> FEBS Lett. 584, 2652-2661 (2010).</li>
<li>Baum, B., Settleman, J., Quinlan, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transitions+between+epithelial+and+mesenchymal+states+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Transitions between epithelial and mesenchymal states in development and disease.</a> Semin Cell Dev Biol. 19, 294-308 (2008).</li>
<li>Kibar, Z., Capra, V., Gros, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+understanding+the+genetic+basis+of+neural+tube+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Genet%22%5BJournal%5D)">Toward understanding the genetic basis of neural tube defects.</a> Clin Genet. 71, 295-310 (2007).</li>
<li>Jazwinska, A., Ribeiro, C., Affolter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+tube+morphogenesis+during+Drosophila+tracheal+development+requires+Piopio%2C+a+luminal+ZP+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Epithelial tube morphogenesis during Drosophila tracheal development requires Piopio, a luminal ZP protein.</a> Nat Cell Biol. 5, 895-901 (2003).</li>
<li>Martin, P., Parkhurst, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallels+between+tissue+repair+and+embryo+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Parallels between tissue repair and embryo morphogenesis.</a> Development. 131, 3021-3034 (2004).</li>
<li>Royou, A., Field, C., Sisson, J. C., Sullivan, W., Karess, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reassessing+the+role+and+dynamics+of+nonmuscle+myosin+II+during+furrow+formation+in+early+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Reassessing the role and dynamics of nonmuscle myosin II during furrow formation in early Drosophila embryos.</a> Mol Biol Cell. 15, 838-850 (2004).</li>
<li>Lecuit, T., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarized+insertion+of+new+membrane+from+a+cytoplasmic+reservoir+during+cleavage+of+the+Drosophila+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Polarized insertion of new membrane from a cytoplasmic reservoir during cleavage of the Drosophila embryo.</a> J Cell Biol. 150, 849-860 (2000).</li>
<li>Mavrakis, M., Rikhy, R., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+polarity+and+compartmentalization+are+established+before+cellularization+in+the+fly+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane polarity and compartmentalization are established before cellularization in the fly embryo.</a> Dev Cell. 16, 93-104 (2009).</li>
<li>Cao, J., Crest, J., Fasulo, B., Sullivan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+Actin+Dynamics+Facilitate+Early-Stage+Centrosome+Separation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Cortical Actin Dynamics Facilitate Early-Stage Centrosome Separation.</a> Curr Biol. , (2010).</li>
<li>Cao, J., Albertson, R., Riggs, B., Field, C. M., Sullivan, W. N. uf <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+Rab11+effector%2C+maintains+cytokinetic+furrow+integrity+by+promoting+local+actin+polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">a Rab11 effector, maintains cytokinetic furrow integrity by promoting local actin polymerization.</a> J Cell Biol. 182, 301-313 (2008).</li>
<li>Sokac, A. M., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+actin-dependent+endocytosis+is+zygotically+controlled+to+initiate+Drosophila+cellularization%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Local actin-dependent endocytosis is zygotically controlled to initiate Drosophila cellularization.</a> Dev Cell. 14, 775-786 (2008).</li>
<li>Fox, D. T., Peifer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abelson+kinase+%28Abl%29+and+RhoGEF2+regulate+actin+organization+during+cell+constriction+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Abelson kinase (Abl) and RhoGEF2 regulate actin organization during cell constriction in Drosophila.</a> Development. 134, 567-578 (2007).</li>
<li>Martin, A. C., Kaschube, M., Wieschaus, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsed+contractions+of+an+actin-myosin+network+drive+apical+constriction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pulsed contractions of an actin-myosin network drive apical constriction.</a> Nature. 457, 495-499 (2009).</li>
