Het testen van Beweegwijzer, leren en geheugen Tekortkomingen in Drosophila Modellen van Neurodegeneratie

Het algemene doel van de procedure is om het leren en het geheugen bij volwassen Drosophila melanogaster te bestuderen, waarbij eerst wordt bepaald of de vliegen lijden aan locomotorische tekorten. Ze worden getest in de negatieve geotaxis-assay. Positief fototactisch gedrag wordt vervolgens geverifieerd door vliegen in een T-doolhof te plaatsen en de latentietijd tot ze naar de favoriete verlichte kamer bewegen te registreren.

Vliegen met positieve fototaxis worden vervolgens geconditioneerd om de verlichte kamer te associëren met de bittere smaak van kinine. Uiteindelijk wordt getest in hoeverre de vliegen de aversieve stimulus associëren met de verlichte kamer, wat een maatstaf vormt voor leren en geheugen. Ola, welkom in het X lab.

Vandaag demonstreert u twee veelgebruikte gedragstesten om neurodegeneratie bij drosophila te bestuderen. Eerst tonen wij u de assay voor de onderdrukking van aversieve fototaxis, gedemonstreerd door Wil Fredo sala, een bachelorstudent in ons lab, en ikzelf, gevolgd door de assay voor negatieve geotaxis, gedemonstreerd door kaiwan, een promovendus in ons lab. Houd de vliegen op het standaard cornmeal agar molasses yeast medium bij 25 °C met een licht-donkercyclus van 12 uur.

Sorteer op de dag van de occlusie maagdelijke vliegen in groepen van 20. Maagdelijke vliegen worden geïdentificeerd aan hun lichte kleur en een donkergroene vlek aan de onderzijde van hun abdomen. De vliegen moeten elke drie dagen naar een nieuw vial worden overgezet, waarbij vliegen uit hetzelfde nest moeten worden gebruikt om verschillen als gevolg van de genetische achtergrond te minimaliseren.

Voor een geotaxis-studie moeten 10 tot 20 groepen per genotype of behandeling worden getest. Begin met het sorteren van vrouwelijke en mannelijke vliegen in groepen van 10. Deze vliegen moeten afzonderlijk worden getest.

Aangezien gedrag significant wordt beïnvloed door geslacht, dient men na de anesthesie ten minste een uur te wachten voordat men verdergaat, om er zeker van te zijn dat de locomotorische activiteit niet is aangetast. Wanneer de vliegen optimaal zijn voorbereid, worden de openingen van twee lege polystyreen vials op elkaar uitgelijnd door ze verticaal op de onderste vial te plaatsen.

Meet acht centimeter vanaf de bodem en teken een cirkel rond de omtrek. Nu de opstelling is gemonteerd, brengt u een groep van 10 vliegen over naar het onderste buisje. Sluit de buisjes onmiddellijk weer aan en laat de vliegen één minuut acclimatiseren vóór de test.

Nadat de vliegen zijn geland, tik ze voorzichtig naar de bodem van het flacon en tel het aantal vliegen dat binnen 10 seconden boven de markering van acht centimeter klimt. Het aantal vliegen per groep dat deze markering is gepasseerd, wordt genoteerd als een percentage van het totale aantal vliegen. Herhaal deze procedure 10 keer per groep, waarbij de vliegen tussen de pogingen één minuut rust krijgen.

Sorteer zes uur voor een PS-assay vrouwelijke vliegen in polystyreen vials met waterbevochtigd filterpapier. Deze stap zorgt ervoor dat de vliegen vasten en gevoeliger zijn voor de aversieve smaak. In deze assay dient een kinineoplossing als aversieve stimulus.

Bereid een werkoplossing van 1 µM voor vanuit een 0,1 M voorraadoplossing. Het T-doolhof bestaat uit een centrale kolom met een luik en twee zijkamers, een donkere kamer en een verlichte kamer. Gebruik bij de markering van 2 mm een handzaag om het gesloten uiteinde van twee plastic centrifugebuizen van 15 mL af te snijden, plaats aan beide uiteinden connectoradapters en verzegel de verbinding met parafilm.

