Name: Mutagenese en functionele selectie Protocollen voor Gerichte ontwikkeling van eiwitten in E. coli /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-16T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Leer gerichte evolutie van eiwitten in Escherichia coli via mutagenese en functionele selectie. Dit protocol genereert willekeurige mutantenbibliotheken en identificeert nuttige mutaties voor industriële en biomedische toepassingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door K08 award CA116429-04 aan MC en door een subsidie ​​van de Conquer Cancer Now (concern) Stichting # 8501

<ol><li>Camps, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+ColE1-like+plasmid+replication+for+recombinant+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Recent+Pat+DNA+Gene+Seq%22%5BJournal%5D)">Modulation of ColE1-like plasmid replication for recombinant gene expression.</a> Recent Pat DNA Gene Seq. 4, 58-73 (2010).</li>
<li>Itoh, T., Tomizawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+replication+of+plasmid+ColE1+DNA+by+RNA+polymerase%2C+ribonuclease+H%2C+and+DNA+polymerase+I%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Symp+Quant+Biol%22%5BJournal%5D)">Initiation of replication of plasmid ColE1 DNA by RNA polymerase, ribonuclease H, and DNA polymerase I.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 43 Pt 1, 409-417 (1979).</li>
<li>Polisky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ColE1+replication+control+circuitry%3A+sense+from+antisense%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">ColE1 replication control circuitry: sense from antisense.</a> Cell. 55, 929-932 (1988).</li>
<li>Camps, M., Naukkarinen, J., Johnson, B. P., Loeb, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+evolution+in+Escherichia+coli+using+a+highly+error-prone+DNA+polymerase+I%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Targeted gene evolution in Escherichia coli using a highly error-prone DNA polymerase I.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 9727-9732 (2003).</li>
<li>Shinkai, A., Loeb, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+mutagenesis+by+Escherichia+coli+DNA+polymerase+I.+Ile%28709%29+in+motif+A+functions+in+base+selection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">In vivo mutagenesis by Escherichia coli DNA polymerase I. Ile(709) in motif A functions in base selection.</a> J Biol Chem. 276, 46759-46764 (2001).</li>
<li>Uyemura, D., Lehman, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+characterization+of+mutant+forms+of+DNA+polymerase+I+from+Escherichia+coli.+I.+The+polA12+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Biochemical characterization of mutant forms of DNA polymerase I from Escherichia coli. I. The polA12 mutation.</a> J Biol Chem. 251, 4078-4084 (1976).</li>
<li>Sedgwick, B., Robins, P., Lindahl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+removal+of+alkylation+damage+from+DNA+by+AlkB+and+related+DNA+dioxygenases%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Direct removal of alkylation damage from DNA by AlkB and related DNA dioxygenases.</a> Methods Enzymol. 408, 108-120 (2006).</li>
<li>Aharoni, A., Gaidukov, L., Khersonsky, O., Mc, Q. G. S., Roodveldt, C., Tawfik, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%27evolvability%27+of+promiscuous+protein+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">The 'evolvability' of promiscuous protein functions.</a> Nat Genet. 37, 73-76 (2005).</li>
<li>Elena, S. F., Lenski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+experiments+with+microorganisms%3A+the+dynamics+and+genetic+bases+of+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Evolution experiments with microorganisms: the dynamics and genetic bases of adaptation.</a> Nat Rev Genet. 4, 457-469 (2003).</li>
<li>Itoh, T., Tomizawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoFormation+of+an+RNA+primer+for+initiation+of+replication+of+ColE1+DNA+by+ribonuclease+H%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">FoFormation of an RNA primer for initiation of replication of ColE1 DNA by ribonuclease H.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 77, 2450-2454 (1980).</li>
<li>Bryan, S. K., Moses, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sufficiency+of+the+Klenow+fragment+for+survival+of+polC%28Ts%29+pcbA1+Escherichia+coli+at+43+degrees%5BTitle%5D)+AND+%22C.+J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Sufficiency of the Klenow fragment for survival of polC(Ts) pcbA1 Escherichia coli at 43 degrees.</a> C. J Bacteriol. 170, 456-458 (1988).</li>
</ol>

