Transformatie van plasmide DNA in E. coli Met behulp van de heat shock-methode
1 augustus 2007
Hoi, ik ben Alex Hoge. Ik werk in het gym Hall Lab van de afdeling Fysiologie en Biofysica aan de University of California Irvine. Vandaag ga ik u laten zien hoe u elektrisch competente e coli kunt transformeren met de elektroporatiemethode.
Vandaag gebruik ik deze techniek om coli te transformeren met mijn ligatieproduct, omdat ik een probe maak voor whole mount in situ hybridisatie in zebravissen. Oké, we gaan nu beginnen met de transformatie. Eerst moet u uw waterbad of droge bad op 42 °C hebben.
De bacteriën die u zojuist uit de hoofdstock heeft gehaald, moeten in ijs bewaard worden. Vandaag gebruiken we elektrocompetente cellen uit stocks en ook uw DNA in ijs. Daarnaast heeft u een buisje SOC-medium op kamertemperatuur of 37 °C nodig en uw platen met LB-medium plus antibioticum.
Ik ga nu het DNA toevoegen aan de bacteriën. Ik werk naast de vlam om contaminatie van de bacteriën te voorkomen. Vervolgens voeg ik de vloeistof met de bacteriën toe.
Voeg 50 µL bacteriën toe en plaats de buisjes onmiddellijk terug in het ijs; u kunt licht tikken om de bacteriën en uw DNA te mengen en dit tot 15 minuten in het ijs laten staan. Er zijn nu 15 minuten verstreken en we zijn klaar voor de hitteshok, waarbij de bacteriën 45 seconden lang op 42 °C worden geplaatst. Ik haal de buisjes uit het ijs, plaats ze direct in het bad van 42 °C, zet de timer op 45 seconden en plaats ze vervolgens zeer snel terug in het ijs; direct van 42 °C naar het ijs.
Daarna wachten we twee minuten. Nu ga ik het SOC-medium aan de bacteriën toevoegen en deze gedurende 30 minuten op 37 °C plaatsen. Ik pipetteer 500 µL van het SOC-medium, voeg dit toe aan de bacteriën en plaats ze in mijn kleine geïmproviseerde kamer.
Als u eend-buisjes en een geïmproviseerde kamer voor uw incubator gebruikt, zorg er dan voor dat u de eend-buisjes horizontaal plaatst, omdat ze zo veel beter schudden. We zijn nu klaar om de buisjes in de shaker te plaatsen. Daarom gebruiken we deze kleine kamer op 37 °C gedurende 30 minuten.
Nu de incubatie bij 37 °C is voltooid, gaan we de bacteriën uitplaten op LB plus antibiotica. In mijn geval is dit chloramphenicol. Ik breng 50 µL van elk monster aan op de plaat.
Centrifuge vervolgens de resterende 500 µL in een kleine tafelcentrifuge om de bacteriën te pelletteren. Na centrifugatie verkrijgen we een mooie pellet; we gaan nu bijna al het SOC-medium verwijderen en laten slechts 50 µL achter, zodat we deze 50 µL geconcentreerde bacteriën kunnen uitplaten. Ik pipetteer ongeveer 450 µL weg.
Ik laat dit volume over. Nu ga ik het pellet resuspenderen in de resterende 50 µL SOC-medium. Daarna kan ik deze 50 µL uitplaten op een andere plaat.
Vervolgens centrifugeer ik elk pellet, resuspendeer ik het en breng ik het over op een plaat. Aan het einde zijn er dus twee platen per monster. Nu moeten we de bacteriën uitplaten op de LB-plaat.
Ik ga hiervoor geautoclaveerde glazen kraaltjes gebruiken, maar u kunt ook een pipetpast gebruiken die u in de vorm van een spreader buigt. Ik plaats nu een paar kraaltjes op de Petrischaal. Dat is wat ik prettig vind.
