Name: Live-beeldvorming van PKC Translocatie in Sf9 cellen en in Aplysia sensorische neuronen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-06T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: Leer live-beeldvorming van PKC-translocatie in Sf9-cellen en Aplysia-sensorische neuronen met fluorescent gelabelde PKC's. Deze methode toont differentiële regulatie van PKC-isoformen door tweede boodschappers in real-time.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de Canadese Institutes of Health Research (CIHR) Grant aan Wayne S. Sossin. Carole A. Farah is de ontvanger van een postdoctorale beurs van het Fonds de la Recherche en Sante du Quebec (FRSQ) en een Conrad Harrington fellowship. De auteurs willen graag met Joanna Bougie, Margaret Hastings en Margaret Labban bedanken voor hun hulp met de video te schieten en Madeline Richmond Pool voor hulp bij het grafisch overzicht.

1. Voorbereiding en onderhoud van Sf9 Cell monolaagculturen <ol><li> Sf9 celcultuur en het onderhoud wordt uitgevoerd in een weefselkweek kap. </li><li> Sf9-cellen zijn afgeleid van Spodoptera frugiperda ovariële cellen (Sf21 cellen) en kunnen worden gekocht als bevroren cellen in Grace&#39;s media van Invitrogen. </li><li> Plaats 8 ml van insecten medium Grace&#39;s, aangevuld met (1X), waaraan 30% foetaal bovine serum (FBS) is toegevoegd in een 75 cm 2 celkweek kolf met een gekanteld nek. </li><li> Snel Ontdooi de bevroren buis van Sf9 cellen in een 37 ° C waterbad door het bewegen van de buis heen en weer (ongeveer 1-2 minuten). </li><li> Overdracht Sf9 cellen om de 75 cm 2 celkweek kolf en rock-plaat voorzichtig met de hand gelijkmatig te verdelen de cellen. </li><li> Incubeer 1-2 uur bij 27 ° C tot cellen hebben bevestigd. </li><li> Verwijder de oude medium en te vervangen door 10 ml van insecten medium freshGrace met 30% FBS. </li><li> Incubeer bij 27 ° C totdat de cellen confluent. </li><li> Te onderhouden monolaagculturen, verwijder de oude medium van de samenvloeiing van de fles Sf9 cellen en voeg 5 ml van de insecten medium Grace&#39;s met 10% FBS. </li><li> Licht te tikken op de zijkant van de kolf meerdere keren Sf9-cellen los te maken. </li><li> Met behulp van een pipet van 10 ml en een pipet, de media pipet op en neer een keer voorzichtig, spuiten fles muur terwijl pipetteren naar beneden. Overdracht van de cellen in een steriele 15 ml polystyreen buis. </li><li> Voeg 2 mL van Sf9 celsuspensie tot 8 ml van insecten medium Grace&#39;s met 10% FBS (1:5 verdunning om in te loggen fase groei te handhaven) in het nieuwe 75 cm 2 celkweek kolf en rock-plaat voorzichtig met de hand. </li><li> Incubeer bij 27 ° C totdat de cellen confluent. </li></ol> 2. Expressie van fluorescent gelabeld PKCS in Sf9 cellen <ol><li> Voor live-imaging experiment, cultuur Sf9 cellen op 35 mm MatTek glazen bodem cultuur disheswith een glazen oppervlak van 14 mm en een dekglaasje dikte van 0,16 tot 0,19 mm. </li><li> PKCS getagd met fluorescerende eiwitten worden uitgedrukt in Sf9 cellen met behulp van Cellfectin II transfectiereagens volgende aanbeveling van de fabrikant met de wijzigingen die hieronder worden beschreven. </li><li> Dag 1: Voorafgaand aan de beplating van de cellen, elk MatTek gerecht te behandelen met insect medium Grace&#39;s met 10% FBS voor ten minste 30 minuten. </li><li> Count Sf9 cellen van stap 11 (boven) met behulp van een hemacytometer. </li><li> Plaat 0,05 x 10 6 cellen op elke MatTek glas dekglaasje in een totaal volume van 150 ul. Laat de cellen te hechten gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Voeg 2 mL van Grace&#39;s met 10% FBS aangevuld bij elk gerecht een ml per keer langzaam om te voorkomen dat het losmaken van de cellen. </li><li> Incubeer bij 27 ° C gedurende de nacht. </li><li> Vanaf dit punt, gebruik van de fabrikant aanbeveling voor de transfectie van Sf9 cellen met plasmide DNA. </li><li> Dag 2: transfecteren Sf9 cellen met fluorescent gelabelde PKCS met behulp van Cellfectin II transfectiereagens. We hebben vaak samen, uitgedrukt in dit systeem PKCS getagd met verbeterde Green Fluorescent Protein (EGFP) en monomere Red Fluorescent Protein (mRFP) (details voor plasmide bouw zijn eerder beschreven 2,5). Expressie van een fluorescerend eiwit in een tijd levert ongeveer 70-80% tot expressie brengen 72 uur na transfectie. Co-expressie van twee fluorescerende eiwitten af ​​transfectie-efficiëntie tot ongeveer 30% co-expressie cellen. Wanneer eGFP-gelabeld PKC en mRFP-tagged PKC co-expressie, gebruik 2x meer plasmide DNA voor de mRFP-gelabeld eiwit voor een optimale eiwit-expressie. </li><li> Live-imaging 48-72 uur na transfectie (voor een optimale eiwit-expressie, wacht dan 72 uur). </li></ol> 3. Expressie van fluorescent gelabeld PKCS in Aplysia sensorische neuronen <ol><li> De voorbereiding van Aplysia neuronale celkweken is beschreven in een video-artikel van Zhao en collega&#39;s 4. </li><li> PKCS getagd met fluorescerende eiwitten worden uitgedrukt in Aplysia sensorische neuronen met behulp van micro-injectie procedure hieronder beschreven. </li><li> Bereid een voorraad oplossing van 1% Fast Groen (FCF) in gedestilleerd water, filter met behulp van een spuit en een 28 mm spuitfilter (0,20 pm). Aliquot en bewaar bij -20 ° C. </li><li> Micro-injectie van de sensorische neuronen kan worden uitgevoerd op dag 1 of 2 dagen na het isoleren van de neuronen, maar we vinden dat het wachten twee dagen zorgt voor een