Name: Genotypische Inferentie van HIV-1 tropisme de populatie-gebaseerde Sequencing van V3 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-27T18:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: Leer genotypische inferentie van HIV-1-tropisme met populatie-gebaseerde sequencing van de V3-regio. Deze bio-informatica methode classificeert virus als R5 of non-R5 voor behandelingsselectie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De ontwikkeling van deze test werd ondersteund door Viiv Healthcare en de Canadese Institutes of Health Research (CIHR) en door middel van een GlaxoSmithKline / CIHR leerstoel Klinische Virologie voor Dr Harrigan. Ondersteuning door Pfizer en ViiV Healthcare.

<ol><li>Feng, Y., Broder, C. C., Kennedy, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+entry+cofactor%3A+functional+cDNA+cloning+of+a+seven+transmembrane%2C+G+protein-coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">HIV-1 entry cofactor: functional cDNA cloning of a seven transmembrane, G protein-coupled receptor.</a> Science. 272, 872-877 (1996).</li>
<li>Dragic, T., Litwin, V., Allaway, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+entry+into+CD4%2B+cells+is+mediated+by+the+chemokine+receptor+CC-CKR-5%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">HIV-1 entry into CD4+ cells is mediated by the chemokine receptor CC-CKR-5.</a> Nature. 381, 667-673 (1996).</li>
<li>Dorr, P., Westby, M., Dobbs, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maraviroc+%28UK-427%2C857%29%2C+a+potent%2C+orally+bioavailable%2C+and+selective+small-molecule+inhibitor+of+chemokine+receptor+CCR5+with+broad-spectrum+anti-human+immunodeficiency+virus+type+1+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Maraviroc (UK-427,857), a potent, orally bioavailable, and selective small-molecule inhibitor of chemokine receptor CCR5 with broad-spectrum anti-human immunodeficiency virus type 1 activity.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 49, 4721-4732 (2005).</li>
<li>Gulick, R. M., Lalezari, J., Goodrich, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maraviroc+for+previously+treated+patients+with+R5+HIV-1+infection%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Maraviroc for previously treated patients with R5 HIV-1 infection.</a> N. Engl. J. Med. 359, 1429-1441 (2008).</li>
<li>Cooper, D. A., Heera, J., Goodrich, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maraviroc+versus+efavirenz%2C+both+in+combination+with+zidovudine%2Flamivudine%2C+for+the+treatment+of+antiretroviral-na%C3%ADve+subjects+with+CCR5-tropic+HIV-1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Maraviroc versus efavirenz, both in combination with zidovudine/lamivudine, for the treatment of antiretroviral-naíve subjects with CCR5-tropic HIV-1.</a> J. Infect. Dis. 201, 803-813 (2010).</li>
<li>Low, A. J., McGovern, R. A., Harrigan, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trofile+HIV+co-receptor+usage+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin.+Med.+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Trofile HIV co-receptor usage assay.</a> Expert Opin. Med. Diagnostics. 3, 181-191 (2000).</li>
<li>Sing, T., Low, A. J., Beerenwinkel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+HIV+co-receptor+usage+based+on+genetic+and+clinical+covariates%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Ther%22%5BJournal%5D)">Predicting HIV co-receptor usage based on genetic and clinical covariates.</a> Antiviral Ther. 12, 1097-1106 (2007).</li>
<li>Screening for HIV tropism using population-based V3 genotypic analysis: a retrospective virological outcome analysis using stored plasma screening samples from MOTIVATE-1. Harrigan, P. R., McGovern, R., Dong, W. 5th International AIDS Society Conference, 2009 19-22 July, Cape Town, South Africa, , (2009).</li>
