Name: Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling door Thin Layer Chromatography (TLC) Samen met de gas-vloeistofchromatografie (GLC) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-18T11:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 2 s
Description: Leer polaire glycerolipiden profilering in Arabidopsis thaliana via dunne-laagchromatografie en gas-vloeistofchromatografie. Deze methode biedt een eenvoudige en betrouwbare aanpak voor het kwantificeren van vetzuurmethylesters.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk wordt ondersteund door een subsidie ​​van de Amerikaanse National Science Foundation om Christoph Benning.

1. Vetextractie <ol><li> Begin vetextractie door het oogsten van 30 mg 4-weken oude Arabidopsis bladeren van planten gekweekt op agar gestold medium of bodem en ze in 1,5 ml polypropyleen buizen reactie te dragen. Verse bladeren kunnen flitsen worden ingevroren in vloeibare stikstof en bewaard bij -80 ° C. </li><li> Voeg 300 ul extractieoplosmiddel samengesteld uit methanol, chloroform en mierenzuur (20:10:1, v / v / v) aan elk monster. Schud krachtig (met behulp van een verf shaker of vergelijkbaar) gedurende 5 minuten. </li><li> Voeg 150 ul van 0,2 M fosforzuur (H 3 PO 4), 1 M kaliumchloride (KCl) en vortex kort. </li><li> Centrifugeer op 13000 xg bij kamertemperatuur gedurende 1 minuut. Lipiden opgelost in de lagere chloroform fase wordt gespot op TLC platen. </li></ol> 2. Thin Layer Chromatography (TLC) 15 <ol><li> Ter voorbereiding op TLC platen, dompel een 20cmx20cm silicagel gecoate TLC plaat met het laden van strip voor 30 sec in 0,15 M ammoniumsulfaat ((NH 4) 2 SO 4) oplossing, Na onder te dompelen gedurende 30 seconden, droog de ​​plaat gedurende tenminste 2 dagen in een overdekte container. Tijdens het activeren van de sublimatie van ammonium laat achter zwavelzuur, die fosfatidylglycerol noodzakelijk zijn voor de scheiding van andere glycerolipids protonates. </li><li> Op de dag van experiment, te activeren TLC platen door het bakken in een oven bij 120 ° C gedurende 2,5 uur. </li><li> Na het afkoelen van de geactiveerde platen op kamertemperatuur, gebruik dan een potlood een rechte lijn (1,5 cm van de rand van de plaat) te tekenen over de plaat aan de oorsprong van het chromatogram. </li><li> In een zuurkast, langzaam te leveren 3 X 20 ul van lipide extract in de onderste chloroformfase met behulp van een 20 il pipet met 200 pi gele plastic tips onder een trage stroom van N 2. Voor dit doel is een Tygon slang aangesloten op de regulator van de N 2 tank. Houd de plek kleiner dan 1 cm in diameter. Elke plaat kan tot 10 monsters (bij latere GLC analyse is gepland). </li><li> Omdat de lipide plekken helemaal droog in de zuurkast, de voorbereiding van de loopvloeistof samengesteld uit aceton, tolueen, water (91 ml: 30 ml: 7,5 ml). Als de omgevingstemperatuur relatieve luchtvochtigheid hoog is, kan scheiding worden beïnvloed. In dit geval water moet worden teruggebracht tot (91 ml: 30 ml: 7,0 ml) te geven aan de gewenste scheiding te bereiken. </li><li> Giet 80 ml loopvloeistof in een afsluitbare TLC het ontwikkelen van kamer (L: H: W = 27,0: 26,5: 7,0, cm / cm / cm) en plaats de plaat in de tank met het monster eind naar beneden. Sluit de tank met behulp van de klem. Het oplosmiddel zal opstijgen van de plaat en lipiden worden gescheiden. De ontwikkeling duurt ongeveer 50 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Wanneer het oplosmiddel voorkant heeft 1 cm van de bovenkant van de plaat bereikt, verwijder voorzichtig de plaat uit de tank en drogen in de zuurkast voor ongeveer 10 minuten. </li><li> Lipiden gescheiden door TLC kan zowel reversibele kort gekleurd met jodium voor kwantitatieve analyse of onomkeerbaar gekleurd met zwavelzuur of α-naftol. <ol><li> Zwavelzuur verkolen: spuit de plaat met 50% zwavelzuur in water in een glazen spuitfles in de zuurkast en afbakken op 120 ° C gedurende 15 minuten (Figuur 2A). </li><li> α-naftol kleuring voor glycolipiden: spuiten van de plaat met 2,4% (w / v) α-naftol in 10% (v / v) zwavelzuur, 80% (v / v) ethanol en afbakken op 120 ° C gedurende 3-5 minuten tot de glycolipide bands krijgen een roze of paarse (Figuur 2B). Overbehandeling zal leiden tot verkoling van alle lipiden door de aanwezigheid van zwavelzuur in het reagens. </li><li> Jodium vlekken: in een zuurkast, de plaat in een gesloten TLC tank met jodium kristallen (in een bak op de bodem leiden tot verzadiging van de atmosfeer met jodiumdampen tot de lipiden zijn zichtbaar). Niet blootstellen van de plaat om jodium te lang jodium covalent kan meervoudig onverzadigde vetzuren (figuur 2C) te wijzigen. U kunt ook op een oxidatie van lipiden te voorkomen, alleen standaard lanen afgewisseld met het monster rijstroken moeten worden gekleurd met behulp van een glaswol gestoken Pasteur pipet met jodium kristallen waardoor N 2 is overgewaaid afzonderlijke standaard rijstroken. </li></ol></li></ol> 3. Fatty acyl methylester (FAME) Reactie 16 <ol><li> Verwijder silica omliggende geïdentificeerd lipide vlekken van de TLC-plaat met een scheermesje. Schraap het lipide met silica en de overdracht van de silica poeder met behulp van een trechter in een glazen buis met een Teflon (PTFE) beklede schroefdop. </li><li> Voeg 1 ml 1 N zoutzuur (HCl) in watervrije methanol aan elk monster door glazen pipet. </li><li> Voeg 100 ul 50 ug ml-1 pentadecanoic zuur (15:0) met behulp van 200 pi pipet aan elk monster als interne standaard met behulp van een 200 pi pipet met 200 pi gele plastic tip. Houd een buis met slechts pentadecenoic zuur in methanolische HCl als een controle. Goed afsluiten glazen buizen met Teflon bekleed caps. </li><li> Incubate glkont buizen in een 80 ° C waterbad gedurende 25 minuten. Buizen moeten worden afgedicht, zodat het oplosmiddel niet verdampen. </li><li> Na