Name: Gist Colony integratiemethode (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-22T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Leer gistkolonies inbedden voor licht- en elektronenmicroscopie. Deze methode maakt gedetailleerde analyse van sporulerende en pseudohyfe cellen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Onderzoek werd gefinancierd door NIH 1R15GM094770.

1. Kolonie Isolatie en fixatie <ol><li> Incubeer 300 kolonies op agar medium voor de aangegeven tijd (een geïsoleerde kolonie moet 1-2 mm in diameter). </li><li> Verwijder de kolonie (naar boven) en de onderliggende medium met behulp van een smalle spatel. </li><li> Plaats een paar druppels van 2% agar 42 ° C op een objectglaasje met behulp van een mL Pipetman tip en meteen plaats kolonie op agar naar boven voordat het stolt. </li><li> Plaats een paar druppels van 2% agar 42 ° C op kolonie en laat stollen. </li><li> Draag handschoenen voor alle stappen door de rest van dit protocol </li><li> Trim blok met scheermesje en leg ze in een 3,5 ml borosilicaat schroefdop flacon bevat 2% paraformaldehyde / 2% glutaaraldehyde fixeermiddel voor 7 dagen bij 4 ° C. </li></ol> 2. Wast en Osmium behandeling <ol><li> Na ongeveer 1 week, wassen agar blokken op ijs onder chemische dampkap door het incuberen van twee keer 15 minuten met genoeg 0,15 M natrium cacodylate (pH 7,2) naar de kolonie (ongeveer 1,5 ml) en vervolgens nog twee keer gedurende 5 minuten volledig bedekken met hetzelfde volume van 1X OS buffer (100 mM KH 2 PO 4 10 mM MgCl 2, pH 6,0). </li><li> Voeg hetzelfde volume van 1% OSO 4 [2 mL Oso 4 (2%) + 2 ml 2x OS Buffer] om de injectieflacons (op ijs) om de agar blokken onder chemische dampkap gedurende 1 uur te dekken dan twee keer wassen met hetzelfde bedrag van 1X OS buffer gedurende 10 minuten elk. </li><li> Laat flacons overnacht bij 4 ° C in 1x OS buffer. </li><li> Fixatief en alles wast in deze stap worden verwijderd als gevaarlijk afval. Alle pipetten met Oso 4 werden gespoeld 3X met plantaardige olie. </li></ol> 3. Wassen en uitdroging <ol><li> De volgende ochtend was agar blokken twee keer op het ijs met hetzelfde volume als hierboven met koud water gedurende 10 minuten per behulp van Pasteur pipet. </li><li> Was opeenvolgend met hetzelfde volume van 25%, 50%, 75%, 95% ethanol gedurende 10 minuten elk gevolgd door twee wasbeurten met 100% ethanol gedurende 10 minuten. Laat een nacht bij 4 ° C, in 100% ethanol. </li><li> Alle wasbeurten in deze stap worden verwijderd als gevaarlijk afval. </li></ol> 4. Spurr's voorbereiding <ol><li> De volgende ochtend (zo vroeg mogelijk) wegen van de volgende oplossingen (EM Sciences) in een wegwerp plastic beker onder een zuurkast te Spurr-reagens te bereiden. Voor alle verdere werk met behulp van dit reagens, nog steeds een zuurkast te gebruiken. (ERL 4221-oplossing 5 gram) (DER 736-oplossing 4 gram) (NSA oplossing 13 gram) </li><li> mix van deze oplossingen (langzaam) gedurende 20 minuten in capuchon met een roerstaafje </li><li> Voeg DMAE oplossing 0,15 gram en roerbak 20 minuten, zoals hierboven. </li><li> Degas bovenstaande mengsel voor 1-2 uur in capuchon. </li></ol> 5. Spurr's Infiltratie <ol><li> Zodra Spurr is gemaakt wassen agar blokken 5 keer met hetzelfde volume als boven de 100% ethanol kamertemperatuur gedurende 10 minuten elk. Na de laatste ethanol te wassen wordt de ethanol met behulp van een Pasteur pipet, zodat de resterende ethanol alleen de agar blokken bedekt. </li><li> Voeg ongeveer een gelijke hoeveelheid reagens Spurr's (ongeveer 0,5 ml) en draai flesjes op het wiel gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur en daarna laat het 30 minuten staan. Na 30 minuten verwijderd van de oplossing volledig met behulp van een Pasteur pipet, voeg Spurr's te dekken agar blok (ongeveer 1,5 ml), draaien flesjes op het wiel gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur en laat 30 minuten staan. Herhaal de Spurr's vervanger, rotatie, en de incubatietijd drie keer. </li><li> Na de laatste 30 minuten, verwijder Spurr's