<li>Bertet, C., Sulak, L., Lecuit, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin-dependent+junction+remodelling+controls+planar+cell+intercalation+and+axis+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Myosin-dependent junction remodelling controls planar cell intercalation and axis elongation.</a> Nature. 429, 667-671 (2004).</li>
<li>Blankenship, J. T., Backovic, S. T., Sanny, J. S., Weitz, O., Zallen, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+rosette+formation+links+planar+cell+polarity+to+tissue+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Multicellular rosette formation links planar cell polarity to tissue morphogenesis.</a> Dev Cell. 11, 459-470 (2006).</li>
<li>Caussinus, E., Colombelli, J., Affolter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tip-cell+migration+controls+stalk-cell+intercalation+during+Drosophila+tracheal+tube+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Tip-cell migration controls stalk-cell intercalation during Drosophila tracheal tube elongation.</a> Curr Biol. 18, 1727-1734 (2008).</li>
<li>Gervais, L., Casanova, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+coupling+of+cell+elongation+and+lumen+formation+in+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo coupling of cell elongation and lumen formation in a single cell.</a> Curr Biol. 20, 359-366 (2010).</li>
<li>Gorfinkiel, N., Blanchard, G. B., Adams, R. J., Arias, M. artinez, A, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+control+of+global+cell+behaviour+during+dorsal+closure+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mechanical control of global cell behaviour during dorsal closure in Drosophila.</a> Development. 136, 1889-1898 (2009).</li>
<li>Solon, J., Kaya-Copur, A., Colombelli, J., Brunner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsed+forces+timed+by+a+ratchet-like+mechanism+drive+directed+tissue+movement+during+dorsal+closure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Pulsed forces timed by a ratchet-like mechanism drive directed tissue movement during dorsal closure.</a> Cell. 137, 1331-1342 (2009).</li>
<li>Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+photographic+study+of+development+in+the+living+embryo+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Embryol+Exp+Morphol%22%5BJournal%5D)">A photographic study of development in the living embryo of Drosophila melanogaster.</a> J Embryol Exp Morphol. 33, 789-801 (1975).</li>
<li>Sokac, A. M., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zygotically+controlled+F-actin+establishes+cortical+compartments+to+stabilize+furrows+during+Drosophila+cellularization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Zygotically controlled F-actin establishes cortical compartments to stabilize furrows during Drosophila cellularization.</a> J Cell Sci. 121, 1815-1824 (2008).</li>
<li>Morin, X., Daneman, R., Zavortink, M., Chia, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protein+trap+strategy+to+detect+GFP-tagged+proteins+expressed+from+their+endogenous+loci+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A protein trap strategy to detect GFP-tagged proteins expressed from their endogenous loci in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 15050-15055 (2001).</li>
<li>Oda, H., Tsukita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+of+cell-cell+adherens+junctions+reveals+that+Drosophila+mesoderm+invagination+begins+with+two+phases+of+apical+constriction+of+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging of cell-cell adherens junctions reveals that Drosophila mesoderm invagination begins with two phases of apical constriction of cells.</a> J Cell Sci. 114, 493-501 (2001).</li>
<li>Kiehart, D. P., Galbraith, C. G., Edwards, K. A., Rickoll, W. L., Montague, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+forces+contribute+to+cell+sheet+morphogenesis+for+dorsal+closure+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiple forces contribute to cell sheet morphogenesis for dorsal closure in Drosophila.</a> J Cell Biol. 149, 471-490 (2000).</li>
</ol>