Wikkel één buis in aluminiumfolie om als donkere kamer te dienen. Stel de TMA's samen door de verlichte en donkere kamers aan weerszijden van de centrale kolom vast te schroeven. Sluit de opstelling af door, terwijl de klep in het midden gesloten is, een lichtbron aan te sluiten op de adapter van de lichtkamer. Voordat u de assay uitvoert, brengt u elke vlieg uit een groep van 10 over naar een lege centrifugebuis van 15 milliliter en sluit u deze lichtjes af om ontsnapping te voorkomen.

Schroef vervolgens de donkere kamer los van de TMA's. Verplaats één enkele vlieg naar de buis en plaats deze onmiddellijk terug in het doolhof. Doe het licht in de kamer uit en zet een rode lamp aan.

Laat de vlieg 30 seconden acclimatiseren in de donkere kamer en zet vervolgens langzaam de lichtbron aan die de verlichte kamer beschijnt. Open, zodra deze verlicht is, het luik dat de twee kamers scheidt. Als de vlieg binnen 10 seconden naar de verlichte kamer loopt, wordt deze als positief fototactisch beschouwd en is deze klaar om getraind te worden.

Het uitblijven van een dergelijke respons duidt op een probleem in het visuele systeem en vereist uitsluiting van de assay. Zodra de positieve fototaxis is bevestigd, tik dan de vlieg terug naar de donkere kamer, sluit het luik en schakel het licht uit tijdens een rustperiode van 32 s. Bereid de aversieve stimulus voor door het filterpapier in de verlichte kamer te plaatsen en één milliliter kinine-oplossing op het filterpapier te pipetteren.

Zorg ervoor dat al het filterpapier volledig vochtig is met de aversieve stimuli. Om met de conditionering te beginnen, open je langzaam het luikje en schakel je het licht in. Laat de vlieg naar de verlichte kamer met kininegeur lopen.

Tik na één minuut de vlieg terug naar de donkere kamer. Herhaal deze procedure negen keer voor een totaal van 10 conditioneringsproeven. Gewoonlijk vermijden vliegen van dit type de verlichte kamer na drie tot vijf trainingsproeven direct na de training.

Voer vijf testproeven uit. Als de getrainde vlieg binnen 10 seconden niet naar het licht van de kamer loopt, wordt dit genoteerd als geslaagd. Het slagingspercentage over vijf opeenvolgende proeven wordt geregistreerd en vastgesteld.

PC nul. Na de training en de initiële PC nul-registraties wordt elke vlieg teruggeplaatst in het oorspronkelijke genummerde voedingsbuisje en zes uur apart gehouden. Voer zes uur na de training vijf aanvullende testruns uit zoals eerder gedemonstreerd; dit slagingspercentage vertegenwoordigt PC zes en is een maat voor het kortetermijngeheugen.

In de negative geotaxis-assay wordt het aantal vliegen dat de markering van acht centimeter passeert, omgezet in een percentage en gepresenteerd als de klimslagingskans. Gedurende 10 tests, zoals hier rechts te zien is, vertonen 10 dagen oude mannelijke of vrouwelijke vliegen die menselijk tau overexpresseren significante locomotorische tekorten in vergelijking met leeftijd-gematched GFP-overexpresserende vliegen aan de linkerkant.

Prestaties in de assay voor de onderdrukking van aversieve fototaxis worden weergegeven door het gemiddelde slagingspercentage of het percentage succesvolle vermijdingsproeven. Over het totaal aantal proeven bezien, blijken de vliegen die tau overexpresseren, hier rechts afgebeeld, minder in staat om het licht te associëren met een bittere smaak in vergelijking met de controlegroep links, zowel direct na de training als bij testen zes uur later. Na deze procedure kunnen monsters worden genomen voor immunohistochemische analyse om aanvullende vragen over morfologische verschillen te beantwoorden. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe leerprocessen en het geheugen bij vliegen bestudeerd kunnen worden.

En onthoud, het draait allemaal om jou.