Dit artikel presenteert een mutagenese protocol dat de generatie van grote willekeurige mutant bibliotheken mogelijk maakt zonder de noodzaak voor het klonen of PCR. Deze methode is gebaseerd op foutgevoelig replicatie van een plasmide dat codeert voor een sequentie van interesse. In theorie, mutaties moeten grotendeels worden beperkt tot de 100-300 bp onmiddellijk stroomafwaarts van het RNA / DNA-schakelaar, de grootte van de leider streng intermediaire geproduceerd door Pol I 2,10. We vonden dat onder de voorwaarden die in dit protocol, Pol ik mutaties optreden overal in het plasmide, hoewel kleiner in frequentie als de afstand van het plasmide ori toeneemt (figuur 3). Deze bevinding impliceert dat de overgang of &quot;switch&quot; van Pol I tot en Pol III tijdens ColE1 plasmide replicatie is veel geleidelijker dan eerder gemeld, in ieder geval onder onze experimentele omstandigheden 2, en stemt in met eerdere studies suggereren een functionele redundantie tussen Pol I en Pol III 11. Onze originele protocol beschreven mutagenese in vloeibare culturen (4). Dit protocol geeft 0,41 mutaties / kb voor d &lt;1000, dus binnen de 1000 bp grenzend aan het RNA / DNA-schakelaar (tabel 1). Hypersaturation door het verlaten van de vloeistof cultuur in de shaker voor de drie dagen zonder de toevoeging van elke nieuwe media verhoogt de mutatie frequentie tot 0,70 mutaties / kb, maar resulteert in een zeer slechte plasmide rendement (minder dan 1% ten opzichte van dag 1; gegevens niet getoond) ( tabel 1). Hier presenteren wij een vereenvoudigde protocol gebaseerd op direct beplating de transformatie van het doel plasmide op vaste agar bij 37 ° C (Figuur 1). Deze procedure levert de grootste frequentie van de mutatie / cyclus van mutagenese (0,92 mutaties / kb voor d &lt;1000) en aanzienlijk vergemakkelijkt iteratie. Veranderende cultuur voorwaarden aan vaste media ook invloed op de mutatie spectrum (tabel 2). Direct plating mutagenese vermindert de gemarkeerde asymmetrie tussen complementaire basenparen substituties gezien in vloeibare cultuur (vergelijk C → T vs G → A en A → G vs T → C). Aan de andere kant, direct plating produceerde meer indels (van minder dan 0,5% tot 4%) en verminderde het aantal A → G mutaties door 3-voudig, wat leidt tot een oververtegenwoordiging van G / C mutaties (74%). Over het algemeen zijn wij van mening dat de grotere eenvoud en een verhoogde efficiëntie van de directe beplating protocol hier gepresenteerde de voordelen van de iets meer evenwichtige mutatie spectrum geproduceerd door vloeibare mutagenese opweegt tegen. Binnen de doelgroep plasmide, worden de mutaties gegenereerd door onze methode beperkt zich niet tot de gewenste doelsequentie. Toch moet de evolutie van nieuwe biochemische activiteiten afhankelijk zijn van mutaties in de target-gen, omdat dit een kwalitatieve dan een kwantitatieve verandering. Zo, het combineren van onze plasmide mutagenese met screening van mutanten op verloop platen speelt in op de sterke punten van ons systeem (grote bibliotheken en beschikbaarheid van selectie) voor de evolutie van nieuwe biochemische eigenschappen. Andere toepassingen van random mutagenese, zoals het optimaliseren van bestaande enzymatische activiteiten of randomiseren specifieke gebieden van een gen vereisen klonen volgt willekeurige mutagenese. In dit geval kan de bibliotheek in een plasmide, in tegenstelling tot een PCR-amplificatie product verbetert de efficiëntie van het klonen door het faciliteren van versterking en beperking. Kortom, we zien een eenvoudig protocol om een ​​willekeurige mutant bibliotheek te creëren voor een bepaalde target-gen, dat opvalt door zijn eenvoud en voor de diversiteit van de gegenereerde bibliotheken. Laten we zien hoe deze methode kan worden gekoppeld met functionele selecties voor de efficiënte ontwikkeling van nieuwe biochemische activiteiten. Daarnaast kunnen onze in vivo gegenereerde bibliotheken gemakkelijk gekloond, waardoor plaats-specifieke mutagenese of optimalisatie van bestaande activiteiten.

