Name: Subcutane Infectie van Methicilline Resistente Staphylococcus Aureus (MRSA) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-09T18:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 18 s
Description: Leer een murien huidinfectiemodel voor MRSA-virulentie en immunologische responsanalyse. Deze methode kwantificeert bacteriële belasting en cytokines bij Staphylococcus aureus infecties.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door een Burroughs-Wellcome Career Award en door National Institutes of Health-beurs AI074832 aan G. Y. Liu.

1. Voorbereiden van de MRSA voor infectie (twee dagen voor de infectie)
<ol>
<li>Inoculeer een lus MRSA vanuit een stockcultuur op een bloedagarplaat (Trypticase Soy Agar (TSA)).</li>
<li>Controleer het hemolyse-fenotype (een heldere zone rond elke kolonie) op de bloedagarplaat.</li>
<li>Selecteer een kolonie met een hemolytisch fenotype dat consistent is met andere experimenten.</li>
<li>Inoculeer de kolonie in 3 mL Todd Hewitt Broth (THB), indien nodig met het toepasselijke antibioticum, in een 15 mL buis met klikdop.</li>
<li>Incubeer overnight bij 37°C met schudden op 20 rpm.</li>
</ol>
2. Voorbereiding van de muizen voor infectie (één dag vóór de infectie)
<ol>
<li>Scheer, afhankelijk van de grootte van de muizen, de vacht van een gebied van 3 x 4 cm op de rug van de muizen.</li>
<li>Breng ~5 mm3 ontharingscrème (gekocht bij een lokale drogist) aan op het geschoren gebied.</li>
<li>Laat de ontharingscrème ongeveer 1 min inwerken op het huidoppervlak.</li>
<li>Maak papieren handdoeken nat met ddH2O.</li>
<li>Veeg de ontharingscrème af met de natte papieren handdoek.</li>
</ol>
3. Voorbereiden van de MRSA voor infectie (op de dag van infectie)
<ol>
<li>Verdun de overnight bacteriële cultuur in een verhouding van 1:50 tot 1:100 met 10 mL voorverwarmd THB in een buis van 50 mL met schroefdop.</li>
<li>Incubeer gedurende ongeveer 2,5 uur bij 37°C met schudden op 220 rpm, totdat A540 2,5 bereikt.</li>
<li>Verzamel MRSA door centrifugatie bij 3.25 x g gedurende 10 min bij 4°C.</li>
<li>Verwijder het supernatant.</li>
<li>Resuspendeer het bacteriële pellet in 10 mL Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS).</li>
<li>Herhaal stap 3 en 4.</li>
<li>Resuspendeer het bacteriële pellet in DPBS tot de gewenste concentratie.</li>
<li>Maak seriële verdunningen van de bacteriële suspensie van 101 tot 108.</li>
<li>Plateer de verdunde bacteriële suspensie op bloedagarplaten.</li>
<li>Incubeer de platen overnight bij 37°C.</li>
<li>Observeer en noteer het hemolytische fenotype van de inocula.</li>
<li>Tel het aantal Colony Forming Units (CFU) op de plaat.</li>
<li>Bereken de inocula op basis van het CFU-getal op de plaat.</li>
</ol>
4. Subcutane infectie met MRSA (op de dag van infectie en 3 dagen na infectie)
<ol>
<li>Injecteer subcutaan 10 μL bacteriële suspensie in het geschoren gebied.</li>
<li>Observeer de dieren gedurende 3 tot 5 uur na de injectie om er zeker van te zijn dat de muizen in leven zijn.</li>
<li>Observeer de laesie op de rug van de dieren dagelijks en noteer de oppervlakte van de laesie dagelijks indien nodig. De observatie van de laesie moet het vastleggen van de grootte en morfologie van de laesie omvatten. Zowel huid- als spierlaesies worden gekwantificeerd door de lengte en breedte van de laesie met elkaar te vermenigvuldigen. Onregelmatig gevormde laesies moeten worden opgedeeld in kleinere symmetrische delen, waarbij elk deel met dezelfde methode wordt gemeten. Voor laesiemetingen kan ook een computerondersteund histomorfometrisch beoordelingsprogramma worden gebruikt (ImageJ; open-source beschikbaar via de NIH op <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a>) 2.</li>