<li>Optimization of clinically relevant cut-points for the determination of HIV co-receptor usage to predict maraviroc responses in treatment experienced (TE) patients using population V3 genotyping. Harrigan, P. R., McGovern, R., Dong, W. 12th European AIDS Conference, 2009 11-14 Nov, Cologne, Germany, , (2009).</li>
<li>Optimization of clinically relevant cutoffs for determining HIV co-receptor use by population and "deep" sequencing methods. Swenson, L. C., McGovern, R. A. 47th Annual Meeting of the Infectious Diseases Society of America, 2009 Oct 29 - Nov 1, Philadelphia, PA, USA, , (2009).</li>
<li>Phenotypic screening for HIV tropism versus both population-based and "deep" sequencing. Swenson, L., McGovern, R., Dong, W. 49th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2009 12-15 Sept, San Francisco, CA, , (2009).</li>
<li>Swenson, L. C., Moores, A., Low, A. J., Thielen, A., Dong, W., Woods, C., Jensen, M. A., Wynhoven, B., Chan, D., Glascock, C., Harrigan, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+Detection+of+CXCR4-Using+HIV+by+V3+Genotyping%3A+Application+of+Population-based+and+%27Deep%27+Sequencing+to+Plasma+RNA+and+Proviral+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Acquired+Immune+Deficiency+Syndromes%22%5BJournal%5D)">Improved Detection of CXCR4-Using HIV by V3 Genotyping: Application of Population-based and 'Deep' Sequencing to Plasma RNA and Proviral DNA.</a> Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. 54, 506-510 (2010).</li>
<li>Swenson, L. C., Boehme, R., Thielen, A., McGovern, R. A., Harrigan, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotypic+determination+of+HIV-1+tropism+in+the+clinical+setting%5BTitle%5D)+AND+%22HIV+Therapy%22%5BJournal%5D)">Genotypic determination of HIV-1 tropism in the clinical setting.</a> HIV Therapy. 4, 293-303 (2010).</li>
</ol>

P. Richard Harrigan heeft tegenstrijdige belangen van ViiV Healthcare, Virco, Merck, Abbott, en Quest. Deze video-artikel wordt gesponsord door ViiV Healthcare.

De methode hier wordt gepresenteerd is een standaard-sequencing methode toegepast op tropisme testen. De klinische toepassing van HIV enveloppe V3 lus sequencing van virale tropisme voorspellen is tot in de late beperkt. Deze methode is aangetoond, in retrospectieve analyses van de maraviroc (ViiV Healthcare) klinisch onderzoek, worden minimaal gelijke mate in staat om virale tropisme voorspellen in vergelijking met andere gevalideerde tests klinisch gebruikt. Er zijn veel voordelen aan het uitvoeren van genotypische analyse van de V3 lus voor tropisme voorspelling. Eerst en vooral, kan deze procedure worden uitgevoerd op elke faciliteit met operationele sequencing apparatuur, aanzienlijke verhoging van de toegankelijkheid en het verminderen van de doorlooptijd van tropisme testen. Ter vergelijking, is de fenotypische Enhanced Sensitivity Trofile Assay (ESTA) (Monogram Biosciences), die heeft gediend als de gouden standaard voor het tropisme testen, uitgevoerd in een centrum in Zuid-Californië. Bijkomende voordelen zijn onder andere de eis van minder uitgangsmateriaal en een minimaal vereist plasma viral load van 500copies/mL. Als goed, de operationele kosten van het uitvoeren van de genotypische test zijn relatief laag in vergelijking met die van een fenotypische test. Het gebruik van de Recall software in het bijzonder elimineert de noodzaak voor handmatige volgorde beoordeling, die meestal een arbeidsintensieve deel van genotype analyses. De hier gepresenteerde methode is vrij eenvoudig, zonder bijzondere stap opwegen tegen een ander in belang. We suggereren lopen PCR en sequencing in drievoud om de kansen van het vastleggen minderheid soorten te verhogen binnen de virale populatie van een steekproef. Repliceert meer dan drie kan worden uitgevoerd, maar we hebben gevonden triplo om zowel efficiënt en betrouwbaar. We stellen ook voor het gebruik van de One-Step reverse transcriptaseremmers PCR kit (Qiagen) die zowel RT-PCR en de eerste ronde PCR presteert in de dezelfde reactie met behoud van een hoge gevoeligheid en specificiteit.