Verbeterde visualisatie en kwantitatieve analyse van de Drug effecten met behulp van micropatterned cellen
2 december 2010
Lijm micropatterns dat cellulaire architectuur normaliseren kan gebruikt worden om de gevoeligheid bij de detectie van de effecten van geneesmiddelen te verhogen, het verbeteren van de reproduceerbaarheid en vereenvoudiging van de geautomatiseerde beeldacquisitie en analyse. Deze technologie zullen profiteren drug / siRNA screeningstesten, uitgevoerd op conventionele celcultuur ondersteunt en daardoor lijden aan overmatige cel-tot-cel variabiliteit.
Het algemene doel van de volgende procedure is om te laten zien hoe normalisatie van celarchitectuur en -positie bereikt op specifieke kleefmicropatronen eenvoudige automatisering van beeldacquisitie en eenvoudigere beeldverwerking mogelijk maakt met gevoelige en robuuste kwantificering van geneesmiddeleffecten, wat onhaalbaar is op conventionele glazen dekselondersteuningen. Dit wordt bereikt door heli-cellen op SI-twee chips te zaaien die L-vormige SI drie gelabelde micropatronen dragen. De cellen nemen de driehoekige vorm aan en bouwen een grote spanningsvezel die de twee uiteinden van de L overspant. De patrooncellen worden vervolgens geïncubeerd met lebos-statin of onbehandeld gelaten, vervolgens gefixeerd en gekleurd om het acton-cytoskelet en de kernen te visualiseren.
Beelden van de micropatrooncellen worden vervolgens verkregen en verwerkt met behulp van de celref-macro om een stapel afbeeldingen voor analyse te genereren en de hypotenuse-macro om fenotypen te kwantificeren. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die een significant effect van lage doses van BLEs-statin op micropatroon HELOC-cellen laten zien, wat ondetecteerbaar is onder standaard celkweekcondities. Hallo, welkom.
We zijn hier vandaag om u door ons experimentele protocol te leiden en uit te leggen hoe u kleefmicropatronen kunt gebruiken voor celanalyse, evenals het tonen van experimentele gegevens die de eenvoudige kwantificering van zeer lage doses geneesmiddelen op deze kleefmicropatronen illustreren. Dus wanneer je deze micropatronen voor het eerst ziet, zul je meteen begrijpen hoe het variabiliteitsproblemen bij beeldacquisitie tijdens celanalyse kan oplossen. Omdat je door een echt array van cellen hebt, net als een microarray, kun je gemakkelijk de microscooptafel van cel naar cel verplaatsen om afbeeldingen in een stapsgewijze manier te kunnen vastleggen.
Maar dat is natuurlijk niet het enige voordeel van micropatronen dat het biedt. Het biedt veel meer verbeteringen omdat we in feite op bepaalde typische micropatronen zoals de crossbo of de Y de interne celarchitectuur normaliseren, wat betekent dat organellen, de mitotische spil, het cytoskelet en verschillende eiwitnetwerken allemaal op dezelfde locaties van cel tot cel of in dezelfde oriëntatie van cel tot cel zijn, wat het veel gemakkelijker maakt om de effecten van geneesmiddelen op deze specifieke patronen te voorspellen en te kwantificeren. Nu lijkt dit misschien nogal tegenintuïtief van wat normaal gesproken wordt gedaan in de klassieke petrischaal of microplaat.
Wel, omdat je natuurlijk vaak cellen ziet rondlopen en verschillende morfologieën aannemen. Terwijl op de kleefmicropatronen alle cellen op hetzelfde zullen gaan lijken omdat ze reageren op dit kleefmicropatroon en hun architectuur op dezelfde manier organiseren. Dit lijkt in feite een beetje kunstmatig, maar als je er van dichtbij naar kijkt, is de petrischaal niet zelfs nog kunstmatiger?
Omdat cellen in weefsels worden beperkt door de naburige cellen en door de extracellulaire matrix. Dus ze ontvangen veel ruimtelijke informatie, die de celarchitectuur oriënteert. En dit op de site om te ad van micropatronen is wat we doen.