betere naleving van de cel dekglaasje aan. </li><li> Op dag 2 na isolatie van de sensorische neuronen, dooi een hoeveelheid van Fast Green en opnieuw filter met behulp van een spuit en een 28 mm spuitfilter (0,20 pm). </li><li> Bereid een oplossing van plasmide DNA in gedestilleerd water met 0,5% Fast Green. Concentraties van plasmide DNA zo hoog als 0,4 ng / ul gebruikt kan worden, maar het is niet aan te raden om te gaan boven deze waarden. </li><li> Filter het plasmide DNA / Fast &#39;groene oplossing&#39; met een 1 ml spuit en een 4 mm spuitfilter (0,20 pm). </li><li> Centrifugeer het plasmide DNA / Fast &#39;groene oplossing&#39; op 16.110 xg gedurende 15 minuten met behulp van een microfoonrocentrifuge. </li><li> Bereiden op scherp elektroden voor micro-injectie van de neuronen met behulp van een micro-elektrode trekker (Sutter Flaming / bruin Micropipet Puller, Model P-97). Met behulp van een doos gloeidraad, trek glazen micro-elektroden met 1 mm buitendiameter, 0.75 mm binnen diameter en 100 mm lengte met behulp van dunne wand glazen capillairen met een filament binnenin (World precisie-instrumenten TW100F-4). Voor meer informatie over het trekken van micro-injectie elektroden verwijzen wij u naar Sutter elektrode kookboek. </li><li> Vul elke elektrode met 2 pl van plasmide DNA / Fast &#39;groene oplossing&#39; met behulp van microloader pipetpunt (Eppendorf CA32950-050). </li><li> Breng de MatTek glazen bodem cultuur schotel met Aplysia neuronale culturen tot de micro-injectie station. </li><li> De micro-injectie station bestaat uit de volgende: een home-made grote glazen podium om de cultuur gerechten te houden op een trillingsisolatie tafel (Kinetic Systems trillingsisolatie workstation), een stereo-scope met externe halogeen verlichting, een micromanipulator (Sutter Huxley muur Type micromanipulator die het mogelijk maakt zowel grof-en ultrafijne positionering in de drie-as), een micro-elektrode houder is aangesloten op een pneumatische pomp (World precisie-instrumenten PV820 Pneumatische Pico-pomp). De druk Ingang van de pneumatische pomp is aangesloten op een gecomprimeerde stikstof tank. </li><li> Steek een micro-elektrode in de micro-elektrode houder. </li><li> Weergave in een stereo-microscoop, steek de punt van de micropipet in de celkern. </li><li> Lever korte druk pulsen van stikstof (10 tot 100 ms in de duur, 20 lb / in 2) tot aan de kern wordt uniformely groen. </li><li> Incubeer de cellen gedurende 4 uur bij kamertemperatuur en houd bij 4 ° C tot gebruik. Voor een optimale PKC translocatie, uit te voeren live-imaging experiment 20 tot 24 uur na de injectie. </li></ol> 4. Visualisatie van PKC Translocatie in Living Sf9 cellen en in Aplysia sensorische neuronen <ol><li> Voor beeldvorming, gebruiken we een Zeiss LSM510 omgekeerde confocale microscoop met een Axiovert 200. </li><li> Imaging-protocol is hetzelfde voor Sf9 cellen en voor Aplysia sensorische neuronen met uitzondering van het volgende: Sf9 cellen zijn afgebeeld met een X63 olie-immersie objectief terwijl Aplysia sensorische neuronen worden afgebeeld met een x40 olie-immersie objectief. Sf9-cellen worden afgebeeld in een temperatuur-gecontroleerde ruimte gehandhaafd bij 26-27 ° C, terwijl Aplysia sensorische neuronen worden afgebeeld op kamertemperatuur gehouden rond 18-20 ° C. </li><li> We maken gebruik van een 30 mW Argon laser (excitatie bij 488nm) met 50% laser-uitgang om de afbeelding PKC getagd met eGFP eiwit en een HeNe laser (excitatie bij 543nm) om de afbeelding PKC getagd met mRFP eiwit. De Argon en HeNe laserlijnen zijn verzwakt tot 4% en 50% transmissie-uitgang met respectievelijk voorafgaand aan de beeldvorming en het pinhole wordt aangepast tot een. </li><li> Het is belangrijk om de cultuur schotel gestabiliseerd op het imaging podium te hebben en om beweging of trillingen te voorkomen. </li><li> Verwijder 1 ml van de cultuur media uit de schotel voorzichtig met een pipet van 10 ml verlaten van een mL totaal volume in de schaal. </li><li> Foto&#39;s nemen in het middelste gedeelte van de cellen, waar de kern kan worden gezien. </li><li> Het opzetten van een tijdreeks van 10-20 confocale beelden maken van een foto om de 30 seconden. </li><li> Start de tijdreeks. </li><li> Na 2 foto&#39;s zijn genomen (na de 30 seconden tijdstip), voeg 1 ml van het geneesmiddel (2X concentratie) voorzichtig drop-door-drop op de top van de cellen met behulp van een pipet P1000. De drug wordt continu toegevoegd voor ongeveer 30 seconden. </li><li> Sommige geneesmiddelen veroorzaken een snelle translocatie die onmiddellijk kunnen worden zichtbaar na de behandeling met geneesmiddelen (op het 60 seconden tijdstip), terwijl andere leiden tot een langzame translocatie die slechts optimaal 5-10 minuten na de behandeling (Film 1 en Film 2). </li><li> Indien het geneesmiddel moet worden weggespoeld, gebruik van 2 x 10 mL pipetten om de was te doen, pipetteren de wasbuffer voorzichtig naar beneden met een pipet aan de ene kant van de schotel en pipetteren de media aan de andere kant. </li><li> Als het wassen effectief is geweest en als het effect van het geneesmiddel is omkeerbaar, PKC keert terug naar het cytosol binnen 30-60 seconden. </li><li> Sla de film als een LSM-bestand. </li><li> Gebruik NIH Image J software om de LSM bestanden te openen en de beelden voor en na de behandeling met geneesmiddelen te kwantificeren. Kwantificering is elders een beschreven. </li></ol>

