Name: Verbeterde visualisatie en kwantitatieve analyse van de Drug effecten met behulp van micropatterned cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-02T18:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 41 s
Description: Leer hoe kleefmicropatronen de celarchitectuur normaliseren voor verbeterde detectie van geneesmiddelwerking bij HeLa-cellen. Deze methode vermindert variabiliteit en maakt gevoelige kwantificatie mogelijk die met standaardkweekmethoden onhaalbaar is.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

1. Cel Voorbereiding en zaaien op Micropatterns <ol><li> Plaats twee CYTOOchips in 2 onafhankelijke bronnen van een 6 wells plaat ervoor te zorgen dat je "CYTOO" in de rechter hoek van het CYTOOchip te lezen. Micropatterns kan fluorescent gelabeld worden met Cy3 of Cy5 kleurstoffen. CYTOOChips gebruikt voor dit experiment hebben Cy3 fluorescent gelabelde micropatterns. LET OP: Houd chips in het donker. </li><li> Verzamel HeLa cellen (~ 80% confluent) door behandeling met trypsine. Kijk onder een microscoop die cellen goed zijn verspreid door de trypsine behandeling. Verzamelen en centrifugeer cellen op 300g voor 4 min, dan voorzichtig resuspendeer de cel pellet. Tellen cellen en verdunnen tot een concentratie van 15.000 cellen / ml in voltooide DMEM/F12 cultuur media. </li><li> Verdeel 4 mL (60.000 cellen) in elk putje met een CYTOOchip. LET OP: De plaat moet worden verplaatst zo weinig mogelijk om te voorkomen dat het induceren van een roterende bewegingen in het medium, omdat dit zal de neiging hebben om cellen te concentreren in het centrum. </li><li> Laat de cellen sediment gedurende 10 minuten onder de motorkap ze vervolgens te verplaatsen naar de cel incubator. Na 10-20 min, zal cellen beginnen zich te houden aan de micropatterns. Na 10 min, regelmatig onder de microscoop. </li><li> Zodra cellen hebben aangesloten, veranderen de cel medium en zacht spoel de dekglaasje oppervlak met behulp van de volgende procedure: </li><li> Het houden van de plaat vlak, Zuig voorzichtig het medium met een pipet uit de zijkant van de put. LET OP: Laat nooit de chip uitdrogen, betekent dit nooit meer af te zuigen al het vocht maar laat genoeg om de CYTOOchip te allen tijde te dekken. </li><li> Voeg 4 ml PBS en zuig eerst weer vanaf het midden van de chip dan verder te gaan naar de zijkant van de put. Aspireren uit de PBS zoals beschreven zonder het blootstellen van de chip aan de lucht. Herhaal dit 3-4 keer. </li><li> Controleer onder de microscoop voor drijvende cellen: <ul><li> Als een groot aantal drijvende cellen blijven, herhaal dan het wassen. </li><li> Als je ziet heel weinig cellen, aspiratie een deel van de PBS en vervang deze door 2 ml vers medium. Aspireren en twee keer toe te voegen 4 ml vers medium. </li></ul></li><li> Plaats de plaat in een weefselkweek incubator bij 37 ° C met 5% CO 2 voor een minimum van drie uur om het volledige cellen verspreiden bereiken. LET OP: Met deze methode tussen de 10-30% (2000 tot 6,500) micropatterns zal worden bezet door een enkele of meerdere cellen. LET OP: De tijd die nodig is voor de cellen om zich te houden voor het wassen stap en de tijd die nodig is voor de volledige verspreiding van cellen op micropatterns zal specifiek zijn voor elke cellijn. </li></ol> 2. Blebbistatin Behandeling <ol><li> Los de blebbistatin in 100% DMSO een voorraad oplossing van 17 mM te verkrijgen. Verdun de voorraadoplossing verder naar 5 mm met 100% DMSO. Een definitieve verdunning in een kweekmedium tot een uiteindelijke concentratie van 5 uM blebbistatin te verkrijgen in 0,1% DMSO. </li><li> Voor de besturing omstandigheden voor te bereiden 4 ml medium met 0,1% DMSO alleen. </li><li> Aspireren van de media op cellen en vervang het met de 4 mL medium voorbereid voor behandelde en controle omstandigheden. </li><li> Incubeer cellen voor 1 uur bij 37 ° C. </li></ol> 3. Cel fixatie en kleuring van actine <ol><li> Bereiding van oplossingen voor cel fixatie Zie reagens sectie voor de bereiding van cytoskelet buffer (CB) en PFA 5%. CB is bijzonder aanbevolen voor fluorescentie etikettering van actine filamenten en microtubuli. <ul><li> Bereid 1xCB-sucrose: voeg 1 g sucrose aan 2 ml van de CB. Opname van sucrose helpt bij het beschermen interne celstructuren. </li><li> Bereid 4% PFA-CB-saccharose: Voeg 1 mL 1xCB-sucrose tot 4 ml warm PFA 5%. LET OP: Deze oplossing kan worden bewaard bij 4 ° C voor een paar dagen alleen. </li></ul></li><li> PFA fixatie <ul><li> Gebruik een tang op te halen de CYTOOchip op de CYTOO logo en plaats hem (zonder wassen) in een goed van een 6-wells plaat met 2 ml van 4% PFA-CB-sucrose-oplossing </li><li> Incubeer 10 min bij RT </li><li> Verwijder de PFA-CB-sucrose en was een keer met PBS </li><li> Doe een seconde wassen met 2 ml 100 mM NH 4 Cl gedurende 10 min in om resterende PFA verknoping activiteit lessen LET OP: PFA vast dia's kunnen worden opgeslagen in PBS gedurende enkele dagen bij 4 ° C voor organel kleuring voor fluorescerende beeldvorming. </li></ul></li><li> Permeabilisatie van de celmembraan met Triton X-100 Permeabilisatie van cellen met wasmiddel mogelijk maakt antilichamen of andere sondes te dringen in de celmembraan en elimineert een aantal van de cytosolische pool van cytoskelet eiwitten die anders kan het contrast van het cytoskelet polymeren waardoor het moeilijk is om hun lokalisatie analyseren. <ul><li> Verwijder NH 4 Cl en voeg 2 ml / putje van 0,1% Triton X-100-CB voor 3 min bij RT </li><li> Was tweemaal met 2 ml PBS </li></ul></li><li> Actin vlekken TL-phalloidin die bindt aan actine inheemse alleen wordt gebruikt om actine FilaMen vlekts. <ul><li> Voeg 2 mL van FITC-geconjugeerd phalloidin verdund 1:2000 in PBS met 1,5% BSA </li><li> Incubeer 1 uur bij RT </li><li> Was eenmaal met 2 ml PBS </li></ul></li><li> Kernen vlekken <ul><li> Voeg 2 mL van Hoechst (vlek met 1μg / ml in PBS) </li><li> Incubeer 3 min bij RT </li><li> Was twee keer met 2 ml PBS </li></ul></li><li> Montage van de schuif <ul><li> Pak de CYTOOchips op de CYTOO logo en monteren CYTOOchip op een standaard microscoop dia 25-30 ul van Mowiol of een andere montage oplossing. </li></ul></li></ol> 4. Microscoop Setup en geautomatiseerde Image Acquisition Tal van imaging-software pakketten bestaan ​​die de controle van de microscoop voor een snelle geautomatiseerde beeldacquisitie en weer te geven. In dit voorbeeld wordt Metamorph imaging-software en automatische acquisities worden uitgevoerd op een Nikon Eclipse Ti microscoop uitgerust met een CCD Hamamatsu-camera en een Intensilight kwik-fiber verlichting. Beelden worden verkregen tegen een vergroting van 20x in drie golflengtes die overeenkomen met DAPI (kernen), Cy-3 (micropatterns) en FITC-Phalloidin (actine). Het aantal micropatterns gevisualiseerd per gebied zal variëren afhankelijk van de camera en objectief setups. CYTOO micropatterns zijn geplaatst op vaste intervallen van elkaar (100 of 130 micrometer) over de chip zeer faciliteren overname. <ol><li> Selecteer vergroting van 20x </li><li> Open Multidimensional Acquisition (in de menubalk: Apps / Multidimensional Acquisition) en het opzetten van de verschillende parameters van het experiment: <ul><li> Aantal golflengten: 3 </li><li> Golflengte types: DAPI, FITC, Cy3 </li><li> Stel belichtingstijd voor elke golflengte door eerst richten op een veld van cellen </li><li> Autofocus kan worden uitgevoerd op elke golflengte </li><li> Selecteren waar u gegevens op te slaan </li></ul></li><li> Selecteer Cy3 golflengte en de positie van de camera, zodat 12 micropatterns worden gevisualiseerd en in het midden van de camera gebied (4 kolommen en 3 rijen van patronen). </li><li> Maak een tijdschrift draait Multidimensionele Acquisition. De procedure voor het maken van een tijdschrift is beschreven in figuur 1. </li><li> Open Scan stadium functie (in de menubalk: Apparaten / Stage / Stage Scan). Het verwerven van 24 beelden die elk 12 micropatterns bij 20x vergroting, voer zes kolommen en vier rijen met -400 um X stapgrootte en 300 micrometer Y stapgrootte. In Set Journal uit te voeren, te uploaden het tijdschrift MDA.JNL. Druk vervolgens op Scannen naar de geautomatiseerde verwerving van het hele blok in de drie golflengten te starten. OPMERKING: De X-en Y-stap maten hier aangegeven is afhankelijk van het aantal micropatterns aanwezig is in een camera veld. Afhankelijk van uw podium op, richting X en / of Y kan verlangen negatieve waarden voor beweging in de juiste richting. </li></ol> 5. Geautomatiseerde Image Processing and Analysis Veel beeldverwerking en analyse software pakketten bestaan. De procedures die hieronder worden beschreven overzicht beeldverwerking en analyse stappen uitgevoerd door twee op maat gemaakte macro's geschreven voor het open source programma ImageJ. De eerste macro CellRef creëert een Reference Cell, de tweede schuine zijde maatregelen stijfheid / ineenstorting van de celmembraan. Beide zijn beschikbaar op aanvraag bij <a href="http://www.cytoo.com">www.cytoo.com</a> . <ol><li> Maak image stacks voor alle drie de kanalen gericht op micropatterns (macro CellRef). Het gebruik van micropatterns vermijdt cel clustering en klonteren, sterk vereenvoudigen van de eerste stap in