de tubes zijn afgekoeld, voeg 1 ml 0,9% natriumchloride, gevolgd door 1 ml hexaan en vortex krachtig. Centrifugeer monsters op 1000xg gedurende 3 minuten. </li><li> In de zuurkast, verwijder dan de hexaan / bovenste laag van het monster met Pasteur pipet en plaats deze in een nieuw 13x100 mm glazen buis. </li><li> Verdampen hexaan onder een trage stroom van N 2 zonder uit te drogen volledig. </li><li> Los de resulterende vetzuur methylesters acyl s in 60 uL hexaan. Overdracht monsters in autosampler vials en dop stevig vast. Monsters kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C voor korte termijn en -20 ° C voor een paar dagen. </li></ol> 4. Gas-vloeistofchromatografie (GLC) 10 <ol><li> Voor het begin van GLC, Zorg ervoor dat het helium, waterstof en lucht cilinders zijn gevuld. </li><li> Voldoende hexaan moet worden toegevoegd aan het oplosmiddel reservoir en de afvalcontainer moeten leeg zijn. Voor vette acyl methylesters scheiding, voeg een DB-23 kolom aan de machine. </li><li> Plaats flacons in de autosampler. Start de Chemstation software voor GLC op het systeem computer. </li><li> Stel de inlaat temperatuur op 250 ° C met helium debiet bij 48,6 ml min -1 en de druk op 21,93 psi. De splitsingsverhouding is 30,0: 1. </li><li> De oventemperatuur is in eerste instantie ingesteld op 140 ° C gedurende 2 minuten en verhoogd tot 160 ° C met een snelheid van 25 ° C min -1. Stel vervolgens de temperatuur te verhogen van 160 ° C tot 250 ° C met een snelheid van 8 ° C min -1 en houd deze bij 250 ° C gedurende 4 minuten, gevolgd door een daling tot 140 ° C met een snelheid van 38 ° C min - 1. Een run duurt ongeveer 21 minuten. </li><li> De temperatuur van de vlam ionisatie detector is 270 ° C met een waterstof-debiet van 30,0 ml min -1, luchtstroming bij 400 ml min -1 en helium debiet bij 30,0 ml min -1. </li><li> Voer het aantal flacons en proef namen in de aanloop volgorde tafel. Zet de 10 pi injector tot en met 2 pl monster per flacon injecteren. </li><li> Wanneer het instrument klaar is, start de run reeks. </li></ol> 5. Representatieve resultaten: Voorbeelden van onomkeerbare kleuring van TLC-gescheiden lipiden van 4-weken oude Arabidopsis zaailingen zijn weergegeven in figuur 2. Het zwavelzuur gebrandschilderde lipiden (Figuur 2A) zijn verkoold en verschijnen als bruine vlekken. α-naftol is de voorkeur om glycolipids zoals MGDG vlek, DGDG, SQDG etc. Glycolipiden gekleurd met α-naftol dragen een roze-paarse kleur, terwijl andere polaire lipiden vlek geel (Figuur 2B). Het jodium kleuring is omkeerbaar en geeft lipiden een gelige kleur die zullen verdwijnen gedurende een korte tijd als jodium verdampt (figuur 2C). Kort jodium gekleurde lipiden kan worden onderworpen aan GLC analyse, hoewel ongekleurde lipiden zijn voorkeur te verminderen afbraak van lipiden. Indien met succes gedaan, zal onderscheidende signalen die verschillende Fatty acyl methylester worden waargenomen na GLC (figuur 3). Fatty acyl methylester met kortere koolstofketen en minder dubbele bindingen hebben kortere retentietijd het gebruik van de DB-23 kolom. Fatty acyl methylester profilering is een gevoelig instrument om mutanten te identificeren met veranderde lipide samenstelling. In figuur 4 is de MGDG18: is 3 vetzuur molverhouding daalde in de tgd4-1 mutant ten opzichte van de wild-type 18. Door de verdeling van de molen Fatty acyl methylester voor een lipide klasse met de mol alle lipide klassen, zijn de molaire verhouding van elke lipide berekend. Bijvoorbeeld, om de molaire verhouding van MGDG berekenen: (MGDG) mol% = Σ [Fames (MGDG)] / Σ [Fames (totaal)] x100% De resulterende molaire verhoudingen van elke lipide klasse van zowel de wild-type en de mutant kunnen worden vergeleken. Zo heeft de tgd4-1 mutant verhoogde relatieve hoeveelheden van MGDG en PG maar verlaagde hoeveelheden DGDG en PE (figuur 5) 18. <img src="/files/ftp_upload/2518/2518fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Stroomdiagram van polaire lipiden analyse met behulp van Arabidopsis zaailingen. Totaal lipiden worden gehaald uit 4-weken oude Arabidopsis zaailingen en gescheiden door TLC. Het afgescheiden lipiden kan worden geschraapt van TLC plaat voor verestering, gevolgd door GLC-analyse. <img src="/files/ftp_upload/2518/2518fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Scheiding van lipiden op TLC platen. Lipide extracten van 35 mg (vers gewicht) wild type zaailingen worden gescheiden door TLC en gekleurd door zwavelzuur (A), α-naftol (B) of jodiumdampen (C). Drie herhalingen worden getoond in elke kleuring methode. DGDG, digalactosyldiacylglycerol, MGDG, monogalactosyldiacylglycerol, PC, fosfatidylcholine, PE, fosfatidylethanolamine, PG, phosphatidylglycerol, PI, fosfatidylinositol, SQDG, sulfoquinovosyldiacylglycerol. <img src="/files/ftp_upload/2518/2518fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. GLC analyse van Fatty Acid Methylesters (Fames) afgeleid van MGDG van het wild type. Fames worden gescheiden op een 30 m capillaire kolom en gedetecteerd door de vlam ionisatie. Pentadecanoic zuur (15:0) wordt gebruikt als een interne standaard. <img src="/files/ftp_upload/2518/2518fig4.jpg" alt="Figuur 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4. Vetzuurprofiel van MGDG in het wild type col2 (witte kolommen) en de tgd4-1 mutant (zwarte kolommen). Vetzuren worden gepresenteerd als het aantal koolstofatomen, gevolgd door het aantal dubbele bindingen. Drie herhalingen zijn gemiddeld en standaarddeviaties worden weergegeven. <img src="/files/ftp_upload/2518/2518fig5.jpg" alt="Figuur 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 5"> Figuur 5. Polar lipiden samenstelling van het wild type col2 (witte kolommen) en de tgd4-1 mutant (zwarte kolommen). Drie herhalingen zijn gemiddeld en standaarddeviaties worden weergegeven door een fout bar.