<ol><li>Farah, C. A., Nagakura, I., Weatherill, D., Fan, X. &amp, Sossin, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+role+for+phosphatidic+acid+in+the+translocation+of+the+novel+protein+kinase+C+Apl+II+in+Aplysia+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Physiological role for phosphatidic acid in the translocation of the novel protein kinase C Apl II in Aplysia neurons.</a> Mol Cell Biol. 28, 4719-4733 (2008).</li>
<li>Zhao, Y., Leal, K., Abi-Farah, C., Martin, K. C., Sossin, W. S. &amp, Klein, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M.Isoform+specificity+of+PKC+translocation+in+living+Aplysia+sensory+neurons+and+a+role+for+Ca2%2B-dependent+PKC+APL+I+in+the+induction+of+intermediate-term+facilitation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">M.Isoform specificity of PKC translocation in living Aplysia sensory neurons and a role for Ca2+-dependent PKC APL I in the induction of intermediate-term facilitation.</a> J Neurosci. 26, 8847-8856 (2006).</li>
<li>Farah, C. A., Weatherill, D., Dunn, T. W. &amp, Sossin, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PKC+differentially+translocates+during+spaced+and+massed+training+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">PKC differentially translocates during spaced and massed training in Aplysia.</a> J Neurosci. 29, 10281-10286 (2009).</li>
<li>Zhao, Y., Wang, D. O., Martin, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Aplysia+sensory-motor+neuronal+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of Aplysia sensory-motor neuronal cell cultures.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Manseau, F., Fan, X., Hueftlein, T., Sossin, W. S., Castellucci, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B-independent+PKC+Apl+II+mediates+the+serotonin+induced+facilitation+at+depressed+synapses+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Ca2+-independent PKC Apl II mediates the serotonin induced facilitation at depressed synapses in Aplysia.</a> J. Neuroscience. 21, 1247-1256 (2001).</li>
</ol>

