Mutagenese en functionele selectie Protocollen voor Gerichte ontwikkeling van eiwitten in E. coli

Het algemene doel van deze procedure is om een willekeurige mutantenbibliotheek te creëren voor een gegeven doel-DNA-sequentie, en om mutanten snel te identificeren en te karakteriseren met behulp van semi-kwantitatieve functionele selectie. Dit wordt bereikt door eerst een plasmide met een coli, één replicatieoorsprong met de doelsequentie, te transformeren in de mutatorstam. Na het plateren en overnacht incuberen van de cellen, worden ze geoogst en wordt het doelplasmide geïsoleerd om de mutantenbibliotheek te verkrijgen, de mutantenbibliotheek wordt vervolgens getransformeerd in een uitleesstam om de mutaties in de tweede fase van het protocol te karakteriseren, Een gradiëntgroeiplak wordt geconstrueerd en bacterieculturen van de uitleesstam worden geladen in een aparte petrischaal met zachte aer.

De laatste stap van de procedure is om deze bacterieculturen op de gradiënt te stempelen. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die veranderingen in het fenotypeprofiel van een gegeven doelsequentie laten zien door verschillen in groei op een geneesmiddelgradiënt. Deze video presenteert een methode voor de gerichte evolutie van eiwitten in e coli.

Dit proces bootst de natuurlijke evolutie na in de generatie van willekeurige voedingsbibliotheken, gevolgd door een selectie die die diversiteit beperkt. Aldus verbetert dit onze mogelijkheden om nieuwe biochemische activiteiten voor industriële of biomedische doeleinden te genereren. Deze procedure heeft twee componenten, de generatie van een willekeurige mutantenbibliotheek en de functionele selectie om gain-of-function mutaties te verkrijgen. Deze procedure zal worden gedemonstreerd door Jennifer Allen, een technicus uit mijn laboratorium.

Voorafgaand aan het begin van dit protocol, gedachte elektrocompetente JS 200 cellen die een laag-getrouwheidsvariant van DNA-polymerase een of laag-getrouwheidspool een uitdrukten, die eerder was voorbereid zoals beschreven in het geschreven protocol, deze cellen bevatten een temperatuurgevoelige allel van pool een, zodat laag-getrouwheidspool een activiteit overheerst bij 37 graden Celsius, construct. Een doelplasmide dat een coli, een replicatieoorsprong bevat met de doelsequentie gekloond naast het replicatieoorsprong, laag-getrouwheidspool een initieert coli, een plasmide replicatie. Hierdoor worden mutaties geïntroduceerd om mutagenese te initiëren.

Combineer 40 microliter elektrocompetente cellen en tussen 30 tot 250 nanogram doelplasma-DNA in een twee millimeter spleet. Elektroporeer de mix in de elektro bij 1800 volt. Controleer de tijdconstante of TC om uniforme ationsomstandigheden voor elk monster te garanderen.

Idealiter is TC gelijk aan vijf tot zes milliseconden. Laat het cellen-DNA-mengsel herstellen in één milliliter LB-bouillon gedurende 40 minuten bij 37 graden Celsius, schuddend bij 250 RPM. Verkrijg een 100 millimeter LV agro-Petrischaal voorverwarmd tot 37 graden Celsius met geschikte antibiotica om te selecteren voor beide plasmiden. Plateer de herstelde cellen op een geschikte verdunning om een ​​bijna grasveldconcentratie te verkrijgen, die wordt gedefinieerd als een duidelijk maar niet telbaar aantal kolonies zoals in dit voorbeeld wordt getoond.

Na overnachtelijke incubatie, oogst de bacteriekolonies van de Petrischotels met LB-bouillon. Isoleer plasmide-DNA van de geoogste cellen, de resulterende plasmide-DNA vormt de willekeurige mutantenbibliotheek.

Voer een restrictiedigest uit door de plasmidebibliotheek te snijden met een restrictie-enzym dat zowel het doelplasmide als de pool een lineair maakt. Voer een analytische aro-gel uit op het geïsoleerde plasmide-DNA om kwaliteit en kwantiteit te bevestigen. Zodra de plasmiden zijn geverifieerd, verteer een microgram van de bibliotheek met een restrictie-enzym dat de pool een plasmide lineair maakt, maar het doelplasmide niet snijdt.

Nadat de restrictiedigest voltooid is, maak de bibliotheek schoon met behulp van een DNA-zuiveringskit. Transformeer vervolgens de schone bibliotheek in een uitleesstam om de mutaties te karakteriseren. Om met de gradiëntvoorbereiding te beginnen, markeer 10 banen die gelijkmatig zijn verdeeld over één rand van de onderkant van de vierkante petrischaal.

Plaats de schotel op een helling zodat de onderkant van de gemarkeerde rand zeven millimeter wordt verhoogd. Giet 25 milliliter warme lb-agar goed gemengd met een geschikte concentratie van het selectieve middel in de hellingschotel. Dit is de onderste laag van de gradiënt.

Zorg ervoor dat de LB-agar de petrischaal bedekt zodat het verhoogde gemarkeerde uiteinde van de schotel ongeveer één millimeter LB-agar bevat en het verlaagde deel ongeveer acht millimeter. Bedek de plaat met het deksel KU voor ventilatie en laat de agri 10 tot 15 minuten zetten. Nadat de onderste laag van LB-agar is uitgehard, verplaats de schotel naar een vlak oppervlak.

Giet vervolgens 25 milliliter warme lb-agar zonder het selectieve middel om de eerste agri-oppervlakte te bedekken, zorg ervoor dat de volledige onderste laag wordt bedekt. Bedek de plaat met het deksel KU voor ventilatie en laat de agri vervolgens 10 tot 15 minuten zetten om de stempeloverdracht van bacteriën uit te voeren. Verkrijg eerst bacterieculturen van de uitleesstam en verdun ze om identieke celdichtheden te hebben met een optische dichtheid bij 600 nanometer van minder dan 1,0.

Transfer vervolgens twee milliliter vloeibare zachte agar, geëquilibreerd op 42 graden Celsius, naar de bodem van een ronde 100 millimeter petrischaal, pipet 40 microliter van de bacteriecultuur in de zachter en meng vervolgens door de plaat te wiegen. Bekleed de lange rand van de glazen microscoopslide met het zachtere mengsel. Lijn vervolgens de beklede rand van de slide uit met de onderste markering op de gradiëntschaal.

Raak de slide aan de oppervlakte van de agar aan. Een zachte aanraking is voldoende om een ​​lint van de zachte agar naar het gradiëntoppervlak over te brengen. De slide wordt vervolgens opzij gezet voor reiniging en hergebruik.

Herhaal dit proces. De resterende monsters, experimentele controles moeten op elke gradiëntschaal worden opgenomen. Als er meerdere gradiënten worden uitgevoerd, incubeer de gradiëntsch