We herstellen deze ruimtelijke informatie voor cellen en alle cellen reageren hierop en organiseren zich op dezelfde manier. En nu omdat cellen er allemaal hetzelfde uitzien, kunnen we het concept van de referentiecel introduceren, wat betekent dat we alle afbeeldingen kunnen gemiddeld en een enkele afbeelding verkrijgen, die echt representatief is voor hoe de cel eruit ziet in een bepaalde conditie. Vervolgens kunt u een medicijn toevoegen en opnieuw naar die referentiecel kijken en zien hoe het de morfologie of de organisatie van de cel heeft gewijzigd als reactie op dat medicijn.
Plaats twee situ twee chips afzonderlijk in twee onafhankelijke putjes van een zes-putjesplaat, zorg ervoor dat het situ twee-logo leesbaar is. De situ twee-chips die voor dit experiment worden gebruikt, hebben micropatronen gekleurd met FibroGen SI drie en moeten voor gebruik in het donker worden bewaard. Verzamel hela-cellen die ongeveer 80% confluent zijn door trypsine en controleer of ze goed geïndividualiseerd zijn onder een microscoop centrifugeer gedurende 4 minuten bij 300 G en suspendeer de cellen voorzichtig, tel ze en verdun ze tot een concentratie van 15.000 cellen per milliliter.
In onvolledig D-M-E-M-F 12 kweekmedium, 60.000 cellen per putje doseren. De plaat moet zo min mogelijk worden bewogen om te voorkomen dat er draaiende bewegingen in het medium worden geïntroduceerd, wat de neiging heeft om de cellen in het centrum te concentreren. Laat de cellen 10 minuten onder de kap sedimenteren, verplaats ze vervolgens naar de celincubator.
Binnen 10 tot 20 minuten in de celincubator zullen de cellen beginnen te hechten na 10 minuten, regelmatig controleren onder de microscoop wanneer cellen zijn gehecht. Ververs het celmedium en verwijder overtollig medium door de volgende procedure vier keer te herhalen. Houd de plaat vlak en aspireer voorzichtig het medium vanaf de zijkant van de put.
Zorg ervoor dat u voldoende medium bewaart om te voorkomen dat de chip uitdroogt. Voeg vier milliliter PBS toe en aspireer beginnend vanaf het centrum van de chip. Beweeg dan naar de zijkant van de put om het meeste PBS te aspireren zoals eerder, controleer onder de microscoop op zwevende cellen.
Als er nog een grote hoeveelheid zwevende cellen aanwezig is, herhaal de wasprocedure. Als er zeer weinig cellen aanwezig zijn, aspireer een deel van de PBS en vervang het door twee milliliter vers medium, aspireer en voeg vervolgens vier milliliter vers medium toe. Incubeer de cellen gedurende drie uur in een celincubator om de cellen volledig te laten spreiden.
Met deze methode zal tussen de 10 en 30%van de micropatronen worden bezet door een enkele cel, terwijl andere patronen leeg of bezet zullen zijn door meerdere cellen. Om de cellen te behandelen met BLEs-statin verdun de 17 millimolaire drugstofoplossing tot een eindconcentratie van vijf micromolair met 0,1%DMSO in vier milliliter medium. Voor de controle bereid medium met alleen 0,1%DMSO aan, aspireer het celmedium en vervang he
Overzicht
Deze studie toont aan hoe adhesieve micropatronen de cellulaire architectuur kunnen normaliseren, waardoor de detectie van geneesmiddeleffecten wordt verbeterd en de reproduceerbaarheid bij geautomatiseerde beeldanalyse wordt verbeterd. De technologie is bijzonder voordelig voor geneesmiddel- en siRNA-screeningstesten, waarbij de cel-tot-cel-variabiliteit wordt aangepakt.
Belangrijkste studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Celbiologie
- Geneesmiddelscreening
- Beeldanalyse
Achtergrond
- Conventionele celkweekmethoden leiden vaak tot overmatige variabiliteit.
- Adhesieve micropatronen bieden ruimtelijke informatie aan cellen, waardoor hun architectuur wordt genormaliseerd.
- Verbeterde consistentie in celmorfologie helpt bij de kwantificering van geneesmiddeleffecten.
- Automatisering van beeldacquisitie wordt vergemakkelijkt door de uniformiteit van celpositionering.
Doel van het onderzoek
- Om het gebruik van adhesieve micropatronen voor celanalyse te illustreren.
- Om de kwantificering van geneesmiddeleffecten op cellen met genormaliseerde architectuur aan te tonen.
- Om de voordelen van micropatronen ten opzichte van traditionele kweekmethoden te benadrukken.
