Gist Colony integratiemethode
March 22nd, 2011
Een methode voor het inbedden gistkolonies waardoor snijden voor licht-en elektronenmicroscopie. Dit protocol maakt de bepaling van de verdeling van gesporuleerde cellen en pseudohyfale cellen in kolonies die een nieuwe tool in de richting van het begrijpen van de organisatie van de celtypen in een schimmel gemeenschap.
Het algemene doel van deze procedure is om gistkolonies in te bedden. Dit wordt bereikt door eerst een kolonie en de onderliggende agar van een agarplaat te verwijderen, het op verschillende druppels gesmolten agar te plaatsen en het snel te bedekken met meer gesmolten agar. Vervolgens wordt overtollig AER van de kolonie getrimd om het klein genoeg te maken om in een mal te passen.
De in AER ingebedde kolonie wordt vervolgens gefixeerd, gekleurd, gedehydrateerd en uiteindelijk geïnfiltreerd met spurshars. De blok wordt vervolgens in een mal geplaatst met extra spurshars geïncubeerd totdat het hard is geworden en vervolgens gesneden. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de verdeling van celtypen binnen een gistkolonie laten zien door middel van licht- of elektronenmicroscopie.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals scanning elektronenmicroscopie, is dat het de interne structuur van de kolonie laat bepalen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen op het gebied van microbiele ontwikkeling, zoals de verdeling van celtypen binnen kolonies. Deze methode heeft inzicht gegeven in de structuur van croce CAC-kolonies, maar het is waarschijnlijk dat het ook op andere micro-organismen kan worden toegepast.
Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, omdat het hanteren en inbedden van kolonies moeilijk te leren is vanuit een geschreven protocol. Het idee voor deze methode werd geïnspireerd door enkele genetische gegevens die we in 2002 publiceerden en die suggereerden dat sporen niet gelijkmatig in kolonies werden verdeeld. We hebben een methode voor het snijden van kolonies aangepast die werd ontwikkeld door engelberg in het fin lab.
Dus laten we beginnen. Begin door Wild S visi gist te incuberen op augerplaten bij 30 graden tot er ongeveer 300 kolonies aanwezig zijn. Gebruik een smalle spatel om kolonies van één tot twee millimeter diameter, één voor één van de plaat te verwijderen.
Gebruik vervolgens een 1 milliliter pipettenman tip om verschillende druppels van 2% agar op 42 graden Celsius op een microscoopglasplaat te plaatsen, en plaats onmiddellijk de kolonie op agar met de bovenkant naar boven voordat de AER stolt. Plaats meerdere druppels agar op de kolonie en laat de agar stollen om ervoor te zorgen dat de hele kolonie, inclusief de bovenkant van de kolonie, in agar is ingekapseld. In alle volgende protocolstappen met een scheermesje.
Trim de AER rond de kolonie en plaats de AER-blok met de kolonie. In een 3,5 milliliter bo silicaat schroefdop met 2% paraform aldehyde en 2% glutaraldehyde fixatief moeten kolonies worden verwerkt, één voor één om uitdroging te voorkomen, maar tot 10 kolonies kunnen in dezelfde fles worden geplaatst. Laat de kolonies zeven dagen staan bij vier graden Celsius.
Na één week verwijdert u het fixatief en was de agri-kolonies twee keer, met ongeveer 1,5 milliliter 0,15 molair natrium. Cate bij pH 7,2 en incubeer op ijs na elke wassing gedurende 15 minuten zonder agitatie. Volgend op deze wassing nog twee keer.
Gebruik 1,5 milliliter van een X OS buffer, bestaande uit 100 millimolair monokaliumfosfaat, 10 millimolair magnesiumchloride bij pH 6,0, incubeer gedurende vijf minuten op ijs na elke wassing. Gebruik vervolgens dezelfde fles en voer de osmiumbehandeling en wasbeurten uit die hier en in het geschreven deel van dit protocol zijn vermeld. Gebruik vervolgens dezelfde fles en voer de stapsgewijze dehydraties uit die hier en in het bijbehorende geschreven protocol zijn vermeld, vroeg de volgende ochtend.
Bereid spursreagens zoals hier en in het bijbehorende geschreven protocol wordt getoond. Was de agri-blokken onmiddellijk vijf keer gedurende 10 minuten elke met 1,5 milliliter 100% kamertemperatuur ethanol. Na de laatste ethanolwas verwijdert u slechts genoeg ethanol zodat de agri-blok bedekt blijft.
Gebruik een weidepipet om ongeveer 0,5 milliliter spursreagens in de fles te plaatsen en draai gedurende 15 minuten op een wiel op lage snelheid. Na rotatie op kamertemperatuur laat u de fles gedurende 30 minuten staan. Vervolgens verwijdert u de oplossing volledig.
Voeg vervolgens 1,5 milliliter spursreagens toe om de agri-blok te bedekken. Draai de fles weer gedurende 15 minuten op een wiel op kamertemperatuur en laat het gedurende 30 minuten staan. Herhaal deze wassing.
Herhaal dit proces nog drie keer. Na de laatste 30 minuten verwijdert u spursreagens en voegt u vers spursreagens toe om de blokken te bedekken. Laat de agri-blokken gedurende vier uur op kamertemperatuur staan.