<table><tbody><tr><td>carbenicilline</td><td>Cellgro</td><td>46100R6</td><td>0.1mg/ml eindconcentratie</td></tr><tr><td>tetracycline</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP7640</td><td>0.05mg/ml eindconcentratie</td></tr><tr><td>chloramphenicol</td><td>Genlantis</td><td>M120100</td><td>0.03mg/ml eindconcentratie</td></tr><tr><td>LB Agar Miller</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1425</td><td></td></tr><tr><td>LB Bouillon Miller</td><td>Difco Laboratories</td><td>244620</td><td></td></tr><tr><td>Zachte Agar</td><td>Difco Laboratories</td><td>214580</td><td>In-house gemaakt</td></tr><tr><td>Acridine Oranje</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A38401-1</td><td></td></tr><tr><td>Antifoam B emulsie</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5757</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Acros Organics</td><td>332030025</td><td></td></tr><tr><td>100x100x15mm vierkante schaal</td><td>Fisher Scientific</td><td>0875711A</td><td></td></tr><tr><td>100mm ronde schaal </td><td>Fisher Scientific</td><td>0875712A</td><td></td></tr><tr><td>Microscoopglasplaatje 25x75x1mm</td><td>Gold Seal</td><td>3048</td><td></td></tr><tr><td>Elektroporator 2510</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elektroporator 2510</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2mm gap tubes</td><td>Molecular BioProducts</td><td>5520</td><td></td></tr><tr><td>Zippy mini prep kit</td><td>Zymo Research Corp.</td><td>D4020</td><td></td></tr></tbody></table>

mutagenese en functionele selectie protocollen voor gerichte ontwikkeling van eiwitten in e. coli</em

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

De efficiënte generatie van de genetische diversiteit is een waardevol moleculair instrument dat kan worden gebruikt om de DNA-synthese label, unieke moleculaire handtekeningen te creëren, of om eiwitten ontwikkelen in het laboratorium. Hier presenteren we een protocol dat de generatie van grote (&gt; 10 11) mutant bibliotheken voor een gegeven doelsequentie mogelijk maakt. Deze methode is gebaseerd op de replicatie van een ColE1 plasmide dat codeert voor de gewenste volgorde door een low-fidelity variant van DNA-polymerase I (LF-Pol I). De beoogde plasmide wordt getransformeerd in een mutator stam van E. coli en uitgeplaat op vaste media, waardoor tussen de 0,2 en 1 mutaties / kb, afhankelijk van de locatie van het target-gen. Hogere mutatie frequenties worden bereikt door het itereren dit proces van mutagenese. In vergelijking met alternatieve methoden van mutagenese, ons protocol valt op door zijn eenvoud, omdat er geen klonen of PCR betrokken zijn. Dus, onze methode is ideaal voor het mutatie-etikettering van plasmiden of andere Pol ik sjablonen of voor grote delen van sequentie ruimte te verkennen voor de evolutie van de activiteiten niet in de oorspronkelijke doelstelling. De strakke ruimtelijke controle dat de PCR of gerandomiseerde oligonucleotide-gebaseerde methoden bieden ook kan worden bereikt door de volgende klonen van specifieke delen van de bibliotheek. Hier geven we protocollen laat zien hoe een willekeurige mutant bibliotheek te creëren en hoe je drugs op basis van selecties in E. vestigen coli mutanten vertonen nieuwe biochemische activiteiten te identificeren.