<ol><li>Ajjawi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+reverse+genetics+in+Arabidopsis%3A+case+studies+from+the+Chloroplast+2010+Project%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Large-scale reverse genetics in Arabidopsis: case studies from the Chloroplast 2010 Project.</a> Plant Physiol. 152, 529-529 (2010).</li>
<li>Andersson, M. X., Kjellberg, J. M., Sandelius, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+involvement+of+cytosolic+lipases+in+converting+phosphatidyl+choline+to+substrate+for+galactolipid+synthesis+in+the+chloroplast+envelope%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">The involvement of cytosolic lipases in converting phosphatidyl choline to substrate for galactolipid synthesis in the chloroplast envelope.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1684, 46-46 (2004).</li>
<li>Awai, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phosphatidic+acid-binding+protein+of+the+chloroplast+inner+envelope+membrane+involved+in+lipid+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">A phosphatidic acid-binding protein of the chloroplast inner envelope membrane involved in lipid trafficking.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, e10817-e10817 (2006).</li>
<li>Benning, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+lipid+transport+involved+in+organelle+biogenesis+in+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of lipid transport involved in organelle biogenesis in plant cells.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 25, 71-71 (2009).</li>
<li>Browse, J., McCourt, P. J., Somerville, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid+composition+of+leaf+lipids+determined+after+combined+digestion+and+fatty+acid+methyl+ester+formation+from+fresh+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Fatty acid composition of leaf lipids determined after combined digestion and fatty acid methyl ester formation from fresh tissue.</a> Anal. Biochem. 152, 141-141 (1986).</li>
<li>Dormann, P., Balbo, I., Benning, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+galactolipid+biosynthesis+and+lipid+trafficking+mediated+by+DGD1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis galactolipid biosynthesis and lipid trafficking mediated by DGD1.</a> Science. 284, 2181-2181 (1999).</li>
<li>Guskov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyanobacterial+photosystem+II+at+2.9-A+resolution+and+the+role+of+quinones%2C+lipids%2C+channels+and+chloride%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Cyanobacterial photosystem II at 2.9-A resolution and the role of quinones, lipids, channels and chloride.</a> 16, 334-334 (2009).</li>
<li>Hartel, H., Dormann, P., Benning, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DGD1-independent+biosynthesis+of+extraplastidic+galactolipids+after+phosphate+deprivation+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">DGD1-independent biosynthesis of extraplastidic galactolipids after phosphate deprivation in Arabidopsis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 10649-10649 (2000).</li>
<li>James, A. T., MARTIN, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gas-liquid+partition+chromatography%3B+the+separation+and+micro-estimation+of+volatile+fatty+acids+from+formic+acid+to+dodecanoic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Gas-liquid partition chromatography; the separation and micro-estimation of volatile fatty acids from formic acid to dodecanoic acid.</a> Biochem. J. 50, 679-679 (1952).</li>
<li>Jordan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+structure+of+cyanobacterial+photosystem+I+at+2.5+A+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional structure of cyanobacterial photosystem I at 2.5 A resolution.</a> Nature. 411, 909-909 (2001).</li>
<li>Kobayashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type-B+monogalactosyldiacylglycerol+synthases+are+involved+in+phosphate+starvation-induced+lipid+remodeling%2C+and+are+crucial+for+low-phosphate+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Type-B monogalactosyldiacylglycerol synthases are involved in phosphate starvation-induced lipid remodeling, and are crucial for low-phosphate adaptation.</a> Plant J. 57, 322-322 (2009).</li>
<li>Lu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small+ATPase+protein+of+Arabidopsis%2C+TGD3%2C+involved+in+chloroplast+lipid+import%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A small ATPase protein of Arabidopsis, TGD3, involved in chloroplast lipid import.</a> J. Biol. Chem. 282, 35945-35945 (2007).</li>
<li>Ohlrogge, J., Browse, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Lipid biosynthesis.</a> Plant Cell. 7, 957-957 (1995).</li>
<li>Stahl, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thin-layer+chromatography%3B+methods%2C+influencing+factors+and+an+example+of+its+use%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmazie%22%5BJournal%5D)">Thin-layer chromatography; methods, influencing factors and an example of its use.</a> Pharmazie. 11, 633-633 (1956).</li>
<li>Stoffel, W., INSULL, W., AHRENS, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gas-liquid+chromatography+of+highly+unsaturated+fatty+acid+methyl+esters%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Soc.+Exp.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Gas-liquid chromatography of highly unsaturated fatty acid methyl esters.</a> Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 99, 238-238 (1958).</li>
<li>Welti, R., Wang, X., Williams, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospray+ionization+tandem+mass+spectrometry+scan+modes+for+plant+chloroplast+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Electrospray ionization tandem mass spectrometry scan modes for plant chloroplast lipids.</a> Anal. Biochem. 314, 149-149 (2003).</li>
<li>Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+trafficking+between+the+endoplasmic+reticulum+and+the+plastid+in+Arabidopsis+requires+the+extraplastidic+TGD4+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Lipid trafficking between the endoplasmic reticulum and the plastid in Arabidopsis requires the extraplastidic TGD4 protein.</a> Plant Cell. 20, 2190-2190 (2008).</li>
<li>Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+of+the+TGD1+chloroplast+envelope+protein+affects+phosphatidate+metabolism+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Mutation of the TGD1 chloroplast envelope protein affects phosphatidate metabolism in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 17, 3094-3094 (2005).</li>
<li>Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+permease-like+protein+involved+in+ER+to+thylakoid+lipid+transfer+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">A permease-like protein involved in ER to thylakoid lipid transfer in Arabidopsis.</a> EMBO J. 22, 2370-2370 (2003).</li>
</ol>