<li>Offer de dieren op dag 3 na infectie door inhalatie van isofluraan gevolgd door cervicale dislocatie.</li>
<li>Observeer en noteer de laesie op de huid.</li>
<li>Maak een inkeping in de huid met een steriele schaar.</li>
<li>Pel de huid voorzichtig af en observeer en noteer de laesie op de spier.</li>
<li>Exciseer de laesie en ongeveer 2 - 5 mm van het omliggende gebied.</li>
<li>Verzamelen van milt en nieren.</li>
<li>Homogeniseer de weefsels met een weefselhomogenisator of door herhaaldelijk een zuiger van een 1 mL spuit in een microcentrifugeebuis met het weefsel en 10 μL DPBS te bewegen.</li>
<li>Voeg 90 μL DPBS toe aan elke buis.</li>
<li>Vortex de monsters gedurende 5 min.</li>
<li>Verdun de suspensie seriëel met DPBS van 101 tot 106.</li>
<li>Plaat de verdunde suspensies op THA-platen.</li>
</ol>
5. Representatieve resultaten:
<ol>
<li>Direct na elke subcutane injectie zal een blaasje op het huidoppervlak zichtbaar zijn wanneer de infectie correct is uitgevoerd (Figuur 1A). Als er geen blaasje op het huidoppervlak wordt waargenomen, kan de injectie te diep zijn, wat de uitkomst van de infectie (laesiegrootte, CFU) kan beïnvloeden.</li>
<li>De bacteriële suspensie moet seriële verdunningen ondergaan en de CFU moeten voor elk experiment op bloedagarplaten worden onderzocht. Deze stap levert belangrijke informatie op: 1) of de inocula een homogeen fenotype hebben; 2) het exacte aantal levensvatbare bacteriën voor de infectie.</li>
<li>De laesies en bacteriële overleving kunnen op verschillende tijdstippen na de infectie worden beoordeeld. Hier hebben we de infectie onderzocht op dag 3 na infectie. De laesiegroottes worden geanalyseerd op het huidoppervlak (Figuur 1B: 1x 109; Figuur 1D: 1 x 107 CFU) en op het spieroppervlak (Figuur 1C: 1x 109; Figuur 1E: 1 x 107 CFU). Om de weefselschade te beoordelen, kan het laesieoppervlak worden berekend als lengte (mm) x breedte (mm) (Fig. 2 A en B). Dit resultaat kan helpen bij het bepalen van de omvang van de weefselschade veroorzaakt door een bepaalde virulentiefactor. Daarnaast worden de laesies uitgesneden, gehomogeniseerd in DPBS en uitgeplaat om het aantal CFU te kwantificeren (Figuur 2C), wat de levensvatbaarheid van de bacteriën op de infectieplaats aangeeft.</li>
</ol>
<img src="/files/ftp_upload/2528/2528fig1.jpg" alt="Analyse van bacteriële infectie, huid versus spier, tijdlijn van progressie; afbeelding van het experimentele infectieproces." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figuur 1"> 
Figuur 1. De huid- en spierlaesies. CD1-muizen werden subcutaan op één flank geïnoculeerd met MRSA (LAC). Er werden foto's gemaakt op tijdstip 0 en dag 3 na infectie. (A) Tijdstip 0 na infectie (n.i.), (B)-(G) Dag 3 n.i.; B, D en F: huidlaesies; C, E en G: spierlaesies; B en C: 1x 109 geïnfecteerde CFU; D en E: 1x 107 CFU geïnfecteerd; F en G: mock.
<img src="/files/ftp_upload/2528/2528fig2.jpg" alt="Vergelijking van gegevens over het laesieoppervlak en CFU/ml; het diagram toont de statistische significantie in gegroepeerde plots." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figuur 2"> 
Figuur 2. Grootte van de huidlaesie en aantal levensvatbare bacteriën op de infectieplaats op dag 3 na infectie. Huid- en spierlaesies bij CD1-muizen geïnfecteerd met MRSA (LAC). (A) Grootte van de huidlaesie. (B) Grootte van de spierlaesie. (C) Totaal CFU in weefsel. H: 1 x 109 CFU-inocula; L: 1 x 107 CFU-inocula. *: p &lt; 0,05, Mann-Whitney-toets.