geautomatiseerde beeldverwerking, die is lokalisatie en segmentatie van de individuele cellen. De fluorescent gelabelde micropattern beelden worden gebruikt voor het definiëren en af ​​te bakenen's die zijn gericht op het micropatterns. Deze regio's worden dan omgezet naar de beelden die in de andere kanalen en bijgesneden. Overeenkomstige bijgesneden beelden worden vervolgens geassembleerd in stapels voor elke golflengte. Een RGB-stack is ook ontstaan ​​uit de fusie van de drie kanalen (figuur 2). </li><li> Van toepassing zijn enkele cel selectie filter (macro CellRef) Zoals hierboven aangegeven, zijn 10-30% (2000-6,500) van de micropatterns bezet door een enkele cel of meerdere cellen, terwijl de overige micropatterns zijn leeg. Te selecteren beelden die micropatterns bezet door slechts een enkele cel show, de macro detecteert het aantal kernen per beeld en elimineert uit alle stapels (RGB en verschillende golflengten) die met meer dan een kern of geen kernen (figuur 3). </li><li> Elimineer niet-genormaliseerde en cellen die niet volledig worden uitgestrekt over de micropattern met behulp van cel-gebied cut-off filter (macro CellRef) Voor het verwijderen van delende cellen die zou zijn ontsnapt aan de kernen filter, een ander filter het gebruik van de FITC kanaal voor actine wordt toegepast. Cel wordt berekend en die onder een bepaalde cut off (cel gebieden ongeveer twee keer minder dan de interfase cellen gebied) worden verwijderd uit alle stapels. De cel envelop gebied wordt bepaald door de grootte van het patroon. </li><li> Lijn cel beelden (macro CellRef) Uit de vorige stappen, afbeeldingen met een micropatterned cellen werden geselecteerd. Hoewel deze beelden zijn gericht op micropatterns, ze zijn nooit allemaal perfect op elkaar afgestemd. Ter afsluiting van het Beeldbewerking, een ImageJ plugin (MultiStackReg) wordt toegepast op alle verzamelde foto's en alle kanalen op basis van de micropattern positie uitlijnen. Deze stap genereert uitgelijnd stapels van de afzonderlijke beelden die nu gebruikt kunnen worden voor single cell analyse of het creëren van een Reference Cell (figuur 4) </li><li> Het bouwen van een Reference Cell (macro CellRef) Groeiende cellen op micropatterns betekent dat alle cellen dezelfde vormen hebben. Deze normalisatie maakt een nauwkeurige afstemming en overlay van veel mobiele beelden. Samenvattend het signaal in elk beeld over het hele stack kunt een te visualiseren en te meten een "gemiddelde drug effect". De uiteindelijke totale beeld of Reference Cell is een uniek en nuttig instrument voor representatie-en beeldanalyse en kan alleen worden verkregen met micropatterned cellen (figuur 4). In ImageJ, de Reference Cell is opgebouwd door het maken van een projectie van de gefilterde en uitgelijnd beelden van een stack (Afbeelding&gt; Stacks&gt; Z-project). Verschillende projectie methodes kunnen worden toegepast, zoals de gemiddelde of maximale intensiteit, maar meestal een mediaan projectie is gekozen die elimineert de belangrijkste uitschieters van het beeld stack. Ter bevordering van onderzoek van de resultaten, is een LUT (Look Up Tables) het omzetten van de Monocolor afbeelding in een kleur-gecodeerde frequentie map toegepast. </li><li> Meten en kwantificeren van parameters die van belang (macro hypotenusa) In deze video artikel zijn L-micropatterns gebruikt, omdat de vorm organiseert het actine cytoskelet in een grote stress-vezel. Door te wijzen actine op deze manier, kan blebbistatin impact op het cytoskelet bepaald worden op vele manieren: meten van veranderingen in de kromming van het actine stress-vezel, kleuringsintensiteit, lengte of de dikte van de stress vezel, veranderingen in de morfometrische kenmerken van de actine filamenten of celvorm enz. Deze parameters kunnen worden gemeten, hetzij op individuele cel beelden of op de laatste Reference cel zelf. Hier was de impact van de 5 uM blebbistatin gekenmerkt door het tellen van het aantal ingestorte cellen met behulp van een seconde ImageJ macro met de naam schuine zijde (figuur 7). Kortom, zijn thresholded beelden van de L-micropattern gebruikt om een ​​theoretische schuine zijde van de cel driehoek vorm te geven. Vervolgens wordt drempeling van het actine-lood afbeeldingen uitgevoerd om te benaderen werkelijke celvorm. Het gebied tussen de theoretische schuine zijde van de cel driehoek en de werkelijke concave celmembraan wordt dan gemeten. Wanneer de cel is ingestort, een gebied onder de theoretische hypotenusa verschijnt. Het percentage van de ingestorte cellen wordt gebruikt om de controle te vergelijken en behandeld omstandigheden. </li></ol> 6. Representatieve resultaten Voorbeelden van wat cellen moet onmiddellijk zien op micropatterns en enkele uren na de kritische wasstappen beschreven in 1.6-1.8, zijn weergegeven in figuur 5. Na 15 min op CYTOOchips, zijn rond Hela-cellen waargenomen op gelijke afstanden waaruit blijkt dat zij gehandeld op grond van de fibronectine micropatterns (figuur 5a). Hechting is voltooid wanneer de cellen blijven geïmmobiliseerd ondanks zachtjes schudden van de cultuur schip. Om het aantal micropatterns bezet door meerdere cellen, zijn chips vervolgens gespoeld met PBS tot cellen zweven boven de cytophobic gebieden te verwijderen. Na een aantal uren, zal cellen die volledig zijn uitgerekt over de micropatterns lijken op die in figuur 5b. Typische single cell beelden verkregen na incubatie van cellen met blebbistatin, fixatie en kleuring van actine en kernen zijn weergegeven in Figuur 6. Na de automatische overname van meerdere beelden en beeldverwerking met behulp van de ImageJ CellRef macro, is een kleur-gecodeerde frequentie map gegenereerd die geeft de intensiteit van de actine gemiddeld over alle mobiele beelden (Figuur 6c en 6f). De vergelijking van de Reference Cel voor niet behandelde en behandeld omstandigheden toont het potentieel van deze benadering voor een eenvoudige observatie van het fenotype bestudeerd en is met name handig voor het verkennen van cellulaire effecten van geneesmiddelen. Een voorbeeld van een mogelijke analyse van het effect van blebbistatin op cellen is weergegeven in figuur 7. Het aantal van ingestorte cellen (dwz cellen met een leeg gebied uit hoofde van de theoretische hypotenusa) waargenomen in 50 controle-cellen en 50 cellen behandeld met 5 uM blebbistatin zoals gedetecteerd door de schuine zijde ImageJ macro wordt weergegeven. Het toegenomen aantal ingestort cellen in de blebbistatin behandelde populatie weerspiegelt ontspanning van de stress-vezels en dus spanning op het membraan te wijten aan blebbistatin remming van actinomyosin contractiele krachten binnen de cel. <img src="/files/ftp_upload/2514/2514fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Procedure voor een nieuw tijdschrift maken met Metamorph. <img src="/files/ftp_upload/2514/2514fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur2. Stroomdiagram van de automatische beeldverwerking procedure. <img src="/files/ftp_upload/2514/2514fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Filteren uit enkele cellen. <img src="/files/ftp_upload/2514/2514fig4.jpg" alt="Figuur 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4. Opbouwen van een Reference Cell. <img src="/files/ftp_upload/2514/2514fig5.jpg" alt="Figuur 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 5"> Figuur 5. Cell zaaien. A) Hela cellen gehandeld op grond van micropatterns na het spoelen stap (4x vergroting) B) HeLa-cellen na de volledige verspreiding op L micropatterns (10x vergroting). <img src="/files/ftp_upload/2514/2514fig6.jpg" alt="Figuur 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 6"> Figuur 6. Vergelijking van nonpatterned en micropatterned cellen in de controle en drugs behandeld omstandigheden. HeLa cellen werden gezaaid voor 3 uur en behandeld met 5 uM blebbistatin gedurende 1 uur (onderste paneel) of onbehandeld (bovenste paneel). In controle nonpatterned cellen (een), actine assembleert in meerdere vezels, die ongemerkt uit elkaar te halen bij de behandeling met 5 uM blebbistatin (d). Op L-micropatterns, controle cellen een driehoekige vorm (b) te nemen en het ontwikkelen van een grote actine vezel (stress fiber) tussen de twee toppen van de L. In vergelijking met nonpatterned cellen (d), blebbistatin induceert een grote fenotypische verandering op L-micropatterned cellen (e). Directe visualisatie van de effecten van geneesmiddelen en de vergelijking van controle en behandelde voorwaarden kunnen snel worden gevisualiseerd met de Reference Cell presentatie opgebouwd uit 20 cellen. Net als bij individuele cellen, een duidelijke en intense spanning vezels aanwezig is op de controle-Reference Cell (c), terwijl blebbistatin behandelde cellen instorten en de grote stress-vezel verdwijnt (f). <img src="/files/ftp_upload/2514/2514fig7.jpg" alt="Figuur 7" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 7"> Figuur 7. Voorbeeld van een analyse van de effecten van de blebbistatin op cellen met behulp van de macro hypotenusa. Terwijl 25% van de controle cellen waren ingestort, deze steeg met 3 voudig tot 75% in de 5 uM blebbistatin behandelde cellen als gevolg van de verzwakte actinomyosin contractiele netwerk (n = 50 cellen).