reagens en voeg verse Spurr om de blokken te dekken. Laat de agar blokken om bij kamertemperatuur staan ​​4 uur. </li><li> Vervang de Spurr en draaien 's nachts. </li><li> In de ochtend vervangen Spurr's en laat draaien tot de volgende dag. </li><li> De volgende ochtend plaats Spurr in genummerde siliconen mallen (Fisher Scientific) alleen maar om de onderkant van mallen dek agar blokken toe te voegen aan de mallen. Incubeer bij 60 ° C gedurende 4 uur </li><li> Na 4 uur, top uit de mallen, met meer Spurr's en incubeer bij 60 ° C gedurende de nacht. </li><li> Als na het verwijderen van de blokken van mallen de blokken zijn nog steeds enigszins flexibel zijn, terug naar de mallen en incubeer een extra 2 dagen </li></ol> 6. Snijden <ol><li> Een Leica Ultracut S microtoom werd gebruikt om de 0,5 μ dikke secties voor lichtmicroscopie en 0,1 μ dunne secties voor transmissie EM te snijden. </li><li> Voor lichte microscopie, zoals coupes werden gesneden, werden ze geplaatst op een daling van dH 2 O, en gedroogd op een 52 ° C verwarmen blokkeren. Gedroogde secties werden vervolgens gekleurd met een daling van 1,0% toluïdine blauw, 1% natriumboraat voor 5-15 seconden. Na kleuring werden de secties onmiddellijk gewassen onder een stroom van water, gedroogd, bedekt met montage media (KPL), en een dekglas verzegeld over het monster. </li></ol> De brede relevantie van het meten van patroonvorming in gist en andere micro-organismen zijn eerder een beoordeeld. Van bijzonder belang is de toegenomen functionaliteit van de georganiseerde microbiële kolonies ten opzichte van gedesorganiseerd gemeenschappen. De beschreven methode is een wijziging van een methode voor het inbedden van een grotere gespecialiseerde kolonies 2, en een korte beschrijving van onze aanpassingen is gepubliceerd 3. Een voorbeeld van een licht microfoto van een doorsnede door het midden van een kolonie van wilde S. cerevisiae gist kolonie is weergegeven in figuur 1. ASCI, pseudohyphae en eivormige gist zijn gemakkelijk te onderscheiden, en de regio van de kolonie invasie van de onderliggende agar is ook duidelijk. Een voorbeeld van een electronen microscoop foto van een laboratorium stam van gist (W303 achtergrond) is weergegeven in figuur 2. Het beeld is uit een regio van de kolonie met een hoge frequentie van gesporuleerde cellen. <img src="/files/ftp_upload/2510/2510fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Lichtmicroscopie van een wilde gist kolonie. Deze gist (YPS133) is onlangs geïsoleerd van de boom exsudaten 4. De kolonie werd geïncubeerd gedurende 6 dagen op YNA medium 5 voorafgaand aan snijden. Open pijlen geven vertegenwoordiger van ASCI, gevuld pijlen geven vertegenwoordiger eivormig vegetatieve cellen, gevuld pijlpunten wijzen op ketens van langgerekte cellen (pseudohyphae) en de ASCI. <img src="/files/ftp_upload/2510/2510fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Elektronenmicroscopie van een laboratorium giststam. De kolonie van SH1020 (W303 achtergrond) werd geïncubeerd gedurende 6 dagen op YNA medium voorafgaand aan snijden 3. Afbeelding toont een gebied van de sectie met een hoge frequentie van ASCI. Een pijl geeft aan dat de bi-laag-structuur van de spore muur. <img src="/files/ftp_upload/2510/2510fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Kwantificering van de verdeling van gesporuleerde cellen in kolonies: A) een grid met 15 aangrenzende rechthoeken gestapeld langs de lange zijde is bovenop de centrale regio van een beeld van een kolonie sectie. Het raster wordt geschaald, terwijl de verhoudingen constant, om er maar omvat de boven-en onderkant van de kolonie. (B &amp; C) De fractie van gesporuleerde cellen in elke rechthoek ten opzichte van de totale cellen in die rechthoek wordt bepaald door visuele inspectie van beelden van 4-dagen oude (B) en 8-dagen oude (C) kolonies. Bijvoorbeeld, de rechthoek aan de bovenkant van de kolonie ("1") komt overeen met de linkerkant van de grafiek. Gemiddelde van vier kolonies is getoond; de foutbalken display van de std. fout.