Vervang het spursreagens en draai het gedurende de nacht. De volgende ochtend vervangt u het spursreagens en laat u de flesjes draaien tot de volgende dag. De volgende ochtend plaatst u spursreagens in genummerde siliconen mallen om net de bodem van de mallen te bedekken.
Plaats vervolgens de agri-blokken in de mallen en incubeer gedurende vier uur bij 60 graden Celsius. Na vier uur vult u de mallen aan met meer spurs-reagens en incubeer gedurende de nacht bij 60 graden Celsius. Verwijder de blokken uit de mal voor het snijden.
Een voorbeeld van een lichtmicrograaf van een doorsnede door het centrum van een kolonie van Wild S Visia gistkolonie wordt hier getoond. Deze gist is een wildtype stam geïsoleerd uit boomexsudaten. De kolonie werd zes dagen op YNA-medium geïncubeerd voorafgaand aan het snijden.
In deze afbeelding zijn asai, pseudohyfe en ovoid gist gemakkelijk te onderscheiden en is ook het gebied van de kolonie dat de onderliggende agar binnendringt duidelijk zichtbaar. Open pijlen geven representatieve asai-gevulde pijlen aan, representatieve ovoid vegetatieve cellen gevulde pijlpunten geven ketens van langwerpige cellen en si aan. Deze afbeelding is een voorbeeld van een elektronenmicrograaf van een dunne sectie van een laboratoriums
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel presenteert een methode voor het inbedden van gistkolonies, waardoor het mogelijk wordt om secties te maken voor licht- en elektronenmicroscopie. Het protocol vergemakkelijkt de analyse van gesporuleerde en pseudohyfale cellen binnen kolonies, wat bijdraagt aan het begrip van celtype-organisatie in schimmelgemeenschappen.
Belangrijkste onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Microbiologie
- Celbiologie
- Schimmelbiologie
Achtergrond
- Gistkolonies vertonen diverse celtypen.
- Het begrijpen van celverdeling is cruciaal voor het bestuderen van schimmelgemeenschappen.
- Traditionele methoden kunnen geen gedetailleerde inzichten bieden in celorganisatie.
- Deze methode biedt een nieuwe aanpak voor visualisatie.
Doel van het onderzoek
- Om een protocol te ontwikkelen voor het inbedden van gistkolonies.
- Om gedetailleerde analyse van celtypeverdeling mogelijk te maken.
- Om het begrip van schimmelgemeenschapsorganisatie te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Verwijdering van gistkolonies van agarplaten.
- Inbedden van kolonies in gesmolten agar.
- Trimmen van overtollig agar om in mallen te passen.
- Fixatie, kleuring, dehydratie en infiltratie met hars.
Belangrijkste resultaten
- Succesvol inbedden van gistkolonies voor microscopie.
- Visualisatie van gesporuleerde en pseudohyfale cellen.
- Gedetailleerde verdelingsanalyse van celtypen binnen kolonies.
- Nieuwe inzichten in de organisatie van schimmelgemeenschappen.
Conclusies
- De inbeddingsmethode is effectief voor microscopie-analyse.
- Het biedt een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van gistkoloniestructuur.
- Toekomstig onderzoek kan op deze methode voortbouwen om schimmelinteracties te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Understanding spatial organization of cell types within microbial communities supports target validation in antimicrobial and antifungal discovery. This method enables mechanistic de-risking by revealing phenotypic heterogeneity that may influence drug response and resistance development. It provides predictive confidence for early-stage screening by linking colony architecture to functional subpopulations.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing sporulated and pseudohyphal cell distribution within colonies.
- Operational Value: Supports biological de-risking through direct observation of cell type patterning linked to functional states.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by preserving spatial relationships of cell types.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through consistent sectioning and imaging of colony interior structures.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Discusses disease relevance through visualization of invading colony regions that model microbial penetration into host tissues.
- Operational Value: Describes continuity from discovery through preclinical validation by enabling structural correlation with phenotypic outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
Positions the method within early discovery to lead identification by enabling structural phenotyping that informs compound screening decisions.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing and pathway clarification via direct imaging of asymmetric cell distribution.
- Screening: Describes assay readiness through production of thick and thin sections compatible with light and electron microscopy.
- Analytics: Highlights quantitative outputs such as frequency mapping of sporulated cells across colony regions for comparative analysis.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity by linking invasive colony fronts to tissue penetration models.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability for structural analysis across multiple fungal strains and conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in microbial community behavior.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of colony preparation for multi-user microscopy pipelines.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk through early phenotypic de-risking.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on structural biomarkers of virulence or persistence.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in histology, microscopy, and microbial handling.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs including microtomes, light and electron microscopes, and resin infiltration systems.
- Cross-team standardization requirements for fixation, staining, and sectioning protocols across microbiology and imaging groups.
- Adaptation considerations across model systems such as biofilm-forming bacteria or other yeast species with varying colony morphology.
- Practical limitations supported by source material including colony size constraints (1-2 mm diameter) and multi-day processing time requiring sterile technique to prevent contamination.