<ol><li>Thery, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix+guides+the+orientation+of+the+cell+division+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix guides the orientation of the cell division axis.</a> Nat Cell Biol. 7, 947-953 (2005).</li>
<li>Thery, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anisotropy+of+cell+adhesive+microenvironment+governs+cell+internal+organization+and+orientation+of+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Anisotropy of cell adhesive microenvironment governs cell internal organization and orientation of polarity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 19771-19776 (2006).</li>
<li>Schauer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probabilistic+density+maps+to+study+global+endomembrane+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Probabilistic density maps to study global endomembrane organization.</a> Nat Methods. , (2010).</li>
<li>Bischofs, I. B., Klein, F., Lehnert, D., Bastmeyer, M., Schwarz, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filamentous+network+mechanics+and+active+contractility+determine+cell+and+tissue+shape%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Filamentous network mechanics and active contractility determine cell and tissue shape.</a> Biophys J. 95, 3488-3496 (2008).</li>
<li>Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometric+control+of+cell+life+and+death%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Geometric control of cell life and death.</a> Science. 276, 1425-1428 (1997).</li>
<li>Dupin, I., Camand, E., Etienne-Manneville, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classical+cadherins+control+nucleus+and+centrosome+position+and+cell+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Classical cadherins control nucleus and centrosome position and cell polarity.</a> J Cell Biol. 185, 779-786 (2009).</li>
<li>Gomez, E. W., Chen, Q. K., Gjorevski, N., Nelson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+geometry+patterns+epithelial-mesenchymal+transition+via+intercellular+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Tissue geometry patterns epithelial-mesenchymal transition via intercellular mechanotransduction.</a> J Cell Biochem. 110, 44-51 (2010).</li>
<li>Kilian, K. A., Bugarija, B., Lahn, B. T., Mrksich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometric+cues+for+directing+the+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Geometric cues for directing the differentiation of mesenchymal stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 4872-4877 (2010).</li>
<li>Kwon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+to+suppress+multipolar+divisions+in+cancer+cells+with+extra+centrosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Mechanisms to suppress multipolar divisions in cancer cells with extra centrosomes.</a> Genes Dev. 22, 2189-2203 (2008).</li>
<li>Nelson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergent+patterns+of+growth+controlled+by+multicellular+form+and+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Emergent patterns of growth controlled by multicellular form and mechanics.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 11594-11599 (2005).</li>
<li>Pouthas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+migrating+cells%2C+the+Golgi+complex+and+the+position+of+the+centrosome+depend+on+geometrical+constraints+of+the+substratum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">In migrating cells, the Golgi complex and the position of the centrosome depend on geometrical constraints of the substratum.</a> J Cell Sci. 121, 2406-2414 (2008).</li>
<li>Thery, M., Jimenez-Dalmaroni, A., Racine, V., Bornens, M., Julicher, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+and+theoretical+study+of+mitotic+spindle+orientation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Experimental and theoretical study of mitotic spindle orientation.</a> Nature. 447, 493-496 (2007).</li>
<li>Thery, M., Pepin, A., Dressaire, E., Chen, Y., Bornens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+distribution+of+stress+fibres+in+response+to+the+geometry+of+the+adhesive+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Cell distribution of stress fibres in response to the geometry of the adhesive environment.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 63, 341-355 (2006).</li>
</ol>