Het protocol beschreven zal de live-, confocale beelden van een aantal celvorm veranderingen in de zich ontwikkelende embryo vliegen mogelijk te maken. GFP voorraden voor beeldvorming kan worden bereid door een individuele lab (tabel 2), maar veel van dergelijke bestanden zijn ook publiekelijk beschikbaar zijn vanaf centra zoals Bloomington Drosophila Stock Center aan de Indiana University ( <a href="http://flystocks.bio.indiana.edu">http://flystocks.bio.indiana.edu</a> ) en Flytrap Stock Center aan de Yale Uni...

<table><tbody><tr><td>Dia's</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-343</td><td></td></tr><tr><td>Dekglasjes 25x25</td><td>Fisher Scientific</td><td>1 2-524C</td><td></td></tr><tr><td>Klemflessen (H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-897-11</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Falcon-buisjes</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Bollen voor kleine pipetten, 1 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-448-21</td><td></td></tr><tr><td>Scintillatiebuisjes met doppen</td><td>VWR international</td><td>66021-533</td><td></td></tr><tr><td>Tri-Corn bekers, 100 mL</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>60970</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon Petrischaal 60x15mm </td><td>Fisher Scientific</td><td>08757 100B</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon celzeef</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>Gele pipetpunten</td><td>Rainin</td><td>L200</td><td></td></tr><tr><td>Roestvrijstalen gaas, 304, 12x24</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>CX-0150-F-01</td><td></td></tr><tr><td>Glas 5&amp;#190; Pasteurpipetten van [X] inch</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20B</td><td></td></tr><tr><td>P4 Filterpapier</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-803-6F</td><td></td></tr><tr><td>Elastieken</td><td>Office Max</td><td>A620645</td><td></td></tr><tr><td>dubbelzijdige Scotch-tape, &amp;frac12; inch</td><td>Office Max</td><td>A8137DM-2</td><td></td></tr><tr><td>Robert Simmons Expression schilderpenseelen E85 rond #2</td><td>Jerry&amp;rsquo;s Artarama</td><td>56460</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Pincet Hoogprecisie Inox</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72701-DZ</td><td></td></tr><tr><td>Scheermesjes</td><td>VWR International</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Halogeenkoolstofolie 27</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H 8773</td><td></td></tr><tr><td>Heptaan</td><td>Fisher Scientific</td><td>H360-1</td><td></td></tr><tr><td>BD Bacto Agar</td><td>VWR international</td><td>90000-760</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>p-Hydroxybenzeenzuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H5501</td><td></td></tr><tr><td>Red Star actieve droge gist</td><td>LeSaffre</td><td>15700</td><td></td></tr><tr><td>Papieren handdoeken, C-vouw</td><td>Kleenex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zware aluminiumfolie</td><td>Reynolds Wrap</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bleekmiddel</td><td>Austin&amp;rsquo;s A-1 Commercieel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100% appelsap</td><td>Ocean Spray of Tree Top</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

