Subcutane Infectie van Methicilline Resistente Staphylococcus Aureus (MRSA)

Het algemene doel van het volgende experiment is om de overleving en verspreiding van methicilline-resistente Staphylococcus aureus (MRSA) te onderzoeken, evenals de chemokine- en cytokineniveaus op de infectieplaatsen. Dit wordt bereikt door de vacht op de ruggen van de muizen te verwijderen om een duidelijk observatiegebied te creëren. Als tweede stap.

MRSA in een suspensie wordt drie dagen na infectie subcutaan toegediend aan muizen; infectiepathologieën en bacteriële aantallen kunnen worden beoordeeld door het aantal colony forming units uit weefselhomogenaten op agarplaten te bepalen. Hallo, hoe gaat het met u? Mijn naam is De Lordon.

Ik ben een postdoctoraal onderzoeker. Hallo, mijn naam is Mariel Sanchez. Ik ben een promovendus en ik ben Andrea Huda.

Ik ben een onderzoeksmedewerker en wij maken deel uit van het laboratorium van George Lee in de afdeling pediatrie van het Cedar-Sinai Medical Center. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van cruciale vragen in het medische veld, zoals het modelleren van ernstige infecties, waaronder myositis, polymyositis en necrotiserende fasciitis. Hoewel deze methode inzicht kan verschaffen in ernstige spoedinfecties, kan deze ook worden toegepast op andere systemen, zoals groep A streptokokken en andere organismen.

Daarnaast kunnen we de functie en pathogenese bestuderen van andere organismen die myositis en polymyositis veroorzaken. Over het algemeen kunnen personen die nieuw zijn met deze procedure problemen ondervinden, omdat een van de globale regulatoren van de caucusgebieden zeer mutabel is. Als er geen voorzorgsmaatregelen worden genomen, kunnen de verzamelde gegevens een aanzienlijke variatie vertonen, wat ertoe zal leiden dat de gegevens moeilijk te interpreteren zijn.

Laten we beginnen. Bereid in een BSL-2 faciliteit een schapenbloedagarplaat in TSA-basis en een steriele loot met behulp van een vriesblok. Haal de Mercer-stamcultuur uit de opslag bij -80 °C.

Gebruik vervolgens de steriele entlus om een klein ijskristal van de stockcultuur op de plaat over te brengen. Plaats de stockcultuur onmiddellijk terug in de vriezer na het verkrijgen van een klein kristal van de Mercer-stockcultuur om dooi te voorkomen, aangezien herhaaldelijk vriezen en ontdooien de stockcultuur zal beschadigen. Gebruik de entlus om de agar uit te strijken om de groei van individuele Mercer-koloniën te faciliteren.

Incubeer de plaat gedurende de nacht bij 37 °C zonder CO2-supplement. Bereid de volgende dag een nieuwe blood agar plaat, een TSA-plaat en een snap-cap buis van 15 ml met 3 ml THB voor en label deze.

Haal de overnacht gekweekte M SSA-plaat op en onderzoek het hemolytische fenotype van de kolonies. Selecteer met een steriele entlus een kolonie met een fenotype dat consistent is met eerdere experimentele kolonies. Inoculeer het THB met de geselecteerde kolonie met behulp van dezelfde uitstrijktechniek.

Incubeer de plaat met de THB-oplossing gedurende de nacht bij 37 °C met schudden op 220 omwentelingen per minuut. Deze bacteriën zullen worden gebruikt om de cultuur te inoculeren voor subcutane infectie van de muizen in latere stappen. Plaats ook de bloedagarplaat in de incubator.

De plaat wordt de volgende ochtend gebruikt om te bevestigen dat het hemolytische fenotype van de bacteriën in de THB-oplossing overeenkomt met dat van de oorspronkelijk geselecteerde kolonie. Als het hemolysefenotype niet consistent is met de oorspronkelijke kloon, start het experiment dan niet. Plaats de muis op een platform en scheer de vacht op de rug weg.

Als het dier te agressief is, kan sedatie met isofluorine noodzakelijk zijn. Breng ongeveer vijf kubieke millimeter ontharingscrème, zoals NA, aan op het geschoren gebied. NA kan worden aangeschaft bij de lokale drogist.

Zorg ervoor dat u de onthaarkrem koopt die babyolie bevat, omdat het product zonder babyolie te stimulerend zal zijn voor de muizen. Laat de crème ongeveer één minuut inwerken op het huidoppervlak. Terwijl de onthaarkrem inwerkt, maakt u enkele papieren handdoekjes nat met dubbel gedestilleerd water. Gebruik de natte papieren handdoekjes om het geschoren gebied schoon te vegen.

Zorg ervoor dat de huid vrij is van de ontharingscrème. Verwarm 10 milliliters THB voor in een 50 milliliter schroefdopbuisje bij 37 °C in een bacterie-incubator gedurende vier tot 10 uur. Overbreng 20 µL van de overnight bacteriecultuur naar de voorverwarmde THB. Dit zal de overnight merc verdunnen.

Een suspensie van 1:500. Plaats de buis bij 37 °C in een schudincubator op 220 toeren per minuut gedurende ongeveer tweeënhalve tot drie uur. Gebruik meer THB om de bacteriële suspensie verder te verdunnen tot 1:10 en meet de suspensie met een spectrofotometer.

Met absorptie bij 514 nanometers. Blijf de suspensie incuberen bij 37 °C met schudden op 220 tpm totdat de 1:10 verdunde suspensie 0,25 bereikt. Om de M er te oogsten, centrifugeer de 50 milliliter buis bij 3.225 ×g gedurende 10 minuten bij 4 °C, verwijder het supernatant en resuspendeer.