We hebben een techniek beschreven om de afbeelding translocatie van fluorescent gelabelde PKCS in real-time in Sf9 cellen en in Aplysia sensorische neuronen. Sf9-cellen zorgen voor een eenvoudig systeem om de afbeelding PKC translocatie sinds het kweken en transfecteren ze is vrij straight-forward. In tegenstelling tot micro-injectie van Aplysia sensorische neuronen kost wat tijd te beheersen, tot een paar maanden. Moeilijkheden in verband met deze techniek ook elektrode verstopping. Het filteren van d...

<table><tbody><tr><td>bevroren Sf9-cellen</td><td>&lt;Er is geen brontekst opgegeven om te vertalen. Voer a.u.b. de Engelse tekst in die u naar het Nederlands vertaald wilt hebben.&gt;Spodoptera frugiperda&lt;/em&gt; ovariumcellen</td><td>Invitrogen</td><td>B825-01</td><td></td></tr><tr><td>Grace&amp;rsquo;Insectenmedium, aangevuld (1X), vloeibaar</td><td>Reagens</td><td>GIBCO, door Life Technologies</td><td>11605-094</td><td>Gebruiken voor het kweken van Sf9-cellen</td></tr><tr><td>Corning 75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; celkweekfles met schuine hals</td><td>Instrument</td><td>Corning</td><td>430720</td><td>Gebruiken voor het kweken van Sf9-cellen</td></tr><tr><td>Foetaal runderserum</td><td>Reagens</td><td>CanSera</td><td>CS-C08-500</td><td>Aanvulling Grace&amp;rsquo;medium met FBS vóór gebruik</td></tr><tr><td>Spuit</td><td>Instrument</td><td>BD Biosciences</td><td>309604</td><td>Gebruik om de Fast Green-oplossing te filteren</td></tr><tr><td>Spuit</td><td>Instrument</td><td>BD Biosciences</td><td>309602</td><td>Gebruik om plasmid-DNA / Fast Green-oplossing te filteren</td></tr><tr><td>Filter</td><td>Instrument</td><td>Corning</td><td>431229</td><td>Gebruik dit om de Fast Green-oplossing te filteren</td></tr><tr><td>Filter</td><td>Instrument</td><td>Corning</td><td>431212</td><td>Gebruik voor het filteren van plasmid DNA / Fast Green-oplossing</td></tr><tr><td>Kupschotel met glazen bodem</td><td>Instrument</td><td>MatTek Corp.</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>Gebruiken voor het kweken van Sf9-cellen voorafgaand aan transfectie en imaging</td></tr><tr><td>Cellfectin II-reagens</td><td>Reagens</td><td>Invitrogen</td><td>10362-100</td><td>Gebruikt voor de expressie van fluorescentie-gelabelde PKC's in Sf9-cellen</td></tr><tr><td>Fast Green FCF</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-7252</td><td>Gebruik om de micro-injectie van een plasmide-DNA-oplossing in te visualiseren &lt;em&gt;Aplysia&lt;/em&gt; sensorische neuronen</td></tr><tr><td>Dunwandige glazen capillairen</td><td>Instrument</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW100F-4</td><td>Gebruik om micro-&amp;#8211;elektroden voor microinjectie</td></tr><tr><td>Microloader-pipetpunt</td><td>Instrument</td><td>Eppendorf</td><td>CA32950-050</td><td>Autoclaaf vóór gebruik om de micro... te vullen&amp;#8211;elektroden voor microinjectie</td></tr><tr><td>PV820 Pneumatische PicoPump </td><td>Instrument</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>SYS-PV820</td><td>Onderdeel van microinjectiestation</td></tr><tr><td>Micr&amp;#8211;elektrodehouder</td><td>Instrument</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>MPH6S</td><td>Gebruik om micro-&amp;#8211;elektrode </td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Instrument</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>MP-85</td><td>Gebruik om de micro-&amp;#8211;elektrode in de drie-assen</td></tr></tbody></table>