<ol><li>Ahn, J. Y., Song, J. Y., Yun, Y. S., Jeong, G., Choi, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+of+Staphylococcus+aureus-infected+septic+mice+by+suppression+of+early+acute+inflammation+and+enhanced+antimicrobial+activity+by+ginsan%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Immunol+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Protection of Staphylococcus aureus-infected septic mice by suppression of early acute inflammation and enhanced antimicrobial activity by ginsan.</a> FEMS Immunol Med Microbiol. 46, 187-197 (2006).</li>
<li>Girish, V., Vijayalakshmi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affordable+image+analysis+using+NIH+Image%2FImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Affordable image analysis using NIH Image/ImageJ.</a> Indian J Cancer. 41, 47-47 (2004).</li>
<li>Hahn, B. L., Onunkwo, C. C., Watts, C. J., Sohnle, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+dissemination+and+cutaneous+damage+in+a+mouse+model+of+staphylococcal+skin+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Pathog%22%5BJournal%5D)">Systemic dissemination and cutaneous damage in a mouse model of staphylococcal skin infections.</a> Microb Pathog. 47, 16-23 (2009).</li>
<li>Hruz, P., Zinkernagel, A. S., Jenikova, G., Botwin, G. J., Hugot, J. P., Karin, M., Nizet, V., Eckmann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NOD2+contributes+to+cutaneous+defense+against+Staphylococcus+aureus+through+alpha-toxin-dependent+innate+immune+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">NOD2 contributes to cutaneous defense against Staphylococcus aureus through alpha-toxin-dependent innate immune activation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12873-12878 (2009).</li>
<li>Ji, Y., Zhang, B., Van, S. F., Horn, P. W. arren, Woodnutt, G., Burnham, M. K., Rosenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+critical+staphylococcal+genes+using+conditional+phenotypes+generated+by+antisense+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of critical staphylococcal genes using conditional phenotypes generated by antisense RNA.</a> Science. 293, 2266-2269 (2001).</li>
<li>Somerville, G. A., Beres, S. B., Fitzgerald, J. R., DeLeo, F. R., Cole, R. L., Hoff, J. S., Musser, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+serial+passage+of+Staphylococcus+aureus%3A+changes+in+physiology%2C+virulence+factor+production%2C+and+agr+nucleotide+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">In vitro serial passage of Staphylococcus aureus: changes in physiology, virulence factor production, and agr nucleotide sequence.</a> J Bacteriol. 184, 1430-1437 (2002).</li>
<li>Tseng, C. W., Kyme, P., Low, J., Rocha, M. A., Alsabeh, R., Miller, L. G., Otto, M., Arditi, M., Diep, B. A., Nizet, V., Doherty, T. M., Beenhouwer, D. O., Liu, G. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+Panton-Valentine+leukocidin+contributes+to+inflammation+and+muscle+tissue+injury%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus Panton-Valentine leukocidin contributes to inflammation and muscle tissue injury.</a> PLoS One. 4, e6387-e6387 (2009).</li>
<li>von Kockritz-Blickwede, M., Rohde, M., Oehmcke, S., Miller, L. S., Cheung, A. L., Herwald, H., Foster, S., Medina, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+mechanisms+underlying+the+genetic+predisposition+to+severe+Staphylococcus+aureus+infection+in+the+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Immunological mechanisms underlying the genetic predisposition to severe Staphylococcus aureus infection in the mouse model.</a> Am J Pathol. 173, 1657-1668 (2008).</li>
</ol>

Geen belangenverstrengeling gemeld.

<ol>
<li>Het muismodel voor huid- en weke deleninfecties is een krachtig instrument voor de in vivo virulentiebeoordeling van een pathogeen. De pathogeniciteit van S. aureus bij huid- en weke deleninfecties kan variëren afhankelijk van een aantal parameters. Deze omvatten de inoculumgrootte, de bacteriële groeifase, de inbrengdiepte, de leeftijd van de muizen en de genetische achtergrond van de muis 7, 8. Bij het onderzoeken van de virulentiefunctie met behulp van dit model is het cruciaal om deze parameters te con...