<ol><li>Kimmel, A. R., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+symmetries%3A+regulation+of+Dictyostelium+development+through+chemoattractant+and+morphogen+signal-response%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Breaking symmetries: regulation of Dictyostelium development through chemoattractant and morphogen signal-response.</a> Curr Opin Genet Dev. 14, 540-540 (2004).</li>
<li>Palkova, Z., Vachova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+within+a+community%3A+benefit+to+yeast+long-term+survival%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Life within a community: benefit to yeast long-term survival.</a> FEMS Microbiol Rev. 30, 806-806 (2006).</li>
<li>Shapiro, J., Vachova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+significances+of+bacterial+colony+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">The significances of bacterial colony patterns.</a> Bioessays. 17, 597-597 (1995).</li>
<li>Shapiro, J., Vachova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thinking+about+bacterial+populations+as+multicellular+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Thinking about bacterial populations as multicellular organisms.</a> Annu Rev Microbiol. 52, 81-81 (1998).</li>
<li>Engelberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+stalk-like+structures+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Multicellular stalk-like structures in Saccharomyces cerevisiae.</a> J Bacteriol. 180, 3992-3992 (1998).</li>
<li>Scherz, R., Shinder, V., Engelberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+analysis+of+Saccharomyces+cerevisiae+stalk-like+structures+reveals+spatial+organization+and+cell+specialization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Anatomical analysis of Saccharomyces cerevisiae stalk-like structures reveals spatial organization and cell specialization.</a> J Bacteriol. 183, 5402-5402 (2001).</li>
<li>Piccirillo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rim101p%2FPacC+pathway+and+alkaline+pH+regulate+pattern+formation+in+yeast+colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The Rim101p/PacC pathway and alkaline pH regulate pattern formation in yeast colonies.</a> Genetics. 184, 707-707 (2010).</li>
<li>Sniegowski, P. D., Dombrowski, P. G., Fingerman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saccharomyces+cerevisiae+and+Saccharomyces+paradoxus+coexist+in+a+natural+woodland+site+in+North+America+and+display+different+levels+of+reproductive+isolation+from+European+conspecifics%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Yeast+Res%22%5BJournal%5D)">Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces paradoxus coexist in a natural woodland site in North America and display different levels of reproductive isolation from European conspecifics.</a> FEMS Yeast Res. 1, 299-299 (2002).</li>
<li>Piccirillo, S., Honigberg, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sporulation+patterning+and+invasive+growth+in+wild+and+domesticated+yeast+colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Res+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Sporulation patterning and invasive growth in wild and domesticated yeast colonies.</a> Res Microbiol. 161, 390-390 (2002).</li>
<li>Vachova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+developing+multicellular+yeast+colony%3A+spatio-temporal+expression+of+Ato1p+ammonium+exporter%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Architecture of developing multicellular yeast colony: spatio-temporal expression of Ato1p ammonium exporter.</a> Environ Microbiol. , (2009).</li>
</ol>

De gepresenteerde methode toont het interieur structuren van de kolonies. Omdat de methode effectief is bij het ​​bepalen van de patronen van celtypen in een reeks van S. cerevisiae stammen met verschillende kolonie morfologie, en ook in een verwante soorten S. paradoxus 5, de methode is ook kans om te werken op een breed scala van schimmels en andere micro-organismen. Een kritische stap voor het succes van de methode is om ervoor te zorgen dat de gehele kolonie, waaronde...