Hier laten we zien een eenvoudig protocol om een ​​willekeurige mutant bibliotheek te creëren voor een bepaalde doelsequentie. We laten zien hoe deze methode, die in vivo uitgevoerd in Escherichia coli, kan worden gecombineerd met functionele selecties van nieuwe enzymatische activiteiten evolueren.

Mutagenese en functionele selectie Protocollen voor Gerichte ontwikkeling van eiwitten in E. coli</em

De efficiënte generatie van genetische diversiteit is een onschatbare moleculaire tool die kan worden gebruikt om DNA-synthese te labelen, om unieke moleculaire ...

Het algemene doel van deze procedure is om een willekeurige mutantenbibliotheek te creëren voor een bepaalde doel-DNA-sequentie, en om mutanten snel te identificeren en te karakteriseren met behulp van semi-kwantitatieve functionele selectie. Dit wordt bereikt door eerst een plasmide met een coli, één replicatie-oorsprong die de doelsequentie bevat, te transformeren in de mutator-stam. Na het uitplaten en overnacht incuberen van de cellen worden deze geoogst en wordt het doelplasmide geïsoleerd om de mutantenbibliotheek te verkrijgen; deze mutantenbibliotheek wordt vervolgens getransformeerd in een readout-stam om de mutaties te karakteriseren in het tweede deel van het protocol. Er wordt een gradiënt-groeiplaat opgesteld en bacteriële culturen van de readout-stam worden geladen in een aparte Petrischaal met zachte agar.De laatste stap van de procedure is om deze bacteriële culturen via stempeloverdracht op de gradiënt aan te brengen. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die veranderingen in het fenotypische profiel van een specifieke doelsequentie laten zien door verschillen in groei op een geneesmiddelgradiënt. Deze video presenteert een methode voor de gerichte evolutie van eiwitten in e coli.Dit proces bootst de natuurlijke evolutie na bij de generatie van willekeurige nutriëntenbibliotheken, gevolgd door een selectie die die diversiteit beperkt. Hierdoor wordt ons vermogen verbeterd om nieuwe biochemische activiteiten te genereren voor industriële of biomedische doeleinden. Deze procedure bestaat uit twee componenten: de generatie van een willekeurige mutantenbibliotheek en de functionele selectie om mutations met een gain-of-function te verkrijgen; deze procedure zal worden gedemonstreerd door Jennifer Allen, een technicus uit mijn laboratorium.Voorafgaand aan de start van dit protocol werden elektrocompetente JS 200-cellen gebruikt die een low-fidelity variant van DNA-polymerase I (low-fidelity pol I) tot expressie brengen, welke vooraf waren geprepareerd zoals beschreven in het geschreven protocol. Deze cellen bevatten een temperatuurgevoelig allel van pol I, zodanig dat de activiteit van low-fidelity pol I domineert bij 37 °C. Constructeer een targetplasmide met een coli-1 replicatieoorsprong, waarbij de targetsequentie naast de replicatieoorsprong is gekloond; low-fidelity pol I initieert de replicatie van het coli-1 plasmide, waardoor mutaties worden geïntroduceerd om mutagenese te initiëren.Combineer 40 µL electrocompetente cellen en tussen 30 en 250 ng target-plasmadna in een gap van twee millimeter. Elektroporeer het mengsel in de electroporator bij 1800 V. Controleer de tijdconstante of TC om uniforme