<table><tbody><tr><td>THB</td><td>VWR international</td><td>95025-314</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Invitrogen</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>1 ml spuit</td><td>BD Biosciences</td><td>309602</td><td></td></tr><tr><td>27G1/2 naald</td><td>BD Biosciences</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>Schaapenbloedagar (TSA)</td><td>VWR international</td><td>90004-328</td><td></td></tr></tbody></table>

subcutane infectie van methicilline resistente staphylococcus aureus (mrsa)

Subcutaneous Infection of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA)

MRSA vormt een wereldwijde bedreiging voor de volksgezondheid, en huid- en weke deleninfecties door MRSA zijn in de Verenigde Staten inmiddels verantwoordelijk voor meer dan de helft van alle weke deleninfecties. Onder de weke deleninfecties worden myositis, pyomyositis en necrotiserende fasciitis steeds vaker gemeld in verband met MRSA die vanuit de gemeenschap is ontstaan. Om de wisselwerking tussen MRSA en de immuniteit van de gastheer die leidt tot ernstigere infecties te begrijpen, is de beschikbaarheid van diermodellen cruciaal, aangezien deze de studie van gastheer- en bacteriële factoren mogelijk maken. Er zijn verschillende infectiemodellen geïntroduceerd om de pathogenese van S. aureus tijdens oppervlakkige huidinfecties te beoordelen. Hier beschrijven wij een subcutaan infectiemodel dat de pathologieën van de huid, het subcutane weefsel en de spieren onderzoekt.

Een muismodel voor huid- en weke deleninfecties wordt gebruikt om de virulentiefunctie van methicilline-resistente Staphylococcus aureus (MRSA) en de immunologische respons van de gastheer te beoordelen. Hier presenteren wij een subcutaan infectiemodel voor huid- en weke deleninfecties.

Subcutane Infectie van Methicilline Resistente Staphylococcus Aureus (MRSA)

