Name: Transformatie van plasmide DNA in E. coli Met behulp van de heat shock-methode (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-08-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Leer de heat shock-methode voor transformatie van plasmide DNA in E. coli. Deze techniek bereidt bacteriën voor op genetische experimenten met zebrafish in ontwikkelingsbiologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

transformatie van plasmide dna in e. coli met behulp van de heat shock-methode

Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method

Transformatie van plasmide DNA in E. coli met behulp van de heat shock-methode is een basistechniek van de moleculaire biologie. Het bestaat uit het plaatsen van een buitenlandse plasmide of ligatieproduct in bacteriën. Deze video protocol beschrijft de traditionele methode van transformatie met behulp van commercieel verkrijgbare chemisch bevoegde bacteriën van Genlantis. Na een korte incubatie in ijs, is een mengsel van chemisch bevoegde bacteriën en DNA geplaatst bij 42 ° C gedurende 45 seconden (heat shock) en dan weer terug geplaatst in ijs. SOC media is toegevoegd en de getransformeerde cellen worden geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 30 min met agitatie. Worden verzekerd van het isoleren van kolonies onafhankelijk van transformatie-efficiëntie, zijn twee grootheden van de getransformeerde bacteriën verguld. Deze traditionele protocol met succes kan worden gebruikt om de meeste commercieel beschikbare bevoegde bacteriën te transformeren. De turbocells van Genlantis kan ook gebruikt worden in een nieuwe 3-minuten transformatie protocol, beschreven in de handleiding.

Transformatie van plasmide DNA in E. coli Met behulp van de heat shock-methode

Transformatie van plasmid-DNA in E. coli met behulp van de heatshock-methode is een basistechniek in de moleculaire biologie. Het bestaat uit het inbrengen van een vreemd ...