electroporatiecondities voor elk monster te garanderen.Ideaal gezien is TC gelijk aan vijf tot zes milliseconden. Laat het mengsel van cel-DNA herstellen in één milliliter LB-bouillon gedurende 40 minuten bij 37 °C onder schudden bij 250 RPM. Neem een 100 millimeter LV agro Petri-schaal, voorverwarmd tot 37 graden Celsius en bevattend de juiste antibiotica voor de selectie van beide plasmiden; plaat de herstelde cellen bij een geschikte verdunning om een concentratie te verkrijgen die dicht bij een gazon ligt, wat gedefinieerd wordt als een duidelijk maar niet telbaar aantal kolonies, zoals weergegeven in dit voorbeeld.Oogst na een incubatie van één nacht de bacteriële kolonies uit de Petri-schalen met LB-bouillon. Isoleer het plasmide-DNA uit de geoogste cellen; het resulterende plasmide-DNA vormt de willekeurige mutantbibliotheek.Voer een restrictiedigestie uit door de plasmidenbibliotheek te knippen met een restrictie-enzym dat zowel het doelplasmid als de pole-plasmid lineariseert. Voer een analytische agarosegel-elektroforese uit op het geïsoleerde plasmiden-DNA om de kwaliteit en kwantiteit te bevestigen. Zodra de plasmiden zijn geverifieerd, digesteer dan één microgram van de bibliotheek met een restrictie-enzym dat de pole-plasmid lineariseert, maar het doelplasmid niet knipt.Nadat de restrictiedigest is voltooid, dient de library te worden gezuiverd met een DNA-zuiveringskit. Transformeer vervolgens de gezuiverde library in een readout-stam om de mutaties te karakteriseren. Om te beginnen met de bereiding van de gradiënt, markeer dan 10 banen die gelijkmatig over één rand van de bodem van de vierkante petrischaal zijn verdeeld.Plaats de schaal op een helling zodanig dat de onderste gemarkeerde rand zeven millimeter is verhoogd. Giet 25 milliliters warme lb agar, goed gemengd met een passende concentratie van het selectiemiddel, in de hellende schaal. Dit vormt de onderste laag van de gradiënt.Zorg ervoor dat de LB-agar de petrischaal zodanig bedekt dat het verhoogde, gemerkte uiteinde van de schaal ongeveer één millimeter LB-agar bevat en het verlaagde gedeelte ongeveer acht millimeter. Dek de plaat af met het deksel KU voor ventilatie en laat de agar 10 tot 15 minuten uitharden. Nadat de onderste laag LB-agar is gestold, wordt de schaal naar een vlak oppervlak verplaatst.Giet vervolgens 25 milliliters warme lb agar zonder het selectiemiddel over het eerste agar-oppervlak, waarbij u ervoor zorgt dat de gehele onderste laag wordt bedekt. Sluit de plaat af met het deksel voor ventilatie en laat de agar 10 tot 15 minuten uitharden om de stempeloverdracht van bacteriën uit te voeren. Verkrijg eerst bacteriële culturen van de readout-stam en verdun deze zodat ze identieke celdichtheden hebben met een optische dichtheid bij 600 nanometers van minder dan 1,0.Breng vervolgens twee milliliters vloeibare zachte agar, geëquilibreerd op 42 °C, aan op de bodem van een ronde Petri-schaal van 100 millimeter; pipetteer 40 µL van de bacteriële cultuur in de zachte agar en meng dit door de schaal te wiegen. Bedek de lange rand van het glazen microscoopglas met het zachte mengsel. Lijn vervolgens de bedekte rand van het glas uit met de onderste markering op de gradientschaal.Raak met het objectglas het oppervlak van