MRSA vormt een wereldwijde bedreiging voor de volksgezondheid, en huid- en weke deleninfecties door MRSA zijn nu verantwoordelijk voor meer dan de helft van alle weke deleninfecties in de ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om de overleving en verspreiding van methicilline-resistente Staphylococcus aureus of MRSA te onderzoeken, evenals de chemokine- en cytokineniveaus op de infectieplaatsen. Dit wordt bereikt door de vacht op de ruggen van muizen te verwijderen om een duidelijk observatiegebied te creëren. Als tweede stap.MRSA in een suspensie wordt drie dagen na infectie subcutaan aan muizen toegediend; infectiepathologieën en bacteriële aantallen kunnen worden beoordeeld door het aantal colony forming units uit weefselhomogenaten op agarplaten te bepalen. Hallo, hoe gaat het met u? Mijn naam is De Lordon.Ik ben een postdoctoraal onderzoeker. Hallo, mijn naam is Mariel Sanchez. Ik ben een PhD-student en ik ben Andrea Huda.Ik ben een onderzoeksmedewerker en we maken deel uit van het laboratorium van George Lee in de afdeling pediatrie van het Cedar-Sinai Medical Center. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het medische veld, zoals de modellering van ernstige infecties, waaronder myositis, polymyositis en necrotiserende fascitis. Hoewel deze methode inzicht kan verschaffen in ernstige acute infecties, kan deze ook worden toegepast op andere systemen, zoals groep A streptokokken en andere organismen.Daarnaast kunnen we de functie en pathogenese bestuderen van andere organismen die myositis en polymyositis veroorzaken. Over het algemeen kunnen personen die nieuw zijn met deze procedure moeite hebben, omdat een van de medewerkers van caucusgebieden globale regulator zeer muteerbaar is. Als er geen voorzorgsmaatregelen worden genomen, kunnen de verzamelde gegevens een aanzienlijke variatie vertonen, wat ertoe zal leiden dat de gegevens moeilijk te interpreteren zijn.Laten we beginnen. Bereid in een BSL-2 faciliteit een schapenbloedagarplaat in TSA-basis en een steriele lus met behulp van een vriesblok voor. Haal de Mercer-stammencultuur uit de opslag bij -80 °C.Breek vervolgens met de steriele loot een klein ijsfragment van de stockcultuur af op de plaat. Plaats de stockcultuur direct nadat er een klein fragment van de Mercer-stockcultuur is verkregen terug in de vriezer om ontdooiing te voorkomen, aangezien herhaaldelijk vriezen en ontdooien de stockcultuur beschadigt. Gebruik de loot om de agar uit te strijken om de groei van individuele Mercer-kolonies te faciliteren.Incubeer de plaat gedurende de nacht bij 37 °C zonder CO2-toevoeging. Bereid de volgende dag een nieuwe blood agar-plaat, een TSA-plaat en een snap-cap buis van 15 ml met 3 ml THB voor en label deze.Haal de overnight gecultiveerde M SSA-plaat uit de incubator en onderzoek het hemolytisch fenotype van de kolonies. Kies met een steriele lus een kolonie die een fenotype heeft dat consistent is met eerdere experimentele kolonies. Inoculeer het THB met de geselecteerde kolonie met behulp van dezelfde lusstreekmethode.Incubeer de THB-oplossing op de plaat gedurende de nacht bij 37 °C met schudden op 220 toeren per minuut. Deze bacteriën zullen worden gebruikt om de cultuur te inoculeren voor subcutane infectie van de muizen in latere stappen. Plaats de bloedagarplaat eveneens in de incubator.De plaat wordt de volgende ochtend gebruikt om te bevestigen dat het hemolytisch fenotype van de bacteriën in de THB-oplossing overeenkomt met dat van de oorspronkelijk geselecteerde kolonie. Als het hemolysefenotype niet consistent is met de oorspronkelijke kloon, mag het experiment niet worden gestart. Plaats de muis op een platform en scheer de vacht op de rug.Als het dier overmatig agressief is, kan sedatie met isofluraan noodzakelijk zijn. Breng ongeveer vijf kubieke millimeter ontharingscrème, zoals NA, aan op het geschoren gebied. NA kan worden gekocht bij de lokale drogist.Zorg ervoor dat u de ontharingscrème met babyolie aanschaft, omdat het product zonder babyolie te stimulerend zal zijn voor de muizen. Laat de crème ongeveer één minuut inwerken op het huidoppervlak; terwijl de ontharingscrème inwerkt, maakt u een paar papieren handdoeken nat met dubbel gedestilleerd water. Gebruik de natte papieren handdoeken om het geschoren gebied schoon te vegen.Zorg ervoor dat de huid vrij is van de ontharingscrème. Voorverwarm 10 milliliters THB in een 50 milliliter schroefdopbuisje bij 37 °C in een bacteriële incubator gedurende vier tot 10 uur. Breng 20 µL van de overnight bacteriecultuur over naar de voorverwarmde THB. Dit zal de overnight merc verdunnen.Een suspensie op 1:500. Plaats de buis bij 37 °C in een schudincubator op 220 rpm gedurende ongeveer tweeënhalve tot drie uur. Gebruik meer THB om de bacteriële suspensie verder te verdunnen tot 1:10 en meet de suspensie met een spectrofotometer.Met absorptie bij 514 nanometer. Blijf de suspensie incuberen bij 37 °C met schudden op 220 toeren per minuut totdat de 1:10 verdunde suspensie 0,25 bereikt. Om de cellen te verzamelen, centrifugeer de 50 milliliter buis bij 3.225 ×g gedurende 10 minuten bij 4 °C, verwijder het supernatant en resuspendeer.Suspendeer