Alle auteurs, behalve Anne Beghin zijn werknemers van CYTOO SA, die reagentia en instrumenten die in dit artikel wordt veroorzaakt.

Keuze van micropattern Terwijl de effecten van de 5 uM blebbistatin zijn nauwelijks waarneembaar op standaard cultuur ondersteunt, efficiënt kwantificering is mogelijk bij het micropatterns die actine te concentreren in een enkele grote stress-vezel. Dit verbetert visualisatie van het actine cytoskelet bijdraagt ​​tot een nauwkeurige kwantificering van blebbistatin effecten op de cel. De keuze van micropattern vorm is van cruciaal belang in het ontwerp van de test en is ontworpen volgens de fenotypische verandering te worden benadrukt in de studie. Conclusies Micropatterns vergemakkelijken de visualisatie en kwantificering van effecten van geneesmiddelen, vooral bij lage concentraties. De vervanging van de homogene vlakke ondergronden met lijm micropatterns voor cel-gebaseerde testen verbetert de nauwkeurigheid, gevoeligheid en kwaliteit van de geproduceerde gegevens. Bijgevolg zijn er minder cellen die nodig zijn voor analyse om te komen tot robuuste statistische resultaten 3. Adhesive micropatterns biedt een echte kans voor het verbeteren van functionele studies en het verkennen van fenotypische veranderingen bij lagere concentraties van geneesmiddelen om te voorkomen dat toxische of indirecte effecten van geneesmiddelen. Indien er voldoende screening platforms worden gebruikt, kan micropatterns voldoen aan de eisen van de farmaceutische bedrijven voor de verbetering van gen / drug discovery programma&#39;s. Sommige extra voorbeelden van recente publicaties die micropatterns hebben benut voor het analyseren en kwantificeren van cellulaire fenomeen worden genoemd onder de 3-13.