de agar aan. Een lichte aanraking is voldoende om een strook van de zachte agar over te brengen naar het gradientoppervlak. Het objectglas wordt vervolgens terzijde gelegd om te worden gereinigd en hergebruikt.Herhaal dit proces. De overige monsters en experimentele controles moeten op elke gradientschaal worden aangebracht. Als er meerdere gradiënten worden uitgevoerd, wordt de gradientschaal 's nachts ondersteboven geïncubeerd bij 37 °C. De incubatietijden en -temperaturen kunnen variëren voor verschillende readout-bacteriestammen, maar incubatie gedurende de nacht bij 37 °C is doorgaans voldoende voor zichtbare groei.Beeld tenslotte de celgroei en analyseer deze zoals beschreven in het schriftelijke protocol. Hier zijn afbeeldingen van een readout-stam getransformeerd met respectievelijk ongemuteerde P-G-F-U-V of een PGFPUV-mutantenbibliotheek die vier ronden van mutagenese hebben ondergaan. Donkere of zwakke kolonies duiden op plasmiden die GFP-inactiverende mutaties bevatten.Deze figuur geeft de frequentie van mutaties weer gedurende de neutrale sequentie van het doelplasmid in intervallen van 100 baseparen. Merk op dat de mutaties over de gehele plasmidsequentie voorkomen, maar met de hoogste frequentie nabij de replicatieoorsprong. Hier wordt de groei van mutanten getoond tegen een gradiënt van een geneesmiddel.De afstand die naar de bovenkant van de gradiënt is gegroeid, geeft het differentiële profiel van drugresistentie tussen de mutanten aan. In dit voorbeeld werden plasmidenbibliotheken van het menselijke oxidatieve demethylase ABH2 gescreend op mutanten met een verhoogde resistentie tegen methylmethaansulfonaat met behulp van drugselectiegradiënten. Bibliotheken die twee en vier iteraties van het mutageneseprotocol vertegenwoordigen, worden getoond in vergelijking met het ouderlijke wildtype en de lege vector.De witte lijn geeft de drempelwaarde aan waarboven individuele mutantkolonies werden geïsoleerd. Voor verdere fenotypische analyse worden bèta-lactamasemutanten, R 1 64 H en E 1 0 4 KR 1 64 HG 2 67 R, die eerder zijn geïdentificeerd met behulp van low-fidelity P one mutagenese en astri en m selectie, getoond op een 0,4 µg/mL en een 4 µg/mL cefotaximegradiënt. Bescherming tegen cefotaxime is indicatief voor extended-spectrum bèta-lactamaseactiviteit.Let op dat het wildtype bèta-lactamase-enzym geen bescherming biedt in vergelijking met cellen die een lege vector tot expressie brengen. Daarom vertegenwoordigen deze mutanten een adaptatie of de evolutie van een nieuwe biochemische activiteit. Hier hebben we een krachtige combinatie van mutagenese en functionele selectie gepresenteerd voor deze generatie van nieuwe biochemische activiteiten.Een functionele selectie kan worden verkregen via medicijnselectie of via genetische complementatie, en maakt gebruik van ons vermogen om een grote genetische diversiteit te genereren. De pathogenese moet mogelijk worden beperkt tot een bepaalde sequentie om reeds bestaande eiwitactiviteiten te optimaliseren of voor site-directed pathogenese. Deze kunnen eenvoudig worden uitgevoerd door middel van klonering.Daarnaast kan mutagenese worden losgekoppeld van een functionele selectie om handtekeningaanvallen of mutationele voetafdrukken te verkrijgen.