live-beeldvorming van pkc translocatie in sf9 cellen en in aplysia sensorische neuronen

Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

Protein kinase Cs (PKCS) zijn serine threonine kinasen die een centrale rol spelen in het reguleren van een breed scala van cellulaire processen zoals celgroei en leren en geheugen. Er zijn vier bekende families van PKC isovormen in vertebraten: klassieke PKCS (α, βI, βII en γ), nieuwe type I PKCS (ε en η), nieuw type II PKCS (δ en θ), en atypische PKCS (ζ en ι ). De klassieke PKCS worden geactiveerd door Ca 2 + en diacylclycerol (DAG), terwijl de roman PKCS worden geactiveerd door DAG, maar zijn Ca 2 +-onafhankelijk. De atypische PKCS worden geactiveerd door geen van beide Ca 2 + of DAG. In Aplysia californica, ons model systeem om geheugenvorming studeren, zijn er drie zenuwstelsel specifieke PKC isovormen een van elke grote klasse, namelijk de conventionele PKC Apl I, de roman type I PKC Apl II en de atypische PKC Apl III. PKCS zijn lipide-geactiveerde kinasen en dus de activering van klassieke en nieuwe PKCS in reactie op extracellulaire signalen is vaak gecorreleerd met PKC translocatie vanuit het cytoplasma naar de plasmamembraan. Daarom heeft het visualiseren van PKC translocatie in real-time in levende cellen worden een waardevol hulpmiddel voor het ophelderen van de signaaltransductiewegen die leiden tot PKC activering. Zo heeft deze techniek mogelijk voor ons om vast te stellen dat de verschillende isovormen van PKC transloceren onder verschillende omstandigheden op verschillende soorten van synaptische plasticiteit bemiddelen en dat serotonine (5HT) activering van PKC Apl II vereist productie van zowel DAG en fosfatidinezuur (PA) voor de translocatie 1-2. Belangrijk is dat de mogelijkheid om dezelfde neuron te visualiseren heeft herhaaldelijk ons toegestaan, bijvoorbeeld om desensitisatie van de PKC respons in verfijnde details maatregel 3. In deze video, we elke stap van de voorbereiding Sf9 celculturen tonen, hebben culturen van Aplysia sensorische neuronen zijn beschreven in een ander video-artikel 4, uiten van fluorescent gelabelde PKCS in Sf9 cellen en in Aplysia sensorische neuronen en live-imaging van PKC translocatie in reactie op verschillende activatoren met behulp van laser-scanning microscopie.

In deze video laten we zien visualisatie van PKC translocatie in levende cellen met behulp van fluorescent gelabelde PKCS.

Live-beeldvorming van PKC Translocatie in Sf9 cellen en in Aplysia sensorische neuronen

Proteïnekinase C's (PKC's) zijn serine-threoninekinasen die een centrale rol spelen bij de regulatie van een breed scala aan cellulaire processen, zoals celgroei en ...