<table><tbody><tr><td>Osmiumtetroxide</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>RT 19152</td><td></td></tr><tr><td>Siliconen inbeddingsmallen</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC 9975029</td><td></td></tr><tr><td>Cycloalifatische epoxidehars</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>RT 15004</td><td>ERL 4221</td></tr><tr><td>Epoxyhars</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>RT 13000</td><td>DER 736</td></tr><tr><td>Nonenylbarnsteenzuuranhydride</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>RT 19050</td><td>NSA</td></tr><tr><td>2-Dimethylamin&amp;#8211;ethanol</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>RT 13300</td><td>DMAE</td></tr><tr><td>Montagemedium</td><td>KPL Inc</td><td>71-00-16</td><td></td></tr><tr><td>Roterend wiel</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>Pelco 1055</td><td></td></tr><tr><td>Microtoom</td><td>Leica Microsystems</td><td>Ultracut S</td><td></td></tr></tbody></table>

gist colony integratiemethode

Yeast Colony Embedding Method

Patroonvorming van de verschillende celtypes in embryo&#39;s is een belangrijk mechanisme in metazoïsche ontwikkeling. Gemeenschappen van micro-organismen, zoals de koloniën en biofilms ook weer patronen van celtypen. Bijvoorbeeld, in de gist S. cerevisiae, zijn gesporuleerde cellen en pseudohyfale cellen niet uniform verdeeld in kolonies. De functionele betekenis van patronen en de moleculaire mechanismen die deze patronen ten grondslag liggen zijn nog slecht begrepen. Een van de uitdagingen met betrekking tot de onderzoeken van patronen van celtypen in schimmelkolonies is dat in tegenstelling tot metazoïsche weefsel, cellen in kolonies relatief zwak aan elkaar gehecht. In het bijzonder, hebben schimmelkolonies bevat niet dezelfde uitgebreide niveau van extracellulaire matrix gevonden in de meeste weefsels. Hier doen we verslag van een methode voor het inbedden en snijden gistkolonies dat het interieur patronen van celtypes openbaart in deze kolonies. De methode kan gebruikt worden om dikke secties voor te bereiden (0,5 μ) nuttig zijn voor lichtmicroscopie en dunne secties (0,1 μ) geschikt voor transmissie elektronenmicroscopie. ASCI en pseudohyfale cellen kunnen gemakkelijk te onderscheiden van eivormige gistcellen met lichtmicroscopie, terwijl het interieur structuur van deze cellen kan worden gevisualiseerd door EM. De methode is gebaseerd op de omliggende kolonies met agar, infiltreert ze met medium Spurr, en dan snijden. Kolonies met een diameter in het bereik van 1-2 mm zijn geschikt voor dit protocol. In aanvulling op het visualiseren van het interieur van de kolonies, de methode maakt het mogelijk visualisatie van de regio van de kolonie dat de onderliggende agar binnendringt.

Een methode voor het inbedden gistkolonies waardoor snijden voor licht-en elektronenmicroscopie. Dit protocol maakt de bepaling van de verdeling van gesporuleerde cellen en pseudohyfale cellen in kolonies die een nieuwe tool in de richting van het begrijpen van de organisatie van de celtypen in een schimmel gemeenschap.

Gist Colony integratiemethode

Patroonvorming van verschillende celtypen in embryo's is een sleutelmechanisme in de ontwikkeling van metazoa. Gemeenschappen van micro-organismen, zoals kolonies en biofilms ...