Hoi, ik ben Alex Hoge. Ik werk in het gym Hall Lab van de afdeling Fysiologie en Biofysica aan de University of California Irvine. Vandaag ga ik u laten zien hoe u elektrisch competente e coli kunt transformeren met de elektroporatiemethode.Vandaag gebruik ik deze techniek om coli te transformeren met mijn ligatieproduct, omdat ik een probe maak voor whole mount in situ hybridisatie in zebravissen. Oké, we gaan nu beginnen met de transformatie. Eerst moet u uw waterbad of droge bad op 42 °C hebben.De bacteriën die u zojuist uit de hoofdstock heeft gehaald, moeten in ijs bewaard worden. Vandaag gebruiken we elektrocompetente cellen uit stocks en ook uw DNA in ijs. Daarnaast heeft u een buisje SOC-medium op kamertemperatuur of 37 °C nodig en uw platen met LB-medium plus antibioticum.Ik ga nu het DNA toevoegen aan de bacteriën. Ik werk naast de vlam om contaminatie van de bacteriën te voorkomen. Vervolgens voeg ik de vloeistof met de bacteriën toe.Voeg 50 µL bacteriën toe en plaats de buisjes onmiddellijk terug in het ijs; u kunt licht tikken om de bacteriën en uw DNA te mengen en dit tot 15 minuten in het ijs laten staan. Er zijn nu 15 minuten verstreken en we zijn klaar voor de hitteshok, waarbij de bacteriën 45 seconden lang op 42 °C worden geplaatst. Ik haal de buisjes uit het ijs, plaats ze direct in het bad van 42 °C, zet de timer op 45 seconden en plaats ze vervolgens zeer snel terug in het ijs; direct van 42 °C naar het ijs.Daarna wachten we twee minuten. Nu ga ik het SOC-medium aan de bacteriën toevoegen en deze gedurende 30 minuten op 37 °C plaatsen. Ik pipetteer 500 µL van het SOC-medium, voeg dit toe aan de bacteriën en plaats ze in mijn kleine geïmproviseerde kamer.Als u eend-buisjes en een geïmproviseerde kamer voor uw incubator gebruikt, zorg er dan voor dat u de eend-buisjes horizontaal plaatst, omdat ze zo veel beter schudden. We zijn nu klaar om de buisjes in de shaker te plaatsen. Daarom gebruiken we deze kleine kamer op 37 °C gedurende 30 minuten.Nu de incubatie bij 37 °C is voltooid, gaan we de bacteriën uitplaten op LB plus antibiotica. In mijn geval is dit chloramphenicol. Ik breng 50 µL van elk monster aan op de plaat.Centrifuge vervolgens de resterende 500 µL in een kleine tafelcentrifuge om de bacteriën te pelletteren. Na centrifugatie verkrijgen we een mooie pellet; we gaan nu bijna al het SOC-medium verwijderen en laten slechts 50 µL achter, zodat we deze 50 µL geconcentreerde bacteriën kunnen uitplaten. Ik pipetteer ongeveer 450 µL weg.Ik laat dit volume over. Nu ga ik het pellet resuspenderen in de resterende 50 µL SOC-medium. Daarna kan ik deze 50 µL uitplaten op een andere plaat.Vervolgens centrifugeer ik elk pellet, resuspendeer ik het en breng ik het over op een plaat. Aan het einde zijn er dus twee platen per monster. Nu moeten we de bacteriën uitplaten op de LB-plaat.Ik ga hiervoor geautoclaveerde glazen kraaltjes gebruiken, maar u kunt ook een pipetpast gebruiken die u in de vorm van een spreader buigt. Ik plaats nu een paar kraaltjes op de Petrischaal. Dat is wat ik prettig vind.Nou, 10 15. Nadat u de kraaltjes heeft toegevoegd, stapelt u alle platen op deze manier en schudt u ze voorzichtig zodat de kraaltjes de bacteriën gelijkmatig over de platen verspreiden. Ik beweeg de platen totdat ze droog zijn.Dit betekent dat u geen grote vloeistofstrepen zou moeten zien wanneer u met de kraaltjes beweegt. In die plaat hebben de kraaltjes bijvoorbeeld de neiging om samen te klonteren en zijn er veel strepen te zien. Bij deze is het nat, de kraaltjes bewegen vrij; deze is droog.De platen zijn nu droog, dus de kralen kunnen worden weggegooid. Ik trek ze er zo uit zodat ze gerecycled kunnen worden. We plaatsen de plaat nu in de incubator bij 37 °C voor de nacht, waarbij u de platen ondersteboven plaatst. Na 12 uur incubatie bij 37 °C halen we de plaat uit de incubator.En zoals we kunnen zien, hebben we minder kolonies op de plaat waar ik 50 µL heb geplaatst dan op de plaat waar ik de rest heb geplaatst. Wat belangrijk is bij het transformeren van bacteriën, is dat u de juiste hoeveelheid kolonies op uw plaat heeft, de juiste dichtheid. Op deze plaat zijn er zeer weinig kolonies, maar als u meer kolonies wilt, vindt u een goed voorbeeld op deze plaat waar de dichtheid precies goed is, ongeveer 100 kolonies per plaat.Deze plaat is een slecht voorbeeld omdat er te veel kolonies zijn en individuele kolonies niet kunnen worden gepickt. Ik heb u dus laten zien hoe u e coli transformeert via elke transformatiemethode. Het zeer belangrijke aspect van deze techniek is om alles ijskoud te houden vóór de shock.Vervolgens 45 seconden normaal, meer bij 42 graden en terug in het ijs. En daarna moet alles op een warme temperatuur of 37 graden staan. Nu ga ik mijn kolonies screenen via PCR-screening.Een van de doelen is dus om twee platen te hebben. Bij de ene verwachten we veel kolonies en bij de andere minder kolonies. Het is belangrijk dat de platen zeer droog zijn door gebruik te maken van kralen of een pipetpunt.Bedankt voor het kijken en veel succes met uw bevestiging.

transformation-of-plasmid-dna-into-e-coli-using-the-heat-shock-method

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Plaatsgerichte mutagenese van hele plasmiden is een eenvoudige manier om iets verschillende varianten van een origineel plasmide te creëren. Hier laten we zien op een eenvoudige en kosteneffectieve manier om de base substituties te introduceren in een plasmide met behulp van standaard reagentia.