DLC gekoppeld met GLC biedt een robuuste en snelle tool voor kwantitatieve analyse van polaire lipiden in planten. Kleine veranderingen in lipide samenstelling kan worden geïdentificeerd, daarom is deze methode is gebruikt voor grootschalige screening van mutanten een verminderde in polaire lipiden metabole routes 1,20. Deze methode wordt ook veel gebruikt voor de monitoring-activiteiten van enzymen gebruik te maken van polaire lipiden als substraat. 2,6,7 Behalve bladeren, kan de lipide samenstelling van andere plantaardige weefsels, zoals wortels en zaden of subcellulaire fracties, zoals chloroplasten en mitochondria ook worden bepaald op dezelfde manier. Het oplosmiddel-systeem (aceton, tolueen, water) hier gebruikt is geoptimaliseerd voor de scheiding van glycolipiden en fosfolipiden in planten. Echter, in tgd1, 2,3,4 mutanten en geïsoleerde chloroplasten, TGDG loopt samen met PE, terwijl tetragalactosyldiacylglycerol draait met PC. In dit geval is een oplosmiddel systeem met chloroform, methanol, azijnzuur en water (85: 20: 10: 4, v / v / v / v) wordt gebruikt 13. Soms twee-dimensionale DLC met twee verschillende oplosmiddelen systemen wordt uitgevoerd om verder te scheiden glycolipiden en fosfolipiden 19. Bovendien kunnen plantenweefsels direct worden onderworpen aan de FAME-reactie, gevolgd door GLC de totale vetzuurprofiel vast te stellen zonder eerste scheiding op TLC 5. Naast de aangetoonde TLC-GLC-systeem, is een andere methode gebruikt voor het lipide profilering op basis van directe electrospray ionisatie tandem massaspectrometrie 17. In deze methode wordt de eerste chromatografische scheiding van lipiden in het extract is weggelaten. Echter, deze methode vereist dure apparatuur en ervaren personeel, waardoor het minder nuttig voor routine-analyses in het laboratorium of voor mutant screening.