Het algemene doel van deze procedure is het inbedden van gistkolonies. Dit wordt bereikt door eerst een kolonie en de onderliggende agar van een agarplaat te verwijderen, deze op enkele druppels gesmolten agar te plaatsen en vervolgens snel te bedekken met meer gesmolten agar. Daarna wordt het overtollige agar rond de kolonie afgesneden om deze klein genoeg te maken om in een vorm te passen.De ingebedde AER-kolonie wordt vervolgens gefixeerd, gekleurd, gedehydrateerd en tot slot geïnfiltreerd met spurs-hars. Het blok wordt vervolgens in een vorm met extra spurs-hars geplaatst, geïncubeerd tot het is uitgehard en daarna gesneden. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de distributie van celtypen binnen een gistkolonie tonen via licht- of elektronenmicroscopie.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals scanning elektronenmicroscopie, is dat het mogelijk maakt om de interne structuur van de kolonie te bepalen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van microbiële ontwikkeling, zoals de distributie van celtypen binnen kolonies. Deze methode bood inzicht in de structuur van croce CAC-kolonies, maar het is waarschijnlijk dat deze ook kan worden toegepast op andere micro-organismen.Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien het hanteren en inbedden van kolonies moeilijk te leren kan zijn aan de hand van een geschreven protocol. Het idee voor deze methode werd geïnspireerd door genetische gegevens die we in 2002 publiceerden, waaruit bleek dat sporen niet gelijkmatig over de kolonies waren verdeeld. We hebben een methode voor het doorsnijden van kolonies aangepast die was ontwikkeld door Engelberg in het Fin-lab.Laten we beginnen. Begin met het incuberen van Wild S visi gist op auger-platen bij 30 °C totdat er ongeveer 300 kolonies aanwezig zijn. Verwijder met een smalle spatel één voor één kolonies met een diameter van één tot twee millimeter van de plaat.Plaats vervolgens met een pipetteertip van 1 ml enkele druppels 2% agar bij 42 °C op een microscoopglasplaatje, en plaats de kolonie onmiddellijk met de agarzijde naar boven op het glas voordat de AER stolt. Plaats nog enkele druppels agar op de kolonie en laat de agar stollen; zorg ervoor dat de gehele kolonie, inclusief de bovenkant, volledig is ingesloten in agar. In alle volgende protocolstappen met een scheermesje.Trim het AER rond de kolonie en plaats het AER-blok met de kolonie in een schroefdopbuisje van borosilicaatglas van 3,5 milliliter dat 2% paraformaldehyde en 2% glutaaraldehyde fixatief bevat. De kolonies moeten één voor één worden verwerkt om uitdroging te voorkomen, maar er kunnen tot 10 kolonies in hetzelfde buisje worden geplaatst. Laat de kolonies zeven dagen rusten bij vier graden Celsius.Verwijder na één week het fixatief en was de agri-kolonies twee keer met ongeveer 1,5 milliliters 0,15 molar natriumcate bij pH 7,2 en incubeer na elke wasbeurt 15 minuten op ijs zonder agitatie. Voer deze wasbeurt daarna nog twee keer uit.Gebruik 1,5 milliliters van een een X OS-buffer, bestaande uit 100 millimolar monokaliumfosfaat en 10 millimolar magnesiumchloride bij pH 6,0, waarbij na elke wasbeurt vijf minuten op ijs wordt geïncubeerd. Voer vervolgens, met gebruik van hetzelfde flacon, de osmiumbehandeling en de wasbeurten uit die hier en in het geschreven gedeelte van dit protocol worden vermeld. Voer daarna opnieuw, in hetzelfde flacon, de stapsgewijze dehydrataties uit die hier en in het bijbehorende geschreven protocol worden beschreven, vroeg de volgende ochtend.Bereid het spurs-reagens voor zoals hier getoond en in het bijbehorende geschreven protocol. Was de agri-blokken onmiddellijk vijf keer gedurende elk 10 minuten met 1,5 milliliters 100% ethanol op kamertemperatuur. Verwijder na de laatste ethanolwas slechts voldoende ethanol zodat het agri-blok bedekt blijft.Breng