<table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td colspan="5" align="center"> Celcultuur </td></tr><tr><td colspan="2"> CYTOOchips 20x20 LM-FN </td><td> CYTOO </td><td> 10-114 </td><td> CYTOOchips zijn beschikbaar voor de adsorptie van het eiwit van uw keuze </td></tr><tr><td colspan="2"> PBS 1x </td><td> Gibco </td><td> 14040-091 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Telkamer (Kova dia) </td><td> Prolabo </td><td> 71.287,01 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> DMEM/F-12 + Glutamax-I </td><td> Gibco-Invitrogen </td><td> 25300-054 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> FBS (f tal bovine serum) </td><td> PAA </td><td> 31331-028 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Penicilline en streptomycine </td><td> PAA </td><td> A15-101 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> 6 Wells-plaat </td><td> Dutscher </td><td> 353046 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> centrifuge </td><td> Fisher Scientific </td><td> M65838 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Microscoop </td><td> Nikon </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="5" align="center"> Drugs, fixatie en immunokleuring </td></tr><tr><td colspan="2" > Cytoskelet Buffer 1X (CB) </td><td > Sigma </td><td > MES: M8250 KCl: I2636 MgCl: M2393 EGTA: E3889 </td><td > 10 mM MES pH 6,1, 138mm KCl, 3mm MgCl, 2 mM EGTA </td></tr><tr><td colspan="2" > Sucrose </td><td > Sigma </td><td > S2395 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> PFA 32% </td><td> Electron Microscopy Sciences </td><td> 15714 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> PFA 5% </td><td></td><td></td><td> Mix 10 ml PFA 32% met 54 ml CB 1.185X </td></tr><tr><td colspan="2"> Triton-X100 </td><td> Sigma </td><td> T9284 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> PBS tabletten </td><td> Gibco-Invitrogen </td><td> 18912-014 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Bovin serum albumine (BSA) </td><td> Sigma </td><td> A7806 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Phallodin-FITC </td><td> Sigma </td><td> P5282 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Hoescht </td><td> Invitrogen </td><td> H3570 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Blebbistatin </td><td> Euromedex </td><td> BN0640 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> DMSO </td><td> Sigma </td><td> D8418 </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> NH 4 Cl 0,1 M </td><td> Sigma </td><td> M11209 </td><td></td></tr><tr><td colspan="5" align="center"> Image Acquisition </td></tr><tr><td colspan="2"> Epifluorescerende microscoop </td><td> Nikon</td><td> Eclipse Ti </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> CCD Camera </td><td> TBC </td><td> TBC </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> ImageJ Software </td><td> <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

verbeterde visualisatie en kwantitatieve analyse van de drug effecten met behulp van micropatterned cellen

Improved Visualization and Quantitative Analysis of Drug Effects Using Micropatterned Cells

Tot op heden worden de meeste HCA (High Content Analysis) studies uitgevoerd met hechtende cellijnen gekweekt op een homogene substraat in weefselkweek behandelde micro-platen. Onder deze omstandigheden, cellen verspreiden en delen in alle richtingen wat resulteert in een inherente variabiliteit in de cel vorm, morfologie en gedrag. De hoge cel-cel variantie van de totale bevolking belemmert het succes van HCA, vooral voor de ontwikkeling van geneesmiddelen. Het vermogen van micropatterns aan de vorm en de interne polariteit van elke individuele cel normaliseren biedt een enorme kans voor het oplossen van dit knelpunt 1-2. Ter bevordering van toegang tot en het gebruik van de micropatterning technologie, heeft CYTOO een serie klaar om te micropatterns gebruiken, beschikbaar in dekglaasje en microwell formaten. In deze video artikel, bieden we gedetailleerde protocollen van alle procedures van de cel zaaien op CYTOOchip micropatterns, medicamenteuze behandeling, fixatie en kleuring tot geautomatiseerde acquisitie, geautomatiseerde beeldverwerking en de uiteindelijke data-analyse. Met dit voorbeeld, illustreren we hoe micropatterns kunnen cel-gebaseerde testen te vergemakkelijken. Veranderingen in de cel cytoskelet zijn moeilijk te kwantificeren in cellen gekweekt op homogene ondergronden, maar het kweken van cellen op micropatterns resulteert in een reproduceerbare organisatie van het actine meshwork als gevolg van de systematische plaatsing van de celadhesie contacten in elke cel. Een dergelijke normalisatie van de intracellulaire architectuur het mogelijk maakt kwantificering van zelfs kleine effecten op het actine cytoskelet zoals aangetoond in deze set van protocollen met behulp van blebbistatin, een remmer van het actine-myosine interactie.

Lijm micropatterns dat cellulaire architectuur normaliseren kan gebruikt worden om de gevoeligheid bij de detectie van de effecten van geneesmiddelen te verhogen, het verbeteren van de reproduceerbaarheid en vereenvoudiging van de geautomatiseerde beeldacquisitie en analyse. Deze technologie zullen profiteren drug / siRNA screeningstesten, uitgevoerd op conventionele celcultuur ondersteunt en daardoor lijden aan overmatige cel-tot-cel variabiliteit.

Verbeterde visualisatie en kwantitatieve analyse van de Drug effecten met behulp van micropatterned cellen

Tot nu toe worden de meeste HCA-studies (High Content Analysis) uitgevoerd met adherente cellijnen die zijn gekweekt op een homogeen substraat in weefselkweek-behandelde ...