Het doel van deze procedure is om de translocatie van fluorescentieel gelabelde PKC in levende cellen te visualiseren. Dit wordt bereikt door eerst SF nine celculturen of culturen van sensorische neuronen van een Plegia California voor te bereiden. De tweede stap is het tot expressie brengen van fluorescentieel gelabelde pkcs in de cellen.De laatste stap is het in beeld brengen van de PKC-translocatie in reactie op verschillende activatoren met behulp van laser-scanning microscopie. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de differentiële regulatie van de verschillende PKC-isovormen door second messengers zoals diolglycerol aantonen, door de PKC-translocatie in real-time in levende cellen te visualiseren. Hallo, mijn naam is Carol Ferra.Ik ben research associate in het laboratorium van Dr. Wayne Sawn aan het Montreal Neurological Institute. Vandaag zal ik een demonstratie geven van live imaging van PKC-translocatie in sensorische neuronen van Aplysia. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van de synaptische plasticiteit, zoals de vraag hoe de verschillende PKC-isovormen worden geactiveerd tijdens de vorming van herinneringen.Om de SF nine cell monolayerculturen voor te bereiden in een weefselkweekkast, voeg dan 8 mL Grace's insectenmedium met 30% foetaal runderserum toe aan een cellenkweekfles van 75 cm². Ontdooi vervolgens de bevroren buis met SF nine cellen snel in een waterbad van 37 °C door de buis ongeveer één tot twee minuten heen en weer te bewegen. Breng daarna de SF nine cellen over naar de cellenkweekfles en schud de fles voorzichtig met de hand om de cellen gelijkmatig te verspreiden. Incubeer de cellen één tot twee uur bij 27 °C totdat ze zijn gehecht.Verwijder vervolgens het oude medium uit de kolf en vervang dit door opnieuw 10 milliliters vers Grace's insectenmedium met 30% FBS; incubeer de cellen bij 27 degrees Celsius totdat ze confluent zijn. Om monoculturen te behouden, wordt het oude medium uit de kolf met confluente SF nine cellen verwijderd en worden vijf milliliters Grace's insectenmedium met 10% FBS toegevoegd; tik enkele keren lichtjes tegen de zijkant van de kolf om de SF nine cellen los te maken. Pipetteer vervolgens het medium voorzichtig op en neer met een 10 milliliter pipette.Nadat de cellen tegen de wand van de kolf zijn gespoten tijdens het pipetteren, worden de cellen overgebracht naar een steriele polystyreenbuis van 15 milliliter. Voeg twee milliliter SF nine cel-suspensie toe aan acht milliliter Grace's insectenmedium met 10% FBS in de nieuwe cellu cultivar-kolf van 75 centimeter kwadraat, met een verdunningsverhouding van één op vijf. Om de groeifase in de logaritmische fase te behouden, wordt de kolf voorzichtig met de hand geschud.Incubeer de cellen vervolgens opnieuw bij 27 °C tot ze confluenter zijn. Na incubatie zijn de Sf9-cellen klaar voor gebruik voor de expressie van fluorescentie-gelabelde PKCs, zoals beschreven in de schriftelijke procedure voorafgaand aan de expressie van fluorescentie-gelabelde PKCs. Plegia neurale celculturen worden voorbereid in MatTek glazen bodemkweekschalen zoals eerder beschreven. Filter twee dagen na isolatie van de sensorische neuronen een eerder bereid aliquoot Fast Green met een spuit en een 20 millimeter spuitfilter met een poriegrootte van 0,2 µm.Bereid een oplossing voor van plasmide-DNA dat codeert voor E-G-F-P-P KC API twee in gedestilleerd water met 0,5% fast green bij een concentratie van maximaal 0,4 µg/µL. Filtreer de plasmide-DNA fast green-oplossing met een injectiespuit van 1 mL en een spuitfilter van 4 mm met een poriegrootte van 0,2 µm. Centrifugeer vervolgens de plasmide-DNA fast green-oplossing bij 16.110 ×g gedurende 15 minuten met een microcentrifuge.Bereid vervolgens scherpe elektroden voor voor micro-injectie van neuronen met behulp van een micro-elektrodepuller. Trek glazen micro-elektroden uit dunwandige glazen capillairen met filamenten erin. Vul