<table><tbody><tr><td>&amp;alpha;-naftol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N1000</td><td></td></tr><tr><td>Methanolisch HCl 3N</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>33050-U</td><td>Verdunnen tot 1N met methanol</td></tr><tr><td>Si250-PA TLC-platen</td><td>JT Baker</td><td>7003-04</td><td>Met pre-absorbent</td></tr><tr><td>TLC-kamer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z266000</td><td></td></tr><tr><td>Buisjes met schroefdop</td><td>VWR international</td><td>53283-800</td><td></td></tr><tr><td>Schroefdoppen</td><td>Sun Sri</td><td>13-425</td><td></td></tr><tr><td>PTFE-schijf</td><td>Sun Sri</td><td>200 608</td><td></td></tr><tr><td>GLC-systeem</td><td>Hewlett-Packard</td><td>HP6890</td><td></td></tr><tr><td>DB-23 kolom</td><td>J&amp;amp;W Scientific</td><td>122-2332</td><td></td></tr><tr><td>GLC-vials</td><td>Sun Sri</td><td>500 132</td><td></td></tr><tr><td>Doppen voor GLC-vials</td><td>Sun Sri</td><td>201 828</td><td></td></tr><tr><td>Chemstation-software</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2070AA</td><td></td></tr></tbody></table>

arabidopsis thaliana polar glycerolipid profiling door thin layer chromatography (tlc) samen met de gas-vloeistofchromatografie (glc)

Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling by Thin Layer Chromatography (TLC) Coupled with Gas-Liquid Chromatography (GLC)

Biologische membranen afzonderlijke cellen uit de omgeving. Van een enkele cel tot meercellige planten en dieren, glycerolipids, zoals fosfatidylcholine of fosfatidylethanolamine, vorm dubbellaag membranen die fungeren als zowel de grenzen en de interfaces voor chemische uitwisseling tussen cellen en hun omgeving. In tegenstelling tot dieren, plantencellen hebben een speciale organel voor fotosynthese, de chloroplast. Het ingewikkelde membraan systeem van de chloroplast bevat unieke glycerolipids, namelijk glycolipiden gebrek aan fosfor: monogalactosyldiacylglycerol (MGDG), digalactosyldiacylglycerol (DGDG), sulfoquinovosyldiacylglycerol (SQDG) 4. De rollen van deze lipiden zijn dan alleen structureel. Deze glycolipiden en andere glycerolipids werden gevonden in de kristalstructuren van fotosysteem I en II met de betrokkenheid van de glycerolipids in de fotosynthese 8,11. Tijdens het fosfaat verhongering, is DGDG overgebracht naar extraplastidic membranen om het verlies van fosfolipiden 9,12 compenseren. Veel van onze kennis van de biosynthese en de functie van deze lipiden is afgeleid van een combinatie van genetische en biochemische studies met Arabidopsis thaliana 14. Tijdens deze studies heeft een eenvoudige procedure voor de analyse van polaire lipiden essentieel geweest voor de screening en analyse van de lipiden mutanten en wordt in detail beschreven. Een blad lipide extract wordt eerst van elkaar gescheiden door dunne laag chromatografie (TLC) en glycerolipids zijn reversibel gekleurd met jodium dampen. De individuele lipiden zijn geschraapt van de TLC-plaat en omgezet in vet acyl methylesters (Fames), die worden geanalyseerd door gas-vloeistofchromatografie gekoppeld met een vlam ionisatie detectie (FID-GLC) (Figuur 1). Deze methode is bewezen dat een betrouwbaar instrument voor de mutant screening worden. Bijvoorbeeld, de tgd1, 2,3,4 endoplasmatisch reticulum-to-plastide lipide mensenhandel mutanten werden ontdekt op basis van de accumulatie van een abnormale galactoglycerolipid: trigalactosyldiacylglycerol (TGDG) en een daling van de relatieve hoeveelheid van 18:3 (kool: dubbel obligaties) vet acylgroepen in membraanlipiden 3,13,18,20. Deze methode is ook van toepassing voor het bepalen van enzymatische activiteiten van eiwitten met behulp van lipiden als substraat 6.

Samenstelling van de polaire lipiden extracten en de vetzuursamenstelling van de individuele glycerolipids worden bepaald in een eenvoudige en robuuste lipide profilering experiment. Voor dit doel worden glycerolipids geïsoleerd door dunnelaagchromatografie en onderworpen aan transmethylation van hun acylgroepen. Fatty acyl methylesters worden gekwantificeerd door middel van gas-vloeistofchromatografie.

Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling door Thin Layer Chromatography (TLC) Samen met de gas-vloeistofchromatografie (GLC)

Biologische membranen scheiden cellen af van de omgeving. Van een enkele cel tot meercellige planten en dieren; glycerolipiden, zoals ...