Het algemene doel van de volgende procedure is om aan te tonen hoe de normalisatie van de celarchitectuur en -positie, bereikt op specifieke adhesieve micropatronen, een eenvoudige automatisering van beeldacquisitie en een ongecompliceerde beeldbewerking mogelijk maakt met een gevoelige en robuuste kwantificering van drugseffecten, wat niet haalbaar is op conventionele glazen dekglassteunen. Dit wordt bereikt door heli-cellen uit te zaaien op SI two chips die L-vormige SI three gelabelde micropatronen bevatten. De cellen nemen een driehoekige vorm aan waarbij een belangrijke stressfiber wordt gevormd die de twee uiteinden van de L overspant. De patrooncellen worden vervolgens geïncubeerd met lebos statine of onbehandeld gelaten, waarna ze gefixeerd en gekleurd worden om het actine-cytoskelet en de kernen te visualiseren.Afbeeldingen van de micropatrooncellen worden vervolgens vastgelegd en verwerkt met behulp van de cell ref-macro om een stapel afbeeldingen voor analyse te genereren, en de hypotenuse-macro om fenotypes te kwantificeren. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die een significant effect van lage doses BLEs statine op micropatroon HELOC-cellen laten zien, wat niet detecteerbaar is onder standaard kweekcondities. Hallo, welkom.We zijn hier vandaag om u door ons experimentele protocol te leiden waarin wordt uitgelegd hoe adhesieve micropatronen kunnen worden gebruikt voor celanalyse, en om u experimentele gegevens te tonen die de eenvoudige kwantificering van zeer lage doses geneesmiddelen op deze adhesieve micropatronen illustreren. Wanneer u deze micropatronen voor het eerst ziet, zult u direct begrijpen hoe ze variabiliteitsproblemen bij het vastleggen van beelden tijdens celanalyse kunnen oplossen. Door namelijk een reeks cellen te hebben, vergelijkbaar met een microarray, kunt u de microscooptafel eenvoudig van cel naar cel bewegen om beelden stapsgewijs vast te leggen.Maar dat is natuurlijk niet het enige voordeel dat micropatronen bieden. Ze zorgen voor veel meer verbeteringen, omdat we met bepaalde typische micropatronen, zoals het kruis of de Y, de interne celarchitectuur normaliseren. Dit betekent dat organellen, de mitotische spoel, het cytoskelet en verschillende eiwitnetwerken in elke cel op dezelfde locatie of in dezelfde oriëntatie bevinden, waardoor het veel eenvoudiger is om de effecten van geneesmiddelen op deze specifieke patronen te voorspellen en te kwantificeren. Dit mag wellicht contra-intuïtief overkomen vergeleken met wat gewoonlijk in een klassieke Petrischaal of microplate wordt gedaan.Nou, omdat u natuurlijk vaak ziet dat cellen rondbewegen en verschillende morfologieën aannemen. Terwijl op de adhesieve micropatronen alle cellen er hetzelfde uit zullen gaan zien, omdat ze reageren op dit adhesieve micropatroon en hun architectuur op dezelfde manier organiseren. Dit lijkt wellicht zelfs een beetje kunstmatig, maar als u er goed naar kijkt, is de Petrischaal dan niet nog kunstmatiger?Omdat cellen in weefsels worden beperkt door zowel de naburige cellen als door de extracellulaire matrix. Hierdoor ontvangen ze veel ruimtelijke informatie, die de celarchitectuur oriënteert. En dit is precies wat we doen met micropatronen.We herstellen deze ruimtelijke informatie in de cellen; alle cellen reageren hierop en organiseren zich op dezelfde manier. Omdat de cellen nu allemaal op elkaar lijken, kunnen we het concept van de referentiecel introduceren. Dit houdt in dat we alle beelden kunnen middelen om één enkel beeld te verkrijgen dat echt representatief is voor hoe de cel eruitziet onder een bepaalde conditie. Vervolgens kan er een medicijn worden toegevoegd om opnieuw naar die referentiecel te kijken en te zien hoe de morfologie of de organisatie van de cel is gewijzigd als reactie op dat medicijn.Plaats twee situ two chips afzonderlijk in twee onafhankelijke putjes van een six-well plaat, waarbij u erop let dat het situ two-logo leesbaar is. De situ two chips die voor dit experiment worden gebruikt, hebben micropatronen die zijn gekleurd met FibroGen SI three en moeten voor gebruik in het donker worden bewaard. Oogst hela-cellen die ongeveer 80% confluent zijn met trypsine en controleer onder een microscoop of ze correct zijn geïndividualiseerd. Centrifugeer gedurende vier minuten bij 300 G en resuspendeer de cellen voorzichtig. Tel en verdun de cellen tot een concentratie van 15.000 cellen per milliliter.Breng 60.000 cellen per well aan in incomple D-M-E-M-F 12 kweekmedia. De plaat moet zo min mogelijk worden bewogen om te voorkomen dat er draaibewegingen in het medium ontstaan, waardoor de cellen zich in het centrum zouden concentreren. Laat de cellen 10 minuten sedimenteren onder de laminaire flowkast en plaats ze vervolgens in de celincubator.Binnen 10 tot 20 minuten in de celincubator zullen de cellen beginnen te adhereren na 10 minuten; controleer regelmatig onder de microscoop of de cellen zijn gehecht. Vervang het celmedium en verwijder overtollige cellen door de volgende procedure vier keer te herhalen. Houd de plaat vlak en aspireer voorzichtig het medium vanaf de zijkant van de well.Zorg ervoor dat er voldoende medium aanwezig blijft om te voorkomen dat de chip uitdroogt. Voeg vier milliliter PBS toe en aspireer beginnend vanuit het centrum van de chip. Verplaats vervolgens de pipet naar de zijkant van de put om, zoals eerder gedaan, het grootste deel van de PBS te aspireren en controleer onder de microscoop op zwevende cellen.Indien er een grote hoeveelheid drijvende cellen overblijft, dient de wasprocedure te worden herhaald. Als er zeer weinig cellen aanwezig zijn, wordt een deel van de PBS afgezogen en vervangen door twee milliliters vers medium; voer deze handeling tweemaal uit door telkens vier milliliters vers medium toe te voegen. Incubeer de cellen gedurende drie uur in een celincubator om de cellen volledig te laten uitspreiden.Met deze methode zal tussen de 10 en 30% van de micropatronen bezet zijn door één enkele cel, terwijl andere patronen leeg zullen zijn of bezet door meerdere cellen. Om de cellen te behandelen met BLEs-statine, dient de 17 millimolaire stockoplossing van het geneesmiddel te worden verdund tot een uiteindelijke concentratie van vijf micromolar met 0,1% DMSO in vier milliliter medium. Bereid voor de controle medium voor met enkel 0,1% DMSO; aspireer het celmedium en vervang dit snel door de BLEs-statine- of de controlesoluties om te voorkomen dat de chip uitdroogt.Incubeer de cellen gedurende één uur bij 37 °C. Bereid tijdens deze incubatie de cytoskeletbuffer. Voeg één gram sucrose toe aan twee milliliters cb.Dit helpt om de interne celstructuren te behouden. Meng één milliliter CB-sucrose met vier milliliter 5% PFA. Voeg twee milliliter PFA in CB-sucrose-oplossing toe.In twee putjes van een nieuwe zesputjesplaat. Gebruik een pincet om de CY two chip op te pakken en plaats deze in de zesputjesplaat die twee milliliter PFA in CB-sucrose-oplossing bevat om de cellen te fixeren. Incubeer de cellen 10 