elke elektrode met 2 µL van een plasmid DNA fast green-oplossing.Met behulp van een micro-laadpipetpunt wordt de micro-injectie uitgevoerd bij het micro-injectiestation. Het micro-injectiestation bestaat uit een zelfgemaakte grote glazen tafel om de kweekschalen op een trillingsisolatietafel te plaatsen. Een stereoscoop met externe halogeenverlichting, een micromanipulator en een micro-elektrodehouder die is aangesloten op een pneumatische pomp.De druktoevoer van de pneumatische pomp is verbonden met een tank met samengeperst stikstof. Verplaats de glazen kweekschaal van Matech met de plegia-neuronculturen naar het micro-injectiestation en plaats een micro-elektrode in de houder voor micro-elektroden. Bekijk de neuronen onder een stereomicroscoop en breng de punt van de micropipet in de celkern.Dien korte stikstofdrukpulsen toe met een duur van 10 tot 100 milliseconden en een druk van 20 pounds per square inch totdat de kern uniform groen wordt. Incubeer de cellen gedurende vier uur bij kamertemperatuur en bewaar ze bij vier graden Celsius tot gebruik. Voor de beeldvorming van zowel SF nine-cellen als plegia-sensoneuronen wordt een Zeiss LSM five 10 geïnverteerde confocale microscoop met een axia avert. 200 gebruikt.In deze video wordt de beeldvorming van sensorische neuronen van plegia gedemonstreerd. Details voor de beeldvorming van SF nine-cellen kunnen worden gevonden in het schriftelijke protocol. Gebruik een argonlaser van 30 milliwatts met een laseroutput van 50% om PKC die is getagd met EGFP-proteïne in beeld te brengen.Verzwak vervolgens de Argonne-laserlijn tot een transmissie-output van 4%. Stel daarna het pinhole in op één, stabiliseer de kweekschaal op de beeldvormingstafel en voorkom beweging of trillingen. Verwijder voorzichtig één milliliter kweekmedium uit de schaal met een 10 milliliter pipette en laat een totaalvolume van één milliliter achter.In de schaal. Lokaliseer het middelste gedeelte van de cellen waar de nucleus zichtbaar is. Stel een tijdserie in van 10 tot 20 confocale beelden met tijdsintervallen van 30 seconden.Start de film en induceer, nadat de tweede foto is genomen, translocatie door voorzichtig één milliliter van het middel in een tweevoudige concentratie toe te voegen. Voeg het middel gedurende ongeveer 30 seconden continu druppel voor druppel bovenop de cellen toe. Hier wordt serotonine gebruikt om een snelle translocatie te induceren, die onmiddellijk na de behandeling met het middel zichtbaar kan zijn.Sommige geneesmiddelen induceren een langzame translocatie, die pas vijf tot 10 minuten na de behandeling optimaal is; spoel het geneesmiddel weg met twee pipetten van 10 milliliter, waarbij het wasbuffer met één pipet voorzichtig aan één zijde van de schaal wordt toegevoegd en het medium aan de andere zijde wordt weggepipetteerd. Als de wasbeurt effectief is en het effect van het geneesmiddel reversibel is, zal PKC binnen 30 tot 60 seconden terugkeren naar het cytosol. Sla de film op als het getoonde LSM-bestand.Hier zijn de representatieve resultaten van live imaging van PKC-translocatie in sensorische neuronen van plegia. E-G-F-P-P KC APL two werd tot expressie gebracht in een sensorisch neuron en er werd een reeks van 10 confocale beelden opgenomen met tijdsintervallen van 30 seconden. In dit voorbeeld werd na 30 seconden opname serotonine aan de schaal toegevoegd.In dit voorbeeld wordt live imaging van PKC-translocatie getoond in Sf9-cellen. EGFP-PKC$\alpha$1 en mRFP-PKC$\alpha$2 werden co-expressie in Sf9-cellen en er werd een reeks van 10 confocale beelden opgenomen met tijdsintervallen van 30 seconden. One two DIOCTYL SN glycerol.Een celpermeabel analoog van DYL-glycerol werd aan de schaal toegevoegd na 30 seconden opname. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe fluorescent gelabelde pkcs tot expressie kunnen worden gebracht in aplasia-sensory neuronen, en hoe PKC-translocatie in levende cellen kan worden afgebeeld.