met een pasteurpipet ongeveer 0,5 milliliters spurs-reagens aan in het vial en roteer dit 15 minuten op lage snelheid op een rotatieapparaat. Laat het vial na rotatie 30 minuten staan bij kamertemperatuur. Verwijder vervolgens de oplossing volledig.Voeg vervolgens 1,5 milliliters spurs-reagens toe om het agri-blok te bedekken. Roteer het vial opnieuw 15 minuten op een wiel bij kamertemperatuur en laat het 30 minuten staan. Herhaal deze wasstap.Herhaal deze stap nog drie keer. Verwijder na de laatste 30 minuten het spurs-reagens en voeg vers spurs-reagens toe om de blokken te bedekken. Laat de agri-blokken vier uur bij kamertemperatuur staan.Vervang het spurs-reagens en laat dit een nacht roteren. De volgende ochtend wordt het spurs-reagens opnieuw vervangen; laat de vials roteren tot de volgende dag. De daaropvolgende ochtend wordt het spurs-reagens in genummerde siliconen mallen gegoten, zodanig dat de bodem van de mallen net bedekt is.Plaats vervolgens de agri-blokken in de vormen en incubeer deze gedurende vier uur bij 60 °C. Vul de vormen na vier uur aan met meer spurs en reagens, en incubeer deze gedurende de nacht bij 60 °C. Verwijder de blokken uit de vorm voor het maken van coupes.Hier is een voorbeeld van een lichtmicrofoto van een doorsnede door het centrum van een colony van Wild S Visia gist. Deze gist is een wildtype-stam die is geïsoleerd uit boomexudaten. De kolonie werd zes dagen lang geïncubeerd op YNA-medium voorafgaand aan het maken van de doorsnede.In deze afbeelding zijn asai, pseudo-hyfen en ovoïde gisten gemakkelijk te onderscheiden, en het gebied van de kolonie dat de onderliggende agar binnendringt is ook duidelijk zichtbaar. Open pijlen geven representatieve asai aan, gevulde pijlen geven representatieve ovoïde vegetatieve cellen aan en gevulde pijlpunten geven ketens van verlengde cellen en si aan. Deze afbeelding is een voorbeeld van een elektronenmicrografie van een dunne sectie van een laboratoriumstam van gist SH 1 0 2 0, en W 3 0 3.Achtergrond.De kolonie werd zes dagen lang geïncubeerd op YNA-medium voordat deze in secties werd gesneden. De afbeelding toont een gebied van de kolonie met een hoge frequentie van gesporuleerde cellen. Een pijl geeft de dubbellaagse structuur van de sporewand aan.In deel A tonen we een doorsnede van een vierdaagse kolonie met een raster bestaande uit 15 rechthoeken dat over de afbeelding in deel B is geplaatst. De frequentie van spore-gerelateerde cellen in elke rechthoek is uitgezet met 15 staven die overeenkomen met de 15 rechthoeken getoond in deel A. De gegevens zijn het gemiddelde en de standaardfout van vier onafhankelijke vierdaagse koloniën. In deel C worden de gemiddelden en standaardfouten voor vier onafhankelijke achtdaagse koloniën getoond. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in twee weken worden uitgevoerd, met één volledige dag en meerdere dagen van één tot drie uur. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de oplossingen onmiddellijk toe te voegen, zodat de blokken na deze procedure niet uitdrogen.Andere methoden, zoals immuno-elektronenmicroscopie, zouden mogelijk kunnen worden gebruikt om de distributie van cellen te bepalen die specifieke eiwitten tot expressie brengen na de ontwikkeling ervan. Deze techniek stelde ons in staat om niet alleen naar het patroon van sporulerende cellen te kijken, maar ook naar het patroon van pseudo-hyfale cellen in croce CCI-kolonies. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe gistkolonies moeten worden ingebed voor coupesnijden.Vergeet niet dat veel van de microscopiereagentia die in dit protocol worden gebruikt, uiterst gevaarlijk kunnen zijn. Denk eraan om een zuurkast te gebruiken, beschermende kleding te dragen en de reagentia op de juiste wijze af te voeren. Dat is alles.Bedankt voor het kijken. Veel succes met uw experimenten.