minuten bij kamertemperatuur, verwijder de PFA en was de cellen eenmaal met PBS, waarna de cellen 10 minuten gewassen worden met twee milliliter 100 millimolair ammoniumchloride.Om de resterende cross-linking activiteit van PFA te stoppen, worden de cellen permeabiliseert door twee milliliter PBS met 0,1% tritton X 100 gedurende drie minuten toe te voegen, waarna ze tweemaal worden gewassen met PBS. Kleur de actinefilamenten met twee milliliter ZI-geconjugeerd phaloïne in een verdunning van 1:2000 in PBS met 1,5% BSA en incubeer dit gedurende één uur bij kamertemperatuur. Was de cellen vervolgens één keer met twee milliliter PBS. Kleur daarna de celkernen.Voeg twee milliliters van één milligram per milliliter hawked in PBS toe en incubeer drie minuten bij kamertemperatuur. Was twee keer met twee milliliters PBS. Monteer de side two chips op een standaard objectglas met behulp van 25 tot 30 microliters monteersolution, zoals al.Om beelden in drie golflengten te verkrijgen, maken we gebruik van Metamorph-beeldverwerkingssoftware en een NIK icon eclipse T-microscoop, uitgerust met een CCD Hema Matsu-camera en een intens lite kwikvezelverlichtingsbron. Selecteer eerst een vergroting van 20 x.Open vervolgens in de menubalk multidimensionale acquisitie om de verschillende parameters van het experiment in te stellen. Geef eerst aan waar de gegevens moeten worden opgeslagen.Stel het aantal golflengten in op drie, selecteer de SI-drie-golflengte en positioneer het dekglas zodanig dat 12 micropatronen gecentreerd zijn in het gezichtsveld van de camera. Het aantal gevisualiseerde micropatronen per veld zal variëren afhankelijk van de configuraties van de camera en het objectief. Stel de belichtingstijd voor elke golflengte in en voer de autofocus uit.Maak voor PS drie een journaal voor multidimensionale acquisitie aan en sla dit op als MDA jnl. Open de scanstage-functie om 24 afbeeldingen te verkrijgen, die elk 12 micropatronen bevatten. Voer zes kolommen en vier rijen in met een x-stapgrootte van -400 micron en een y-stapgrootte van 300 micron in het journaal om deze uit te voeren; upload het journaal MDA jnl en druk op 'scan' om de geautomatiseerde acquisitie van de 24 afbeeldingen in de drie golflengten te starten.In deze video worden L-micropatronen gebruikt om de vorming van één enkele grote actine-stressfiber te stimuleren die het niet-gehechte deel van de cel ondersteunt, waardoor de visualisatie en meting van de impact van BLE-statine op cellen wordt vereenvoudigd in vergelijking met cellen op vlakke fibronectine. Voor geautomatiseerde beeldbewerking en analyse beschrijven we twee op maat gemaakte macro's, geschreven voor het opensource-programma ImageJ; vanuit een stapel ruwe beelden extraheert de eerste macro individuele cellen en creëert een referentiecel. De tweede macro meet de collaps van het celmembraan.De eerste stap is de segmentatie van individuele cellen uit ruwe beelden. De fluorescentiegelabelde beelden van micro patronen worden gebruikt om regio's af te bakenen die gecentreerd zijn op de micro patronen; deze worden uit de beelden van elke golflengte geknipt en opnieuw samengevoegd tot stacks voor elke golflengte. Om micro patronen met enkelvoudige cellen te selecteren, detecteert de macro het aantal kernen per beeld en verwijdert in alle stacks die beelden die ofwel meer dan één kern of geen kernen bevatten.Ten slotte wordt de ImageJ-plugin multi-stack reg gebruikt om alle verzamelde beelden en alle kanalen opnieuw uit te lijnen op basis van de positie van het micropatroon. Deze stap genereert line stacks van individuele beelden die nu kunnen worden gebruikt voor enkelcelanalyse of voor het maken van een referentiecel. In ImageJ wordt de referentiecel geconstrueerd door een projectie te maken van de gefilterde en uitgelijnde beelden uit een stack.Verschillende projectiemethoden kunnen worden toegepast, maar gewoonlijk wordt een mediaanprojectie gekozen om uitschieters in de beeldstack te elimineren. De referentiecel is een uniek en nuttig hulpmiddel voor representatie en beeldanalyse dat alleen met micropattern-cellen kan worden verkregen. Om de analyse te vergemakkelijken, wordt een opzoektabel of LUT toegepast om het monokleurendbeeld om te zetten in een gecodeerde frequentiekaart.Om het effect van statines op de BLE's te karakteriseren, werden de stijfheid en het inklappen van de cel geanalyseerd met behulp van een tweede Image J-macro. Kort gezegd worden drempelwaardebeelden (threshold images) van het L-micropatroon gebruikt om een theoretische hypotenusa van de driehoekige celvorm te definiëren. Vervolgens wordt een drempelwaardeanalyse van de beelden met actinekleuring uitgevoerd om de celvorm te bepalen.Het verschil in oppervlakte tussen de theoretische hypotenusa en het werkelijke concave celmembraan wordt vervolgens gemeten; cellen die een oppervlakte onder de theoretische hypotenusa vertonen, worden als ingestort beschouwd. De impact van vijf micromolaire BLEs statine werd gekenmerkt door het aantal ingestorte cellen in behandelde en controlecondities te vergelijken. Typische beelden van L micropattern-cellen behandeld met BLEs statine of onbehandeld zijn getoond; de cellen waren gefixeerd en gekleurd in micropatterns.Actine en celkernen zijn respectievelijk in rood, groen en blauw weergegeven. Let op het effect van BLEs statine op de celvorm in vergelijking met de controlecondities. Hier worden representatieve cellen getoond na incubatie met BLEs statine of controles op onbehandelde fibronectine.De cellen zijn gefixeerd en gekleurd; actine en kernen zijn respectievelijk in het groen en blauw weergegeven. Let op de gelijkenis tussen de behandelde en de gecontroleerde condities. Er worden typische beelden getoond van referentiecellen verkregen uit cellen die zijn behandeld met BLEs statine of onbehandeld zijn gelaten.Let op het potentieel van deze benadering voor eenvoudige observatie van het bestudeerde fenotype. Hier is een voorbeeld van een analyse van de effecten van BLEs statine op cellen met behulp van de macro-hypotenusa. Terwijl 25% van de controlecellen was ingeklapt, nam dit drievoudig toe tot 75% in de cellen die behandeld waren met vijf micromolar BLEs statine, wat wijst op het verzwakte actinine contractiele netwerk.Na het bekijken hiervan zou u nu een goed begrip moeten hebben van hoe adhesieve micropatronen verschillende knelpunten in high-content analyse oplossen. Ten eerste heeft het gebruik van adhesieve micropatronen de analyse van de beeldvastleggingsverwerking veel eenvoudiger gemaakt. Ten tweede maken micropatronen de detectie van zeer subtiele effecten van geneesmiddelen bij zeer lage doses mogelijk, omdat u de variabiliteit tussen cellen vermindert door hun morfologie en hun gedrag te normaliseren.En tot slot: in vergelijking met de duizenden cellen die gewoonlijk nodig zijn om een goed resultaat te behalen bij celanalyse, heeft u met onze referentiecel slechts enkele tientallen cellen nodig om een robuust en significant resultaat te verkrijgen.