imaging cel vorm wijzigen in living drosophila embryo&#39;s

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Het ontwikkelen van Drosophila melanogaster embryo ondergaat een aantal mobiele vorm verandert die zeer vatbaar zijn voor confocale beeldvorming leven. Celvorm veranderingen in de vlieg zijn analoog aan die in hogere organismen, en ze rijden weefsel morfogenese. Ja, in veel gevallen hun studie heeft directe implicaties voor het begrijpen van menselijke ziekten (tabel 1) 1-5. Op de sub-cellulaire schaal, deze celvorm veranderingen zijn het resultaat van activiteiten, variërend van genexpressie tot signaaltransductie, cel-polariteit, cytoskeletale remodeling en membraan mensenhandel. Zo, de Drosophila embryo levert niet alleen de context naar cel verandert de vorm van evalueren als zij betrekking hebben op weefsel morfogenese, maar biedt ook een volledig fysiologische omgeving naar de sub-cellulaire activiteiten die vorm geven aan cellen te bestuderen. Het protocol hier beschreven is ontworpen om het imago van een specifieke cel van vorm te veranderen genaamd cellularization. Cellularization is een proces van dramatische plasmamembraan groei, en uiteindelijk zet de syncytieel embryo in de cellulaire blastoderm. Dat wil zeggen, op interfase van de mitotische cyclus 14, de plasmamembraan invaginates gelijktijdig rond elk van ~ 6000 cortically verankerd kernen voor het genereren van een blad van primaire epitheliale cellen. Tegen de vorige suggesties, is cellularization niet gedreven door myosine-2 contractiliteit 6, maar is in plaats daarvan gevoed grotendeels door exocytose van membraan van interne winkels 7. Zo cellularization is een uitstekend systeem voor het bestuderen van membraantransport tijdens celvorm veranderingen die plasmamembraan invaginatie of uitbreiding nodig is, zoals cytokinese of dwars-tubulus (T-tubulus) morfogenese in de spieren. Merk op dat dit protocol goed wordt toegepast op de beeldvorming van andere celvorm veranderingen in de vlieg embryo, en vereist slechts kleine aanpassingen zoals het wijzigen van het stadium van de embryo&#39;s worden verzameld, of met behulp van &quot;embryo lijm&quot; om de embryo te monteren in een bepaalde oriëntatie (zie tabel 1) 8-19. In alle gevallen is de workflow is in principe hetzelfde (figuur 1). Standaardmethoden voor het kloneren en Drosophila transgenese worden gebruikt om een stabiele vliegen voorraden die een eiwit van interesse uit te drukken, gefuseerd met Green Fluorescent Protein (GFP) of zijn varianten voor te bereiden, en deze vliegen zorgen voor een hernieuwbare bron van embryo&#39;s. Als alternatief zijn fluorescerende eiwitten / probes direct in fly embryo&#39;s via eenvoudige micro-injectie technieken 9-10. Dan, afhankelijk van het ontwikkelingsstadium evenement en celvorm verandering af te beelden, worden embryo&#39;s verzameld en geënsceneerd door morfologie op een dissectiemicroscoop, en tot slot geplaatst en gemonteerd voor time-lapse imaging op een confocale microscoop.

Vroege ontwikkeling van de fruitvlieg, Drosophila melanogaster, wordt gekenmerkt door een aantal celvorm veranderingen die zeer geschikt zijn voor de beeldvorming benaderingen. Dit artikel beschrijft elementaire instrumenten en methoden die nodig zijn voor live-confocale beeldvorming van Drosophila embryo&#39;s, en zal zich richten op een cel van vorm te veranderen genaamd cellularization.

Imaging Cel Vorm wijzigen in Living Drosophila Embryo&#39;s

Het ontwikkelende embryo van de Drosophila melanogaster ondergaat een reeks veranderingen in de celvorm die zeer geschikt zijn voor live confocale beeldvorming. Celvorm ...

Het algemene doel van deze procedure is om veranderingen in de celvorm in levende drosophila-embryo's te visualiseren. Dit wordt bereikt door eerst transgene vliegenstammen te genereren en uit te breiden die GFP-gelabelde eiwitprobes tot expressie brengen. De tweede stap van de procedure is het overzetten van deze vliegen naar embryo-opvangschalen.De derde stap van de procedure is het verzamelen van embryo's. De vierde stap is het coaten en monteren van het embryo. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die veranderingen in de celvorm, zoals cellulaire veranderingen, aantonen middels time-lapse confocale beeldvorming van de gemonteerde embryo's.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals beeldvorming van gefixeerd weefsel, is dat de dynamische aspecten van veranderingen in de celvorm kunnen worden vastgelegd in de context van levende embryo's. Hoewel de hier beschreven methode specifiek is afgestemd op oesofagusvorming, kan deze worden aangepast en toegepast op andere veranderingen in de celvorm die gepaard gaan met de vroege ontwikkeling van de vlieg, zoals de vorming van de ventrale groeve, extensie van de kimeband, tracheagene

imaging-cell-shape-change-in-living-drosophila-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Drosophila hemocytes verspreiden over het geheel van de zich ontwikkelende embryo. Dit protocol laat zien hoe te monteren en het imago van deze migraties met behulp van embryo's met fluorescent gelabelde hemocytes.

Live-beeldvorming van Drosophila melanogaster Embryonale Hemocyte Migraties

Hier presenteren wij een montage protocol voor...

Rechtop beeldvorming van Drosophila Embryo&#39;s

Hier beschrijven we een effectieve methode voor het bestuderen dynamica van apoptotische cel...