Nou, 10 15. Nadat u de kraaltjes heeft toegevoegd, stapelt u alle platen op deze manier en schudt u ze voorzichtig zodat de kraaltjes de bacteriën gelijkmatig over de platen verspreiden. Ik beweeg de platen totdat ze droog zijn.
Dit betekent dat u geen grote vloeistofstrepen zou moeten zien wanneer u met de kraaltjes beweegt. In die plaat hebben de kraaltjes bijvoorbeeld de neiging om samen te klonteren en zijn er veel strepen te zien. Bij deze is het nat, de kraaltjes bewegen vrij; deze is droog.
De platen zijn nu droog, dus de kralen kunnen worden weggegooid. Ik trek ze er zo uit zodat ze gerecycled kunnen worden. We plaatsen de plaat nu in de incubator bij 37 °C voor de nacht, waarbij u de platen ondersteboven plaatst. Na 12 uur incubatie bij 37 °C halen we de plaat uit de incubator.
En zoals we kunnen zien, hebben we minder kolonies op de plaat waar ik 50 µL heb geplaatst dan op de plaat waar ik de rest heb geplaatst. Wat belangrijk is bij het transformeren van bacteriën, is dat u de juiste hoeveelheid kolonies op uw plaat heeft, de juiste dichtheid. Op deze plaat zijn er zeer weinig kolonies, maar als u meer kolonies wilt, vindt u een goed voorbeeld op deze plaat waar de dichtheid precies goed is, ongeveer 100 kolonies per plaat.
Deze plaat is een slecht voorbeeld omdat er te veel kolonies zijn en individuele kolonies niet kunnen worden gepickt. Ik heb u dus laten zien hoe u e coli transformeert via elke transformatiemethode. Het zeer belangrijke aspect van deze techniek is om alles ijskoud te houden vóór de shock.
Vervolgens 45 seconden normaal, meer bij 42 graden en terug in het ijs. En daarna moet alles op een warme temperatuur of 37 graden staan. Nu ga ik mijn kolonies screenen via PCR-screening.
Een van de doelen is dus om twee platen te hebben. Bij de ene verwachten we veel kolonies en bij de andere minder kolonies. Het is belangrijk dat de platen zeer droog zijn door gebruik te maken van kralen of een pipetpunt.
Bedankt voor het kijken en veel succes met uw bevestiging.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze video demonstreert de transformatie van elektrisch competente E. coli met behulp van de heat shock-methode. De techniek wordt toegepast om E. coli voor te bereiden op verdere experimenten met zebravisjes.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Microbiologie
- Genetische modificatie
- Celbiologie
Achtergrond
- Transformatie is een methode die wordt gebruikt om vreemd DNA in bacteriële cellen te introduceren.
- Hitteschok is een veelgebruikte techniek om de permeabiliteit van het bacteriële celmembraan te verhogen.
- Deze methode is essentieel voor diverse toepassingen in de moleculaire biologie.
- Zebravisjes worden vaak gebruikt als modelorganisme in studies naar ontwikkelingsbiologie.
Doel van de studie
- Om de hitte-shockmethode voor de transformatie van E. coli te demonstreren.
- Om E. coli voor te bereiden op daaropvolgende experimenten met zebravissen.
- Om een visuele handleiding te bieden voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in genetische transformatietechnieken.
Gebruikte methoden
- Bereiding van competente E. coli-cellen.
- Toepassing van hitte-shock bij 42 °C.
- Gebruik van een waterbad of dry block voor temperatuurregeling.
- Introductie van plasmid-DNA in de competente cellen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle transformatie van E. coli met het gewenste plasmide.
- Demonstratie van de effectiviteit van de heat shock-techniek.
- Voorbereiding van E. coli voor verdere analyse in zebrafish-studies.
- Visuele bevestiging van de transformatie-efficiëntie.
Conclusies
- De hitte-shockmethode is een betrouwbare techniek voor de transformatie van E. coli.