de bacteriële pellet in 10 milliliter DPBS en was de bacteriën opnieuw door de centrifugatiestap te herhalen voor dit ernstige infectiemodel. Resuspendeer de bacteriële pellet in ongeveer één milliliter DPBS, resulterend in ongeveer 1 × 10¹⁰ colony forming units per milliliter. Bereid schapenbloed A-R-T-S-A platen voor en verdun de bacteriën serieel van 10¹ tot 10⁸ in DPBS op de platen.Pipetteer druppels van 10 µL van de serieel verdunde bacteriële suspensie in triplo op een bloedagarplaat. Incubeer de platen gedurende de nacht bij 37 °C. Observeer en noteer na een incubatietijd van 16 tot 18 uur het hemolysefenotype van het inoculuum.Tel de colony forming units op de platen. De infectieuze dosis van het inoculum wordt berekend op basis van het aantal colony forming units op de platen.Bereid een spuit voor met 100 µL van de eerder bereide bacteriële suspensie in DPBS. Vóór de injectie moeten de muizen gesedeerd worden zodat hun ademhalingssnelheid ongeveer één keer per seconde is. Ter demonstratie wordt in deze video een geëuthanaseerde muis getoond.Injecteer het M serum in één flank na de injectie. Plaats de muis terug in de kooi. Observeer de dieren gedurende drie tot vijf uur na de injectie om er zeker van te zijn dat de muis in leven is voordat deze wordt teruggebracht naar de dierruimte.Controleer de laesies op de ruggen van de dieren dagelijks nadat de dieren zijn geofferd. Meet en noteer de grootte en de conditie van de laesies op de huid. Zowel de laesiegebieden op de huid als in de spieren worden gekwantificeerd door de lengte en breedte van de laesie in millimeters met elkaar te vermenigvuldigen.Onregelmatig gevormde laesies moeten worden opgedeeld in kleinere symmetrische stukken, waarbij elk stuk met dezelfde methode wordt gemeten. Bereid 1,5 milliliter microcentrifugebuisjes voor met 100 microliters DPBS voor de weefselverzameling. Maak een sneetje in de huid met een steriel scheermesje en excideer de laesie met een steriele schaar.Zorg er bij het excideren van de laesie voor dat er ook ongeveer twee tot vijf millimeter gezond weefsel rondom het gebied wordt weggenomen. Plaats de laesie in de weefselopvangbuisjes voor het analyseren van de spierlaesies. Pel de huid voorzichtig af om de grootte te meten en de conditie van de laesie op het spierweefsel te registreren.Verzamel de milt en de nieren. Plaats deze weefsels in hun eigen individuele collectiebuisjes. Homogeniseer de weefsels door ongeveer 30 seconden lang te agiteren met een spuit van één milliliter.Voeg 900 µL DPBS toe aan elke buis. Stel de THA-platen samen en vortex de gehomogeniseerde weefselmonsters gedurende vijf minuten. Verdun het monster serieel.Maak suspensies van 1 tot 10⁶. Breng in 96-wells platen 10 µL van elke serieel verdunde suspensie over op de platen. Incubeer de platen gedurende de nacht in een bacteriële incubator bij 37 °C.Tel de volgende ochtend de colony forming units op de platen en bereken het aantal colony forming units op basis van de verdunningsfactoren. Als de infectie correct is uitgevoerd, zal er onmiddellijk na de subcutane injectie een blep op het huidoppervlak waarneembaar zijn. Indien er geen blep wordt waargenomen, kan de injectie te diep zijn, wat de uitkomst van de infectie kan beïnvloeden.De grootte van de laesies en het bacteriële overleven kunnen op verschillende tijdstippen na infectie met MSA worden beoordeeld. De volgende huidlaesies werden onderzocht op dag drie na de infectie en zijn voorbeelden van een laesie bij een CD1-muis die aan één flank is geïnfecteerd met 1 x 10⁷ colony forming units. Spierlaesies worden gewoonlijk aangetroffen in het weefsel onder de huidlaesies.Hieronder volgen voorbeelden van de overeenkomstige spieroppervlaktelaesies bij de eerder getoonde foto's van huidlaesies. Dit zijn spierlaesies waargenomen op dag drie na infectie bij een muis die is geïnfecteerd met 1 × 10⁷ colony forming units. Het laesieoppervlak wordt bepaald als de lengte maal de breedte van de laesie, gemeten in millimeters, en kan worden gemeten om de weefselschade van de huid te beoordelen.Het aantal colony forming units van de bacteriën die zich op de infectieplaats bevinden, kan worden gekwantificeerd in uitgesneden laesies. Het aantal colony forming units kan aangeven of een virulentiefactor de MSA een overlevingsvoordeel biedt. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om rekening te houden met de standaard veiligheidsmaatregelen vanwege het gebruik van naalden en zeer pathogene microben tijdens deze procedure.Ten slotte kan een inoculum dat 1.000 keer lager is dan in ons abcesmodel worden gebruikt om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals welke S-factoren een persistente RSA-infectie bevorderen? Vergeet niet dat het werken met spuiten gevuld met Mars A extreem gevaarlijk kan zijn; neem voorzorgsmaatregelen zoals het direct weggooien van de spuit in de naaldencontainer om accidenteel prikken met de naald te voorkomen. Daarnaast is het voor dit experiment belangrijk om de standaard BSO2-protocollen te volgen om een juiste desinfectie van het werkgebied te waarborgen.Dat is alles. Bedankt voor het kijken. Hoi. Hoi, tot ziens.