improved-visualization-quantitative-analysis-drug-effects-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Demonstreren we een eenvoudige methode voor het plaatsen van cellen op de gewenste locaties op een substraat. Deze methode patronen cellen door het opgooien van een siliconen chip met microwells gevuld met cellen op de ondergrond. Deze methode biedt een nieuwe manier te moduleren diffundeerbare en juxtacrine signalering tussen cellen.

Patroonvorming van embryonale stamcellen Met behulp van de Bio Flip Chip

Waterige tweefasensysteem systemen werden gebruikt om gelijktijdig meerdere patroon populaties van cellen. Deze snelle en gemakkelijke methode voor patroonvorming cel maakt gebruik van de fasenscheiding van waterige oplossingen van dextran en polyethyleenglycol en de grensvlakspanning die tussen de twee polymeeroplossingen.

Cell Co-cultuur Patterning gebruiken waterige tweefasensysteem Systems

Deze 3D microfluïdische printtechnologie drukt arrays van cellen op ondergedompelde oppervlakken af.  We beschrijven hoe arrays van cellen microfluïdisch in 3D-stroomcellen op ondergedompelde oppervlakken worden afgeleverd.  Door op ondergedompelde oppervlakken te printen, werden celmicroarrays geproduceerd die geneesmiddelscreening en cytotoxiciteitsbeoordeling mogelijk maken op een veelvoud van gebieden.

De Ondergedoken afdrukken van cellen op een gemodificeerde oppervlak met behulp van een continue stroom Microspotter

We beschrijven een methode om apparaten te construeren voor 3D-cultuur en experimenten met cellen en multicellulaire organoids. Dit apparaat maakt analyse van cellulaire reacties op oplosbare signalen in 3D-micromilieus met gedefinieerde chemoattractant gradiënten. Organoids zijn beter dan enkele cellen bij de opsporing van zwakke luidruchtige ingangen.

3D-analyse van multi-cellulaire reacties op chemoattractant gradiënten

De hier gepresenteerde methode maakt gebruik van micropatterning samen met kwantitatieve beeldvorming om de ruimtelijke ordening binnen de zoogdier culturen te onthullen. De techniek is gemakkelijk vast te stellen in een standaard laboratorium voor celbiologie en biedt een Tractable systeem om patronen in vitro te bestuderen.

De opkomende ruimtelijke ordening van zoogdiercellen in kaart brengen met behulp van micro patronen en kwantitatieve beeldvorming

We presenteren een microfluïdische Cancer-on-chip-model, de "Evolution Accelerator"-technologie, die een controleerbaar platform biedt voor langdurige realtime kwantitatieve studies van kanker dynamiek binnen goed gedefinieerde omgevingscondities op de eencellige Niveau. Deze technologie wordt verwacht te werken als een in vitro model voor fundamenteel onderzoek of pre-klinische ontwikkeling van de drug.

Generatie van heterogene drugs gradiënten over kanker populaties op een Microfluïdische evolution Accelerator voor real-time observatie

Deze methodologie heeft tot doel de mechanismen te illustreren waarmee extracellulaire matrixsignalen zoals substraatstijfheid, eiwitsamenstelling en celmorfologie het fenotype van Schwann-cel (SC) reguleren.

Voorbereiding van Tunable Extracellular Matrix Microenvironments om Schwann Cell Phenotype Specification te evalueren

We presenteren een technologie die capillariteitsondersteunde assemblage in een microfluïdisch platform gebruikt om microgrote objecten die in een vloeistof zijn gesuspendeerd, zoals bacteriën en colloïden, te modelleren in voorgeschreven arrays op een polydimethylsiloxaansubstraat.

Patroonvorming van micro-organismen en microdeeltjes door sequentiële capillariteitsondersteunde assemblage

Dit werk presenteert een flexibel protocol voor het gebruik van fluorescerend gelabelde elastomeer contracteerbare oppervlakken (FLECS) -technologie in microwell-formaat voor vereenvoudigde, hands-off kwantificering van contractiele krachten met één cel op basis van gevisualiseerde verplaatsingen van fluorescerende eiwitmicropatronen.

Vereenvoudigde, high-throughput analyse van eencellige contractiliteit met behulp van microgepatterde elastomeren

We beschrijven verbeteringen aan een standaardmethode voor het meten van cellulaire tractiekrachten, gebaseerd op microcontactprinten met een enkele subtractieve patroonstap van puntarrays van extracellulaire matrixeiwitten op zachte hydrogels. Deze methode zorgt voor een eenvoudigere en consistentere fabricage van eilandpatronen, essentieel voor het regelen van de vorm van de celcluster.

Patroongeneratie voor micropatterntractiemicroscopie

Traditioneel wordt celkweek uitgevoerd op vlakke substraten die de natuurlijke omgeving van cellen in vivo slecht nabootsen. Hier beschrijven we een methode om celkweeksubstraten te produceren met fysiologisch relevante gebogen geometrieën en micropatterned extracellulaire eiwitten, waardoor systematisch onderzoek naar cellulaire detectie van deze extracellulaire signalen mogelijk is.

Generatie van multicue cellulaire micro-omgevingen door UV-fotopatterning van driedimensionale celcultuursubstraten

Leer hoe kleefmicropatronen de celarchitectuur normaliseren voor verbeterde detectie van geneesmiddelwerking bij HeLa-cellen. Deze methode vermindert variabiliteit en maakt gevoelige kwantificatie mogelijk die met standaardkweekmethoden onhaalbaar is.

Verbeterde visualisatie en kwantitatieve analyse van de Drug effecten met behulp van micropatterned cellen

Meer video's verkennen