- Deze methode kan worden toegepast in diverse genetische manipulatie-applicaties.
- Het begrijpen van deze techniek is cruciaal voor onderzoekers in de moleculaire biologie.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie
De hitte-shock transformatiemethode maakt een betrouwbare aflevering van plasmide-DNA in E. coli mogelijk, een fundamentele stap voor het construeren van genetische instrumenten die worden gebruikt bij targetvalidatie en assayontwikkeling. Deze techniek ondersteunt vroege discovery-workflows door recombinante stammen te genereren voor fenotypische screening en mechanistische risicoreductie in ziekterelevante systemen. De standaardisatie en reproduceerbaarheid ervan verhogen het voorspellende vertrouwen in lead-identificatiepipelines.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk via plasmide-gebaseerde genexpressie of knockdown in bacteriële systemen.
- Operationele waarde: Biedt een schaalbare methode voor het genereren van clonale bibliotheken om de targetfunctie en padmodulatie te beoordelen.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Produceert getransformeerde E. coli die geschikt is voor het bereiden van plasmidenbibliotheken voor gebruik in high-throughput screeningcampagnes.
- Operationele waarde: Levert kwantitatieve, reproduceerbare resultaten via kolonietelling op selectieve media, wat bijdraagt aan de standaardisatie van assays.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Faciliteert de constructie van reporterstammen of sensorsystemen voor het monitoren van padactiviteit in preklinische modellen.
- Operationele waarde: Ondersteunt de continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door betrouwbare DNA-propagatie voor in vivo studies mogelijk te maken.
Integratie van pipeline en workflow
De hitte-shockmethode past binnen het ontdekkingscontinuüm en dient als een cruciale stap tussen doelwitidentificatie en leadgeneratie door DNA-manipulatie voor functionele validatie mogelijk te maken.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing via plasmidentransformatie om genfuncties in bacteriële expressiesystemen te beoordelen.
- Screening: Maakt assay-gereedheid mogelijk door gestandaardiseerde preparatie van competente cellen en transformatie van DNA-bibliotheken.
- Analytica: Levert kwantitatieve metrieken voor transformatie-efficiëntie via het tellen van colony-forming units, waardoor vergelijking van DNA-constructen mogelijk wordt.
- Translationeel onderzoek: Sluit aan bij preklinisch werk door plasmiden-DNA te genereren voor gebruik in zoogdier- of zebravismodellen, zoals aangetoond in de bron.
- Enterprise-hergebruik: Vertegenwoordigt een herbruikbare platformcapaciteit voor genetische manipulatie over meerdere projecten en therapeutische gebieden.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het vertrouwen in de validatie van targets door nauwkeurige genetische manipulatie in microbiële systemen mogelijk te maken.
- Operationele waarde: Waarborgt de reproduceerbaarheid door gestandaardiseerde hittechokparameters (42°C gedurende 45 seconden) en herstelprotocollen.
- Strategische waarde: Vermindert het biologische risico bij de identificatie van lead-verbindingen door betrouwbare toegang tot gemodificeerde stammen voor downstream screening te bieden.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering door de consistente generatie van gevalideerde genetische instrumenten.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist aseptische techniek en ervaring met de omgang met bacteriën om contaminatie te voorkomen.
- Afhankelijk van toegang tot temperatuurgecontroleerde apparatuur (waterbad of dry block) voor een precieze hitte-shock.
- Vereist standaardisatie van SOC-medium en antibioticaplaten tussen teams voor consistente resultaten.
- Aanpassingen kunnen nodig zijn bij het gebruik van verschillende bacteriële stammen of plasmideconstructen, aangezien de efficiëntie kan variëren.
- Praktische beperking: De transformatie-efficiëntie is afhankelijk van de DNA-kwaliteit en de competentie van de cellen, wat optimalisatie vereist voor plasmiden die moeilijk te transformeren zijn.