Het algemene doel van deze procedure is om de samenstelling van polaire lipiden in zaailingen van arabidopsis te bepalen. Dit wordt bereikt door eerst lipiden uit de zaailingen te extraheren. De polaire lipiden worden vervolgens gescheiden via dunne-laagschromatografie.Vervolgens worden specifieke lipidvlekken geïsoleerd van de dunne-laagchromatografieplaat en door transesterificatie omgezet in vetzuurmethylesters. De laatste stap van de procedure is het kwantificeren van de samenstelling van de vetzuurmethylesters middels gas-vloeistofchromatografie. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de molaire ratio en het vetzuurprofiel van elk polair lipid in het wildtype en de mutant tonen.Hallo, mijn naam is Christophe Benning. Velen van u hebben ons gevraagd hoe een kwantitatieve analyse van polaire lipiden moet worden uitgevoerd. Wij maken gebruik van een zeer eenvoudige en robuuste methode die ons goed van pas is gestreken tijdens grootschalige screening van mutanten in de modelplant Arabidopsis thaliana.Andere uitstekende methoden, zoals lipidenprofilering op basis van massaspectrometrie, vereisen dure apparatuur en veel ervaring en training. Wij maken gebruik van een tweestapsprocedure die bestaat uit eenvoudige dunlaagchromatografie gecombineerd met kwantificering van vetzuurmethylesters na de isolatie van mutanten. Meestal is een meer kwantitatieve analyse vereist.Dit gebeurt door membraanlipiden te isoleren uit de dunne-laagplaat en vetzuurmethylesters te bereiden, die vervolgens worden gekwantificeerd via vloeistof-gaschromatografie. De methode is zeer reproduceerbaar en de resultaten zijn vergelijkbaar met complexere massaspectrometrie-gebaseerde technieken, wat aantoont dat de procedure zal worden uitgevoerd door Zen Wang, een promovendus uit mijn laboratorium. Begin de lipidextractie door 30 milligram bladeren van vier weken oude Arabidopsis te oogsten van planten die zijn gegroeid op agar-gestolide medium of in grond. Breng de bladeren over in reactiebuisjes van 1,5 milliliter van propyleen.Voeg 300 µL extractiemiddel bestaande uit methanol, chloroform en mierenzuur toe aan elk monster. Schud de monsters vijf minuten krachtig. Voeg vervolgens 150 µL 0,2 M fosforzuur en 1 M kaliumchloride toe en vortex.CentrifugeHet monster kortstondig bij 13 000 ×g gedurende één minuut. Bij kamertemperatuur worden de lipiden die zijn opgelost in de onderste chloroform-fase op dunne-laagchromatografieplaten gespot. Om TLC-platen voor te bereiden, wordt een silica-gel-gecoate TLC-plaat van 20 bij 20 centimeter met aanbrengstrip ondergedompeld in een 0,15 M ammoniumsulfaatoplossing.Na 30 seconden onderdompeling wordt de plaat gedurende ten minste twee dagen gedroogd in een afgedekte container. Tijdens de activatie laat de sublimatie van ammonium zwavelzuur achter, dat fosfaat en glycerol protoneert, wat noodzakelijk is voor de scheiding ervan van andere glycerollipiden. Activeer op de dag van het experiment de TLC-platen door deze twee en een half uur in een oven te bakken bij 120 °C.Nadat de geactiveerde platen zijn afgekoeld tot kamertemperatuur, wordt met een potlood een rechte lijn over de plaat getrokken bij de oorsprong van het chromatogram. In een zuurkast wordt Tygon-slangage, verbonden met de regulator van de stikstoftank, gebruikt om een stroom stikstofgas te leveren; breng vervolgens langzaam drie maal 20 µL van het lipidenextract uit de onderste chloroform-fase aan op de plaat met behulp van een pipetteerhulp van 20 µL met een gele plastic tip van 200 µL onder een zachte stroom stikstofgas. Er wordt een pipetteerhulp van 20 µL gebruikt om de vlek kleiner te houden dan één centimeter in diameter.Elke plaat kan tot 10 monsters bevatten terwijl de lipidvlekken volledig opdrogen. Bereid in de zuurkast het ontwikkelingsmiddel voor, bestaande uit aceton, tolueen en water. Giet 80 milliliters van het ontwikkelingsmiddel in een afsluitbare TLC-ontwikkelkamer en plaats de plaat in de kamer.Sluit de tank af met het uiteinde van de monsterzijde naar beneden gericht. Door gebruik van de klem zal het oplosmiddel door de plaat stijgen en zullen de lipiden worden gescheiden. De ontwikkeltijd bedraagt ongeveer 50 minuten bij kamertemperatuur.Wanneer het oplosmiddelfront één centimeter van de bovenkant van de plaat heeft bereikt, wordt de plaat voorzichtig uit het reservoir verwijderd en gedurende 10 minuten volledig gedroogd in de zuurkast. Lipiden die via TLC zijn gescheiden, kunnen kortstondig omkeerbaar worden gekleurd met jodium voor kwantitatieve analyse, of onomkeerbaar worden gekleurd met zwavelzuur of alpha natal. Voor onomkeerbare kleuring wordt de plaat behandeld via zwavelzuurverkoling.Spray de plaat in de zuurkast met 50% zwavelzuur in water met een glazen spuitfles en bak deze 15 minuten bij 120 °C. Omgekeerd, bij alpha-naftolkleuring voor glycolipiden, spray de plaat met 2,4% (m/v) alpha-naftol in 10% (v/v) zwavelzuur en 80% (v/v) ethanol; bak de plaat bij 120 °C gedurende drie tot vijf minuten totdat de glycolipidenvlekken roze of paars gekleurd zijn.Voer jodiumkleuring uit. Bereid in een zuurkast een gesloten LC-tank voor met jodiumkristallen in een bakje op de bodem van de tank, zodat de atmosfeer verzadigd raakt met jodiumdamp. Plaats de TLC-plaat in de tank om deze bloot te stellen aan jodium totdat de lipiden zichtbaar