Wonen Imaging van apoptotische cel Clearance tijdens<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenese

Dit document toont het gebruik van een snelle scanning confocale microscoop om het celgedrag rechtstreeks via puparium. Bij het verlaten van het popstadium intact, kan deze methode waarneming en meting van dynamische celprocessen in een stadium van Drosophila ontwikkeling die moeilijk rechtstreeks te bestuderen.

Imaging Door de Pupal zaak van<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Dit protocol Gegevens een gestroomlijnde methode voor live cell imaging uitvoeren in het kader van een intact larvale hersenen. Live cell imaging benaderingen zijn van onschatbare waarde voor de studie van asymmetrische neurale stamcellen divisies evenals andere neurogene en ontwikkelingsprocessen, consequent blootleggen van mechanismen die eerder over het hoofd gezien.

Live-Imaging van<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvale neuroblasts

Dit protocol presenteert een efficiënte methode voor het beeldvormen van het levende Drosophila pupale oogneuro-epitheel. Deze methode compenseert voor weefselbeweging en ongelijke topologie, verbetert de visualisatie van celgrenzen door het gebruik van meerdere GFP-gelabelde junctie-eiwitten en maakt gebruik van een eenvoudig te monteren beeldvormingsopstelling.

Live-beeldvorming van de Drosophila Pupal Eye

Hier beschrijven we een procedure om live beelden te maken van Drosophila gastrulatie. Dit heeft ons in staat gesteld om de apicale constrictie die betrokken is bij vroege ontwikkeling beter te begrijpen en verder mechanismen te analyseren die cellulaire bewegingen regelen tijdens modificatie van weefselstructuur.

Imaging van de Cel Shape Wijziging en Cell Mutatie Drosophila Gastrulatie gebruik van DE-cadherine Reporter Transgene Flies

Dit protocol beschrijft een gedetailleerde methode voor de lange termijn ex vivo cultuur en live beeldvorming van een Drosophila imaginaire disc. Het toont fotoreceptor differentiatie en ommatidial rotatie binnen de 10 uur periode van live-imaging van het oog disc. Het protocol is eenvoudig en niet duur setup nodig.

Langdurige Live-Imaging van<em&gt; Drosophila</em&gt; Disc Eye

Dit protocol is ontworpen voor de beeldvorming en analyse van de dynamiek van celoriëntatie en weefselgroei in de Drosophila abdominale epithelia terwijl de fruitvlieg een metamorfose ondergaat. De hier beschreven methodologie kan worden toegepast op de studie van verschillende ontwikkelingsstadia, weefsels en subcellulaire structuren in Drosophila of andere modelorganismen.

Beeldvorming en analyse van weefseloriëntatie en groeidynamiek in de ontwikkeling van Drosophila Epithelia tijdens pupale stadia

Hier bieden we een gedetailleerd protocol om live beeldvorming uit te voeren van de asymmetrische deling van germinale stamcellen (GSC's) in de Drosophila ovarium-niche. We gebruiken een transgene lijn die ubiquitair een groen fluorescent eiwit (GFP) tot expressie brengt, een fusie van het spectrosoom-eiwit Par-1.

Uitgebreide live beeldvorming van vrouwelijke Drosophila melanogaster kiembaanstammecellen niches

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor langdurige live beeldvorming van de Drosophila-poot tijdens het popstadium, waarbij het puparium volledig wordt verwijderd. Dit protocol kan ook op andere weefsels worden toegepast.

Langdurige live beeldvorming van de ontwikkeling van de poppoot van Drosophila na verwijdering van Puparium

Leer levende confocale beeldvorming van celvormveranderingen in Drosophila-embryo's. Deze methode maakt real-time observatie van cellularisatie en vroege embryonale ontwikkeling mogelijk voor onderzoekers.

Imaging Cel Vorm wijzigen in Living Drosophila Embryo's

Meer video's verkennen