Suspendeer het bacteriële pellet in 10 milliliter DPBS en was de bacteriën opnieuw door de centrifugatiestap te herhalen voor dit ernstige infectiemodel. Suspendeer het bacteriële pellet opnieuw in ongeveer één milliliter DPBS, wat resulteert in ongeveer 1 × 10¹⁰ colony forming units per milliliter. Bereid schapenbloed A-R-T-S-A platen voor en verdun de bacteriën serieel van 10¹ tot 10⁸ in DPBS platen.

Breng drie druppels van 10 µL van de opeenvolgend verdunde bacteriële suspensie aan op een bloedagarplaat. Incubeer de platen gedurende één nacht bij 37 °C. Observeer en noteer na een incubatietijd van 16 tot 18 uur het hemolysefenotype van het inoculum.

Tel de colony forming units op de platen. Het infectie-inoculum wordt berekend op basis van het aantal colony forming units op de platen.

Bereid een spuit voor met 100 µL van de eerder bereide bacteriële suspensie in DPBS. Vóór de injectie moeten de muizen gesedeerd worden zodat hun ademhalingsfrequentie ongeveer één keer per seconde is. Voor demonstratiedoeleinden wordt in deze video een geëuthanaseerde muis getoond.

Injecteer het M ser in één flank na de injectie. Plaats de muis terug in de kooi. Observeer de dieren gedurende drie tot vijf uur na de injectie om er zeker van te zijn dat de muis nog in leven is voordat deze wordt teruggebracht naar de dierkamer.

Controleer de laesies op de ruggen van de dieren dagelijks nadat de dieren zijn geofferd. Meet en noteer de grootte en de conditie van de laesies op de huid. Zowel de laesiegebieden op de huid als in de spieren worden gekwantificeerd door de lengte en breedte van de laesie in millimeters met elkaar te vermenigvuldigen.

Onregelmatig gevormde laesies moeten worden onderverdeeld in kleinere symmetrische stukken, waarbij elk stuk met dezelfde methode wordt gemeten. Bereid 1,5 milliliter microcentrifugebuisjes voor met 100 µL DPBS voor de weefselafname. Maak een inkeping in de huid met een steriel scheermesje en exciseer de laesie met een steriele schaar.

Zorg er bij het excideren van de laesie voor dat er ook ongeveer twee tot vijf millimeter gezonde huid rondom het gebied wordt weggesneden. Plaats de laesie in de weefselopvangbuisjes voor de analyse van de spierlaesies. Pel de huid voorzichtig af om de grootte te meten en de toestand van de laesie op het spierweefsel te registreren.

Verzamel de milt en de nieren. Plaats deze weefsels in hun eigen individuele opvangbuisjes. Homogeniseer de weefsels door deze ongeveer 30 seconden te agiteren met een spuit van 1 mL.

Voeg 900 µL DPBS toe aan elke buis. Zet de THA-platen klaar en vortex de gehomogeniseerde weefselmonsters gedurende vijf minuten. Voer een seriële verdunning van het monster uit.

Verdun de suspensies tot een factor van 1 tot 10⁶. Breng in 96-wells platen 10 µL van elke serieel verdunde suspensie aan op de platen. Incubeer de platen gedurende een nacht in een bacteriële incubator bij 37 °C.

Tel de volgende ochtend de colony forming units op de platen en bereken het aantal colony forming units op basis van de verdunningsfactoren. Als de infectie correct is uitgevoerd, is er direct na de subcutane injectie een bultje zichtbaar op het huidoppervlak. Als er geen bultje zichtbaar is, kan de injectie te diep zijn, wat de uitkomst van de infectie kan beïnvloeden.

De grootte van de laesie en het bacteriële overleven kunnen op verschillende tijdstippten na infectie met MSA worden beoordeeld. De volgende huidlaesies werden onderzocht op dag drie na infectie en zijn voorbeelden van een laesie bij een CD1-muis die aan één flank is geïnfecteerd met 1 × 10⁷ colony forming units. Spierlaesies worden doorgaans aangetroffen in het weefsel onder de huidlaesies.

Hieronder volgen voorbeelden van de overeenkomstige spieroppervlaktelaesies voor de eerder getoonde foto's van huidlaesies. Dit zijn spierlaesies waargenomen op dag drie na infectie bij een muis die is geïnfecteerd met 1 × 10⁷ colony forming units. Het laesiegebied wordt bepaald als de lengte maal de breedte van de laesie, gemeten in millimeters, en kan worden gemeten om de weefselschade van de huid te beoordelen.

Het aantal kolonievormende eenheden van de bacteriën die zich op de infectieplaats bevinden, kan worden gekwantificeerd in uitgesneden laesies. De telling van de kolonievormende eenheden kan aangeven of een virulentiefactor de MSA een overlevingsvoordeel verschaft. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de standaard veiligheidsvoorschriften in acht te nemen vanwege het gebruik van naalden en hoogpathogene microben na deze procedure.

Ten slotte kan voor het abcesmodel een 1.000 keer lagere inoculum worden gebruikt dan in ons model om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals welke S-factoren een persistente RSA-infectie bevorderen? Houd er rekening mee dat het werken met spuiten gevuld met Mars A uiterst gevaarlijk kan zijn; neem daarom voorzorgsmaatregelen, zoals het direct weggooien van de spuit in de naaldencontainer, om accidentele prikincidenten met de naald te voorkomen. Daarnaast is het voor dit experiment belangrijk om de standaard BSL-2-protocollen te volgen om een correcte desinfectie van de werkruimte te waarborgen.

Dat was het. Bedankt voor het kijken. Hoi. Hoi, doei.