live-imaging-pkc-translocation-sf9-cells-aplysia-sensory

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

In deze video, beschrijven we een methode voor het live-cell imaging van asymmetrisch te verdelen zintuig progenitor cellen en epidermale cellen in...

Live-cell imaging van zintuig voorloper cellen in Intact Drosophila Poppen

We zien hoe veranderingen in de intracellulaire vrije calciumconcentratie en synaptische werkzaamheid kan gelijktijdig monitoren in een ganglion bereiding...

Volgen van veranderingen in de intracellulaire calciumconcentratie en Synaptic werkzaamheid in de Mollusc<em&gt; Aplysia</em

Source: Jongbloets, B. C., et al. Visualizing Protein Kinase A Activity In Head-fixed Behaving Mice Using In Vivo Two-photon Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy. J. Vis. Exp. (2019) This video demonstrates a two-photon fluorescence lifetime imaging microscopy procedure for visualizing protein kinase A activity in head-fixed, behaving mice during enforced locomotion.

Visualizing Protein Kinase A Activity in a Mouse Using Two-Photon Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy 

Hier presenteren we een nieuwe Ca 2+ -Imaging aanpak met behulp van een bioluminescente reporter. Deze benadering maakt gebruik van een gefuseerde construct GFP-aequorine dat bindt aan Ca2 + en licht emitteert, waardoor de noodzaak voor excitatie licht. Aanzienlijk deze methode maakt het mogelijk lange doorlopende beeldvorming, de toegang tot diepe hersenstructuren en hoge tijdsresolutie.

In vivo Functional Brain Imaging aanpak op basis van Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorine

Caenorhabditis elegans (C. elegans) is een goed model te bestuderen van axonale en intracellulair transport. Hier beschrijf ik een protocol voor in vivo opname en analyse van axonale en intraflagellair vervoer in C. elegans.

Immobilisatie van Caenorhabditis elegans te analyseren intracellulair Transport in neuronen

Een procedure wordt gepresenteerd om te visualiseren van proteïne kinase een activiteiten in hoofd-vaste, gedragen muizen. Een verbeterde A-kinase activiteit Reporter, tAKARα, wordt uitgedrukt in corticale neuronen en toegankelijk gemaakt voorbeeld vorming door middel van een craniaal venster. Two-photon fluorescentie Lifetime Imaging microscopie wordt gebruikt om PKA-activiteiten in vivo te visualiseren tijdens gedwongen motoriek.

Visualisering van proteïne kinase een activiteit in hoofd-vaste muizen die in vivo twee-fotonen fluorescentie levensduur beeld microscopie gebruiken

Dit protocol presenteert een methode voor het weergeven van neuronale populatieactiviteit met eencellige resolutie bij niet-transgene ongewervelde soorten met behulp van absorptiespanningsgevoelige kleurstoffen en een fotodiode array. Deze aanpak maakt een snelle workflow mogelijk, waarbij beeldvorming en analyse in één dag kunnen worden nagestreefd.

Op fotodiode gebaseerde optische beeldvorming voor het opnemen van netwerkdynamica met single-neuronresolutie in niet-transgene ongewervelde dieren

Dit protocol beschrijft toepassingen van monsterimmobilisatie met behulp van Fibrine-stolsels, waardoor driften worden beperkt en de toevoeging en washout van reagentia tijdens live beeldvorming mogelijk is. Monsters worden overgebracht naar een druppel Fibrinogeen met kweekmedium op het oppervlak van een afdeklip, waarna polymerisatie wordt geïnduceerd door toevoeging van trombine.

Toepassingen van immobilisatie van Drosophila-weefsels met fibrinestolsels voor live beeldvorming

Twee gerelateerde methoden worden beschreven om subcellulaire gebeurtenissen te visualiseren die nodig zijn voor synaptische transmissie. Deze protocollen maken de real-time monitoring van de dynamiek van presynaptische calciuminstroom en synaptische vesikelmembraanfusie mogelijk met behulp van live-cell imaging van in vitro gekweekte neuronen.

Real-time fluorescerende meting van synaptische functies in modellen van amyotrofische laterale sclerose

Dit artikel presenteert een gedetailleerd stapsgewijs protocol over het gebruik van een geïntegreerd multifunctioneel en door de gebruiker programmeerbaar systeem dat automatische meerkanaals beeldvorming en mechanobiologische analyse mogelijk maakt om de mechano-gevoeligheid van Ja-geassocieerd eiwit (YAP) op te helderen.

Volledig optische mechanobiologie ondervraging van ja-geassocieerd eiwit in menselijke kanker en normale cellen met behulp van een multifunctioneel systeem

Hier laten we zien hoe transfectie van primaire hippocampale knaagdierneuronen kan worden gecombineerd met confocale beeldvorming met levende cellen om pathologische eiwitgeïnduceerde effecten op axonaal transport te analyseren en mechanistische routes te identificeren die deze effecten mediëren.

Beeldvorming van levende cellen gebruiken om de effecten van pathologische eiwitten op axonaal transport in primaire hippocampusneuronen te meten

Leer live-beeldvorming van PKC-translocatie in Sf9-cellen en Aplysia-sensorische neuronen met fluorescent gelabelde PKC's. Deze methode toont differentiële regulatie van PKC-isoformen door tweede boodschappers in real-time.

Live-beeldvorming van PKC Translocatie in Sf9 cellen en in Aplysia sensorische neuronen

Meer video's verkennen