zijn. Stel de plaat niet te lang bloot aan het jodium, aangezien het jodium covalent kan binden.Modificeer de meervoudig onverzadigde vetzuren. Verwijder met een scheermesje de silica rondom de geïdentificeerde lipidvlekken van de TLC-plaat en schraap de lipidbevattende silica af. Breng het silicapoeder met behulp van een trechter over in een glazen buis met een Teflon-gevoerde schroefdop.Voeg met een glazen pipet één milliliter van een zoutzuuroplossing in watervrij methanol toe aan elk monster. Voeg vervolgens aan elk monster 100 µL pentadecaanzuur (50 µg/mL) toe als interne standaard met een 200 µL pipet en een gele plastic tip van 200 µL. Bereid daarnaast een buis voor met enkel pentadecaanzuur in methanoli-zoutzuur als controle.Sluit de glazen buizen stevig af met met Teflon gevoerde doppen. Incubeer de glazen buizen 25 minuten in een waterbad van 80 °C. De buizen moeten luchtdicht zijn afgesloten zodat het oplosmiddel niet verdampt nadat de buizen zijn afgekoeld.Voeg één milliliter 0,9% natriumchloride toe, gevolgd door één milliliter hexaan, en vortex vervolgens krachtig. Centrifugeer de monsters bij 1000 ×g gedurende drie minuten. Verwijder na centrifugatie de bovenste hexaanlaag van het monster met een pipette in de zuurkast en breng deze over in een nieuwe glazen buis van 13 bij 100 millimeter. Verdampt het hexaan onder een langzame stroom stikstof zonder het volledig te laten drogen. Los de resulterende vetzuurmethylesters op in 60 µL hexaan. Breng de monsters over in autosampler-vials en sluit deze stevig af.Monsters kunnen voor korte termijn bij vier graden Celsius worden bewaard en voor enkele dagen bij minus 20 graden Celsius voordat men met de GLC begint. Controleer of de helium-, waterstof- en luchtflessen voldoende gevuld zijn; er moet voldoende hexaan in het oplosmiddelreservoir worden toegevoegd en de afvalcontainer moet leeg zijn voor de scheiding van vetzuurmethylesters. Bevestig een DB 23-kolom aan het apparaat.Plaats de vials in de autosampler. Start de ChemStation-software voor GLC op de systeemcomputer. Stel de injectietemperatuur in op 250 °C met een heliumstroomsnelheid van 48,6 ml/min en een druk van 21,93 PSI.De splitratio is 30 op één. De oventemperatuur wordt aanvankelijk ingesteld op 140 °C voor twee minuten en vervolgens verhoogd naar 160 °C met een snelheid van 25 °C per minuut. Stel vervolgens in dat de temperatuur stijgt van 160 °C naar 250 °C met een snelheid van acht °C per minuut, waarbij de temperatuur gedurende vier minuten op 250 °C wordt gehouden, gevolgd door een daling naar 140 °C met een snelheid van 38 °C per minuut.Met dit temperatuurprofiel duurt één run ongeveer 21 minuten. De temperatuur van de vlamionisatiedetector is 270 °C met een waterstofstroomsnelheid van 30 mL per minuut. De luchtstroomsnelheid is 400 mL per minuut en de heliumstroomsnelheid is 30 mL per minuut.Voer het aantal vials en de namen van de monsters in de tabel van de run-sequentie in. Stel de 10 µL injector zo in dat er twee µL van het monster per vial wordt geïnjecteerd. Wanneer het instrument gereed is, start u de run-sequentie.Hier worden voorbeelden getoond van de kleuring van met TLC gescheiden lipiden van vier weken oude Arabidopsis-zaailingen. De met zwavelzuur gekleurde lipiden zijn verkoold en verschijnen als bruine vlekken. Alpha natal heeft de voorkeur voor het kleuren van glycolipiden zoals M-G-D-G-D-G-D-G en SQ dg.Glycolipipiden die gekleurd zijn met alpha natal hebben een roze-paarse kleur, terwijl andere polaire lipiden geel kleuren. De jodiumkleuring is omkeerbaar en geeft lipiden een gelige kleur die na korte tijd verdwijnt wanneer het jodium verdampt. Kort samengevat kunnen met jodium gekleurde lipiden worden onderworpen aan GLC-analyse, hoewel ongekleurde lipiden bij voorkeur worden gebruikt om de afbraak van lipiden te verminderen, mits dit succesvol wordt uitgevoerd.Er zullen kenmerkende signalen worden waargenomen die verschillende vetzuurmethylesters vertegenwoordigen na GLC; vetzuurmethylesters met kortere koolstofketens en minder dubbele bindingen hebben een kortere retentietijd. Met gebruik van de DB 23-kolom is het profileren van vetzuurmethylesters een gevoelige methode om mutanten met een gewijzigde lipidensamenstelling te identificeren.De molaire ratio van de drie vetzuren van MGDG 18 is verlaagd in de TGD four dash one mutant in vergelijking met het wildtype, door de molen vetzuurmethylesters voor één lipidklasse te delen door de molen vetzuurmethylesters. Voor alle lipidklassen worden de molaire ratio's van elk lipide berekend; de resulterende molaire ratio's van elke lipidklasse van zowel het wildtype als de mutant kunnen hier worden vergeleken. Het is duidelijk dat de TGD four dash one mutant verhoogde relatieve hoeveelheden MGDG en pg heeft, maar verlaagde hoeveelheden D-G-D-G-N-P-E. Dunlaagchromatografie maakt het mogelijk om veel monsters parallel te onderzoeken en staat een visuele inspectie toe van belangrijke verschillen in lipidprofielen.Bovendien onderzoekt u bij een TLC in wezen vele enzymen en genen die nodig zijn voor de synthese van de lipiden en daarmee het lipidenprofiel. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u de samenstelling van polaire lipiden kunt analyseren via TOC en GOC. Bedankt voor het kijken naar de video en veel succes met uw experiment.