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een snelle techniek voor de visualisatie van de groeiende geïmmobiliseerde gistcellen, hier toegepast op de TL-verslaggevers bij de stille paring loci HML en...

Een snelle techniek voor de visualisatie van Live Geïmmobiliseerd gistcellen

This video describes a method to grow and qualitatively analyze bacterial biofilms on fungal hyphae using microscopy. Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and involve numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic cooperation, competition, or predation.

A Method for Sample Preparation to Visualize Biofilm Forming Bacteria on Fungal Hyphae

We presenteren een protocol voor het invriezen en cryosectioning gist gemeenschappen om interne patronen van fluorescerende cellen te observeren. De methode is gebaseerd op methanol-fixing en OCT-inbedding van de ruimtelijke verdeling van cellen te behouden zonder het inactiveren van fluorescerende eiwitten binnen een gemeenschap.

Cryosectioning Gist Gemeenschappen is voor de behandeling Fluorescentie Patterns

Er wordt een methode gepresenteerd voor het oppervlaktespreiden van chromosomen uit knoppende gist. Deze methode is afgeleid van een methode die eerder werd beschreven door Loidl en Klein. Bovendien demonstreren we een procedure voor immunokleuring van gespreide chromosomen.

Surface Het verspreiden en Immunokleuring van Gist Chromosomen

Gist is een voordelige model voor het bestuderen van de dynamica van microtubuli in vivo vanwege de krachtige genetica en de eenvoud van het microtubule-cytoskelet. Het volgende protocol wordt beschreven hoe om te transformeren en cultuur gistcellen, verwerven confocale microscopie afbeeldingen en kwantitatief te analyseren dynamiek van microtubuli in levende gistcellen.

Hoge-resolutie beeldvorming en analyse van individuele Astral dynamiek van microtubuli in gist

We beschrijven fixatie, paraffine insluiten en dunne vectorafbeeldingsbestanden technieken voor microbiële kolonie biofilms. In bereid monsters, kunnen biofilm substructuur en verslaggever expressiepatronen worden gevisualiseerd door microscopie.

Paraffine insluiten en dunne afdelen van microbiële kolonie Biofilms voor microscopische analyse

Hier presenteren we een MATLAB implementatie van geautomatiseerde detectie en kwantitatieve beschrijving van lipide druppeltjes in fluorescentiemicroscopie beelden van splijting en ontluikende gistcellen.

Analyse van de hoeveelheid lipide druppel in splijting en ontluikende gisten met behulp van geautomatiseerde beeldverwerking

Een knelpunt in de 'design-build-test' cyclus van microbiële engineering is de snelheid waarmee we functionele schermen van stammen kunnen uitvoeren. We beschrijven een high-throughput methode voor stam screening toegepast op honderden tot duizenden gistcellen per experiment dat droplet-gebaseerde RNA sequencing gebruikt.

Hoge doorvoer Gist Stam Federtyping met Droplet-Based RNA Sequencing

Gistgroei fenotypes worden nauwkeurig gemeten door middel van zeer parallelle time-lapse beeldvorming van geïmmobiliseerde cellen die uitgroeien tot microkolonnies. Tegelijkertijd kunnen stresstolerantie, eiwitexpressie en eiwitlokalisatie worden gemonitord, waardoor geïntegreerde datasets worden gegenereerd om te bestuderen hoe omgevings- en genetische verschillen, evenals genexpressie heterogeniteit tussen isogene cellen, de groei moduleren.

Live imaging met hoge doorvoer van microkolonnies om heterogeniteit in groei en genexpressie te meten

Dit protocol is een effectieve, snelle methode om gisten en de schimmel Aspergillus fumigatus uit grote sets bodemmonsters te kweken in slechts 7 dagen. De methoden kunnen eenvoudig worden aangepast om een reeks incubatiemedia en temperaturen te accommoderen als dat nodig is voor experimenten.

Isolatie van kweekbare gisten en schimmels uit bodems om de structuur van schimmelpopulaties te onderzoeken

Leer gistkolonies inbedden voor licht- en elektronenmicroscopie. Deze methode maakt gedetailleerde analyse van sporulerende en pseudohyfe cellen mogelijk.

Gist Colony integratiemethode

Meer video's verkennen