subcutaneous-infection-methicillin-resistant-staphylococcus-aureus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Experimentele rat endocarditis model veroorzaakt door...

Experimentele Endocarditis Model van Methicilline Resistente<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; (MRSA) in Rat

Lytische faag biosensoren en antilichaam kralen zijn in staat onderscheid te maken tussen methicilline resistente (MRSA) en gevoelige stafylokok bacteriën. De fagen werden geïmmobiliseerd door een Langmuir-Blodgett methode op een oppervlak van een kwartskristal microbalans sensor en werkte als breed staphylococcus probes. Antilichaam kralen herkennen MRSA.

Biosensor voor de detectie van antibiotica resistente Staphylococcus bacteriën

Een aanpak wordt beschreven voor real-time detectie van de ingeboren immune reactie op het verwonden van cutane en Staphylococcus aureus -infectie van muizen. Door vergelijking LysM-EGFP muizen (die bezitten fluorescerende neutrofielen) met een LysM-EGFP gekruist immunodeficiëntie muis stam, we vooraf ons begrip van de infectie en de ontwikkeling van benaderingen ter bestrijding van de infectie.

Een muismodel te beoordelen ingeboren immuunreactie op Staphylococcus aureus -infectie

Het huidige protocol bereidt en evalueert de fysieke eigenschappen, immuunrespons en in vivo beschermend effect van een nieuw nano-emulsie-adjuvans vaccin.

Evaluatie van de immuunrespons van een nano-emulsie-adjuvansvaccin tegen methicilline-resistente Staphylococcus aureus (MRSA) -infectie

Staphylococcus aureus (S. aureus) heeft het vermogen om zich door het lichaam te verspreiden en aanhoudende en terugkerende infecties te veroorzaken. Om deze processen beter te begrijpen, stelt deze studie een intracellulair infectiemodel op voor S. aureus. Dit model zal een cruciale basis vormen voor het onderzoeken van de mechanismen achter intracellulaire infecties.

Ontwikkeling en beoordeling van intracellulaire infectiemodellen voor Staphylococcus aureus

Het huidige protocol beschrijft een muismodel dat gebruik maakt van subcutane dorsale implantatie om implantaat-geassocieerde infecties te onderzoeken, waardoor uitgebreid onderzoek naar pathofysiologische mechanismen mogelijk wordt en de ontwikkeling van diagnostische criteria met gerichte therapeutische strategieën wordt ondersteund.

Diermodel van implantaat-geassocieerde infecties bij muizen

Protocollen voor het gebruik van open systeem stroom biofilms met drip stroom reactoren en roterende schijf reactoren worden in detail.

Het gebruik van Drip Flow en roterende schijf reactoren voor Staphylococcus aureus Biofilm Analyse

Staphylococcus aureus Growth met humaan hemoglobine als een ijzerbron

We demonstreren een eenvoudige multiplex PCR-test voor snel screenen en typeren van Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) typen I-V voor methicilline-resistente Staphylococcus aureus, en bieden enkele van de essentiële stappen en procedurele nuances die het succesvol maken om deze test aan te passen aan individuele laboratoria.

Multiplex PCR-test voor het typen van Staphylococcus Cassette Chromosome Mec Types I tot en met V in Methicilline-resistente<em&gt; Staphylococcus aureus</em

We methode om het effect van PSMs en andere toxines uitgescheiden door...

Studeren Interacties van<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Met Neutrofielen door flowcytometrie en Time Lapse Microscopie

Leer een murien huidinfectiemodel voor MRSA-virulentie en immunologische responsanalyse. Deze methode kwantificeert bacteriële belasting en cytokines bij Staphylococcus aureus infecties.

Subcutane Infectie van Methicilline Resistente Staphylococcus Aureus (MRSA)

Meer video's verkennen