arabidopsis-thaliana-polar-glycerolipid-profiling-thin-layer

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

De plant cuticula is een wasachtige buitenste laag met planten die een primaire rol in het waterbeheer heeft, maar is ook een belangrijke barrière tegen het binnendringen van pathogene micro-organismen. In deze video, tonen we de analyse van de plant cuticula mutanten geïdentificeerd door vooruit en reverse genetics benaderingen.

Het gebruik van Arabidopsis mutanten eceriferum naar Plant Nagelriem Biosynthese Explore

De moleculaire basis van ruimtelijke-specifieke fytochroom reacties wordt onderzocht met behulp van transgene planten die weefsel-en orgaan-specifieke fytochroom gebreken vertonen. De isolatie van specifieke cellen vertonen geïnduceerde fytochroom chromofoor uitputting door middel van fluorescentie-Activated Cell Sorting gevolgd door middel van microarray-analyses wordt gebruikt om genen die betrokken zijn bij de ruimtelijke-specifieke fytochroom reacties te identificeren.

Onderzoeken Tissue-en orgel-specifieke fytochroom Reacties met behulp van FACS-assisted Cell-type-specifieke expressie profilering in Arabidopsis thaliana</em

Hier beschrijven we een robuuste werkwijze voor de fractionering van plantaardige plasmamembranen in reinigingsmiddelenbestendige en detergent oplosbare membranen gebaseerd op een mengsel van gelabelde en in vivo volledig 15N gemerkt Arabidopsis thaliana celculturen. De procedure wordt toegepast voor vergelijkende proteomics studies om signalering processen te begrijpen.

Metabole Labeling en Membrane Fractionation for Comparative Proteomic analyse van<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Schorsing Celkweken

Zoogdieren omhulsel bevat oplosmiddel-extraheerbare lipiden die chemische samenstelling kenmerkend is voor individuele soorten kan bieden. Dit document presenteert een routinemethode voor het scheiden brede lipideklassen Integumentair geïsoleerd uit weefsels met behulp van dunnelaagchromatografie en waarin de triacylglyceride profiel door matrix-geassisteerde laser desorptie / ionisatie time-of-flight massaspectrometrie.

Profilering de triacylglyceride Inhoud in Bat Integumentary Lipids door preparatieve Dunnelaagchromatografie en MALDI-TOF massaspectrometrie

Kennis van de samenstelling van het floëem sap en het mechanisme van de lading en langeafstandsvervoer is essentieel voor het begrijpen van de lange afstand signalering bij ontwikkeling en stress / pathogeen respons planten en assimileren transport. Dit manuscript beschrijft de verzameling van floëem exsudaten gebruik van de EDTA-gefaciliteerd methode.

Verzameling en analyse van<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Bastweefsel wondvocht De EDTA-methode vergemakkelijkt

Lipide polyesters vormen de structurele componenten van twee celwandmodificaties, de plantencuticula en suberine-bevattende diffusiebarriers. In deze video beschrijven we een methode om cutine te depolymeriseren uit volledig ontvette bladeren. De methode kan worden toegepast op het onderzoeken van mutanten die beperkt zijn in de biosynthese van cutine of suberine.

Isolatie en analyse van de samenstelling van de Plant Nagelriem Lipid Polyester Monomeren

Veel voorspelde (fosfo)lipasen zijn slecht gekarakteriseerd met betrekking tot hun substraatspecificiteit en fysiologische functies. Hier bieden we een protocol om enzymactiviteiten te optimaliseren, naar natuurlijke substraten te zoeken en fysiologische functies voor deze enzymen voor te stellen.

Het definiëren van de ondergrond hebben voor lipase en fosfolipase Kandidaten

Een protocol voor de uitgebreide extractie van lipiden, metabolieten en eiwitten uit biologische weefsels met behulp van een monster wordt gepresenteerd.

Een eenvoudige gefractieerde extractie methode voor de uitgebreide analyse van metabolieten, lipiden en proteïnen uit een enkele monster

Hier wordt een fosfaatprotemische benadering gepresenteerd, namelijk stop and go extractietip op basis van phosfoproteom, die een hoge doorvoer en diepe dekking van Arabidopsis phosphoproteome biedt. Deze aanpak definieert het overzicht van osmotische stresssignalering in Arabidopsis.

Fosfaatprotemische strategie voor profilering osmotische stresssignalering in Arabidopsis

Een snel en efficiënt protocol wordt gepresenteerd voor de isolatie van plastoglobule lipidedruppels geassocieerd met verschillende fotosynthetische organismen. De succesvolle bereiding van geïsoleerde plastoglobulen is een cruciale eerste stap die voorafgaat aan gedetailleerde moleculaire onderzoeken zoals proteomische en lipidomische analyses.

Plastoglobule Lipid Droplet Isolation van plantaardig bladweefsel en cyanobacteriën

Leer polaire glycerolipiden profilering in Arabidopsis thaliana via dunne-laagchromatografie en gas-vloeistofchromatografie. Deze methode biedt een eenvoudige en betrouwbare aanpak voor het kwantificeren van vetzuurmethylesters.

Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling door Thin Layer Chromatography (TLC) Samen met de gas-vloeistofchromatografie (GLC) (Video) | JoVE Journal

Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling door Thin Layer Chromatography (TLC) Samen met de gas-vloeistofchromatografie (GLC)

Meer video's verkennen