mutagenesis-functional-selection-protocols-for-directed-evolution

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Systematische, grootschalige synthetische genetische (gen-gen of epistase) interactie schermen kunnen worden gebruikt om genetische redundantie en route overspraak verkennen. Hier hebben we een high-throughput kwantitatieve synthetische genetische scala screening technologie te beschrijven, genoemd eSGA door ons ontwikkelde voor het ophelderen van epistatisch relaties en het verkennen van genetische interactie netwerken...

Het in kaart brengen Bacteriële Functionele Netwerken en Wegen in<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Gebruik van synthetische Genetische Arrays

Een nieuwe methode gerichte evolutie eigen aan de thermostabiliteit van techniek is ontwikkeld en dus gevalideerd voor bacteriolytische enzymen. Na een ronde van willekeurige mutagenese, een geëvolueerd bacteriolytische enzym PlyC 29C3, weergegeven groter is dan tweemaal de restactiviteit in vergelijking met het wild-type eiwit na incubatie verhoogde temperatuur.

Een nieuwe screeningsmethode voor de gerichte evolutie van thermostabiele Bacteriolytic Enzymen

Eiwit co-expressie is een krachtige alternatief voor de reconstitutie in vitro van eiwitcomplexen, en helpt bij het uitvoeren van biochemische en genetische tests in vivo. Hier rapporteren we over het gebruik van eiwit co-expressie in Escherichia coli om eiwitcomplexen te verkrijgen en om de mutatiefrequentie van cellen af te stemmen.

De veelzijdige voordelen van Protein Co-expressie in<em&gt; Escherichia coli</em

We presenteren een gedetailleerd protocol om mutantenbibliotheken te construeren en te screenen voor gerichte evolutiecampagnes in Saccharomyces cerevisiae.

Geregisseerd Evolution Method in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;: Mutant Bibliotheek Creatie en Screening

We presenteren een protocol voor de functionele beoordeling van de uitgebreide single-site verzadigingsmutagenese bibliotheken van eiwitten met behulp van high-throughput sequencing. Belangrijk is dat deze aanpak maakt gebruik van orthogonale primer paren bibliotheek bouw en sequencing multiplexen. Representatieve resultaten met behulp van TEM-1 β-lactamase gekozen klinisch relevante dosering van ampicilline wordt verschaft.

Een protocol voor Functionele Evaluatie van Whole-Protein verzadigingsmutagenese Bibliotheken Met behulp van High-throughput sequencing

Dit artikel beschrijft een gedetailleerde methodologie voor willekeurige mutagenese van een target-gen in kernsplijting gist. Als voorbeeld, wij de doelstelling van rpt4 +, die codeert een subeenheid van de 19S proteasoom, en het scherm voor mutaties die heterochromatin te destabiliseren.

Gen-gerichte willekeurige mutagenese Heterochromatin-destabiliserende proteasoom mutanten in Fission gist selecteren

Plaats-geleide mutagenese is een techniek die wordt gebruikt om specifieke mutaties in deoxyribonucleic acid (DNA). Dit protocol beschrijft hoe het te doen plaats-geleide mutagenese met een 2-step en 3-staps polymerase-kettingreactie (PCR) gebaseerde benadering, die is van toepassing op elk fragment van DNA van belang.

Plaats-geleide mutagenese voor In Vitro en In Vivo experimenten wordt geïllustreerd met RNA interacties in Escherichia Coli

Het doel van dit manuscript is om een overzicht te presenteren voor de uitgebreide biochemische en functionele studies van de RING-type E3 ubiquitine ligases. Deze pijplijn met meerdere stappen, met gedetailleerde protocollen, valideert een enzymatische activiteit van de geteste eiwitten en laat zien hoe u de activiteit koppelt aan functie.

Functionele karakterisatie van RING-type E3 Ubiquitin ligases in vitro en in planta

De endonucleases van de beperking met nieuwe opeenvolgingsspecificiteit kunnen van enzymen worden ontwikkeld die een gedeeltelijk gedegenereerde opeenvolging erkennen. Hier bieden we een gedetailleerd protocol dat we met succes gebruikt om de volgorde specificiteit van NlaIV enzym te veranderen. De belangrijkste ingrediënten van het protocol zijn de in vitro compartimentering van de transcriptie/vertaalreactie en selectie van varianten met nieuwe sequentiespecifiekekenmerken.

In Vitro Gerichte Evolutie van een beperking Endonuclease met strengere specificiteit

Plaatsgerichte mutagenese van hele plasmiden is een eenvoudige manier om iets verschillende varianten van een origineel plasmide te creëren. Hier laten we zien op een eenvoudige en kosteneffectieve manier om de base substituties te introduceren in een plasmide met behulp van standaard reagentia.

Homemade plaatsgerichte mutagenese van Whole Plasmids

Leer gerichte evolutie van eiwitten in Escherichia coli via mutagenese en functionele selectie. Dit protocol genereert willekeurige mutantenbibliotheken en identificeert nuttige mutaties voor industriële en biomedische toepassingen.

Mutagenese en functionele selectie Protocollen voor Gerichte ontwikkeling van eiwitten in E. coli

Meer video's verkennen