Gebruikte methoden
- Kweek van Hela-cellen op specifieke adhesieve micropatronen.
- Incubatie van cellen met geneesmiddelen en visualisering van het cytoskelet.
- Gebruik van macros voor beeldverwerking en -analyse.
- Vergelijking van geneesmiddeleffecten op microgepatroneerde cellen versus standaard kweekcondities.
Belangrijkste resultaten
- Significante geneesmiddeleffecten werden gedetecteerd bij lage doses met behulp van micropatronen.
- Cellen vertoonden consistente morfologie en organisatie over patronen heen.
- Automatisering van beeldacquisitie werd vereenvoudigd door de uniforme celrangschikking.
- Resultaten waren niet detecteerbaar onder standaard kweekcondities.
Conclusies
- Adhesieve micropatronen verbeteren de betrouwbaarheid van geneesmiddelscreeningstesten.
- Normalisatie van celarchitectuur verbetert de kwantificering van geneesmiddeleffecten.
- Deze methode lost variabiliteitsproblemen op die inherent zijn aan traditionele celkweek.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Micropatterned cell systems address a critical bottleneck in high-content analysis by reducing cell-to-cell variability that obscures subtle drug effects. This normalization enables detection of low-dose compound impacts that are undetectable in conventional culture, improving assay sensitivity and reproducibility. The approach supports early-stage target validation and lead identification by providing quantitative, architecture-controlled readouts for cytoskeletal and phenotypic screening.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through standardized cellular architecture that reduces noise in phenotypic readouts.
- Operational Value: Supports functional target validation by providing reproducible organization of cytoskeletal elements like actin stress fibers.
- Predictive Value: Increases confidence in target engagement signals by allowing detection of subtle cytoskeletal changes at low drug doses.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Facilitates preparation of validated biological systems with uniform morphology for downstream compound screening.
- Operational Value: Enhances assay standardization and reproducibility through consistent cell positioning and internal polarity across micropatterns.
- Scalability: Enables reliable compound evaluation by reducing the number of cells needed for statistically significant results via reference cell analysis.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports disease-relevant systems by maintaining normalized architecture that mirrors in vivo spatial constraints from extracellular matrix and cell-cell interactions.
- Mechanistic De-risking: Allows quantitative assessment of drug effects on intracellular architecture, reducing ambiguity in mechanism of action.
- Preclinical Model Alignment: Provides a bridge from discovery to preclinical work by generating quantitative, morphology-based phenotypes predictive of cellular response.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early biology through lead identification, where normalized cellular systems improve the reliability of phenotypic screening and mechanistic follow-up.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling consistent visualization of cytoskeletal reorganization in response to perturbation.
- Screening: Delivers assay readiness through automated image acquisition and processing enabled by uniform cell positioning on micropatterns.
- Analytics: Provides quantitative outputs such as hypotenuse-based membrane collapse measurements that allow sensitive comparison of drug-treated versus control conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by generating reproducible phenotypes that align with biomarker-aligned pathway modulation.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform technology rather than a single-use technique, adaptable across multiple targets and screening campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through standardized cellular architecture.
- Operational Value: Improves reproducibility and scalability via automated acquisition and reference cell generation from tens of cells rather than thousands.
- Strategic Value: Enhances go/no-go decisions by enabling detection of low-dose drug effects, reducing false negatives in early screening.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing quantitative, architecture-normalized data for lead compound triage.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, micropattern handling, and fluorescence microscopy for proper cell seeding and pattern visualization.
- Depends on instrumentation capable of automated multi-wavelength image acquisition and software supporting custom macro-based processing (e.g., ImageJ).
- Necessitates cross-team standardization of micropattern selection, staining protocols, and analysis thresholds to ensure reproducibility across users and sites.
- Involves adaptation considerations when extending to different cell types or pattern geometries beyond L-shaped actin-fiber-inducing designs.
- Includes practical limitations such as the need for optimized cell density to achieve single-cell pattern occupancy and avoid multiplet or empty patterns.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:10
Introduction
3:52
Cell Preparation and Seeding on Micropatterns
6:14
Blebbistatin Treatment, Cell fixation and Immunofluorescent Staining
8:58
Microscope Setup and Automated Image Acquisition
11:02
Automated Image Processing and Analysis
13:40
Representative Micropattern Imaging Results
14:47
Conclusion