Homemade plaatsgerichte mutagenese van Whole Plasmids

Source: Stefan, A., et al., The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates the procedure for transforming Escherichia coli with a plasmid carrying an antibiotic resistance gene, including cell preparation, electroporation, recovery, and selection of transformants.

Preparation and Transformation of Bacteria Using High-Voltage Electroporation

Dit protocol demonstreert de chaperonne-activiteit van heat shock protein 70 (Hsp70). E. coli dnaK756-cellen dienen als model voor de test omdat ze een inheemse, functioneel gehandicapte Hsp70 herbergen, waardoor ze vatbaar zijn voor hittestress. De heterologe introductie van functioneel Hsp70 redt de groeideficiëntie van de cellen.

Op Escherichia coli gebaseerde complementatietest om de chaperonnefunctie van heat shock-eiwit te bestuderen 70

In vivo assemblage is een ligatie-onafhankelijke kloneringsmethode die berust op intrinsieke DNA-reparatie-enzymen in bacteriën om DNA-fragmenten te assembleren door homologe recombinatie. Dit protocol is zowel tijd- als kosteneffectief, aangezien er weinig reagentia nodig zijn en de kloonefficiëntie kan oplopen tot 99%.

Gebruik van in vivo assemblage voor zeer efficiënte plasmideconstructie

Dit artikel beschrijft een methodologie voor het tot overexpressie brengen van recombinant Nsp15, een toxische nuclease, in een C41(DE3) expressiesysteem, gevolgd door zuivering van het gelabelde eiwit met behulp van affiniteits- en grootte-uitsluitingschromatografie. Deze protocollen kunnen worden aangepast voor andere uitdagende giftige eiwitten.

Overexpressie en zuivering van een toxische nuclease van Escherichia coli

Zuiveren Plasmide DNA van bacteriële kolonies Met behulp van de Qiagen Miniprep Kit

Dit werk laat zien hoe een RNA / DNA hybride vorm op de chromosomale niveau en onthullen de overdracht van genetische informatie van RNA naar DNA genoom in gistcellen.

Genereren van RNA / DNA-Hybriden in Genomic DNA door omzetting door middel RNA-bevattende Oligonucleotiden

We presenteren een procedure waarbij twee-dimensionale agarose-gel analyse kan worden gebruikt om de structuur van de replicatie tussenproducten die optreden na UV-straling te identificeren.

Visualisatie van UV-geïnduceerde Replicatie Intermediates in E. coli Met behulp van twee-dimensionale Agarose gel-analyse

Dit protocol is een kosteneffectief alternatief voor een efficiënte parallelle verduidelijking en plasmide DNA zuivering...

Gestroomlijnde Zuivering van Plasmide DNA Van Prokaryote culturen

Hier laten we zien een eenvoudig protocol om een ​​willekeurige mutant bibliotheek te creëren voor een bepaalde doelsequentie. We laten zien hoe deze methode, die in vivo uitgevoerd in Escherichia coli, kan worden gecombineerd met functionele selecties van nieuwe enzymatische activiteiten evolueren.

Mutagenese en functionele selectie Protocollen voor Gerichte ontwikkeling van eiwitten in E. coli</em

Leer de heat shock-methode voor transformatie van plasmide DNA in E. coli. Deze techniek bereidt bacteriën voor op genetische experimenten met zebrafish in ontwikkelingsbiologisch onderzoek.

Transformatie van plasmide DNA in E. coli Met behulp van de heat shock-methode

Meer video's verkennen