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;RNA-extractie met NucliSens easyMAG versie 1.0&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NucliSens easyMAG Magnetic Silica</td><td>bioMerieux</td><td>cat. # 280133</td><td>(48 x 0.6 ml)</td></tr><tr><td>NucliSens easyMAG Lysis Buffer</td><td>bioMerieux</td><td>cat. # 280134</td><td>(4 x 1000 ml)</td></tr><tr><td>NucliSens easyMAG Extraction Buffer 1</td><td>bioMerieux</td><td>cat. # 280130</td><td>(4 x 1000 ml)</td></tr><tr><td>NucliSens easyMAG Extraction Buffer 2</td><td>bioMerieux</td><td>cat. # 280131</td><td>(4 x 1000 ml)</td></tr><tr><td>NucliSens easyMAG Extraction Buffer 3</td><td>bioMerieux</td><td>cat. # 280132</td><td>(4 x 1000 ml)</td></tr><tr><td>NucliSens easyMAG versie 1.0 </td><td>bioMerieux</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biologische veiligheidskabinet Klasse II A2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;One-Step Reverse Transcriptase PCR en Second Round PCR&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DEPC-behandeld water</td><td>Ambion</td><td>cat. # 9922</td><td></td></tr><tr><td>SuperScrip III One-Step RT-PCR System with Platinum Taq High Fidelty</td><td>Invitrogen</td><td>cat#12574-035</td><td>Gebruikte kitcomponenten:&lt;br/&gt;- SuperScript III RT/ Platinum Taq High Fidelty Enzyme Mix&lt;br/&gt;- 2X Reaction Mix (een buffer met 0.4mM van elk dNTP, 2.4mM MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td></tr><tr><td>Expand High Fidelity PCR System</td><td>Roche Group</td><td>cat. # 1 759 078</td><td>Gebruikte kitcomponenten:- Expand High Fidelity Buffer 10X conc. met 15 mM MgCl2 (doppen gemarkeerd met 2)- Expand HF PCR Enzyme Mix (3.5U/&amp;#x03BC;l)- MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Stamoplossing (25mM) (doppen gemarkeerd met 4)</td></tr><tr><td>dNTPs: dATP, dGTP, dCTP, dTTP</td><td>Roche Group</td><td>cat. # 11969064001</td><td>(100 mM)</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>cat. # S0389-500G</td><td></td></tr><tr><td>Bromofenolblauw natriumzout</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>cat.# B5525</td><td></td></tr><tr><td>Cresolrood</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>cat.# 114472-5G</td><td>indicator-kwaliteit</td></tr><tr><td>Thermocycler </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Gelelektroforese&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50X TAE-buffer</td><td>Invitrogen</td><td>cat. # 24710030</td><td>(1000 ml) </td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA-gelkleuring</td><td>Invitrogen</td><td>cat. # S33102</td><td></td></tr><tr><td>Agarose (ultra zuiver)</td><td>Invitrogen</td><td>cat. # 15510-027</td><td></td></tr><tr><td>E-Gel Low Range Quantitative DNA Ladder</td><td>Invitrogen</td><td>cat. # 12373-031</td><td></td></tr><tr><td>Reagenskwaliteit Type II water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gel-apparatuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Sequencing&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit</td><td>Applied Biosciences</td><td>cat. # 4337458</td><td>(25000 reacties)</td></tr><tr><td>Hi-Di Formamide</td><td>Applied Biosciences</td><td>cat. # 4311320</td><td></td></tr><tr><td>Natriumacetaat (NaOAc)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>cat. # S-2889</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat.# 03690-100ML</td><td>0.5M, pH=8.0</td></tr><tr><td>TRIZMA Hydrochloride Bufferoplossing</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>cat. # T-2819</td><td>1 M, pH 9.0</td></tr><tr><td>Magnesiumchloride (MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>cat. # M-1028</td><td>1 M</td></tr><tr><td>95% Ethanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Running Buffer (10X) met EDTA</td><td>Applied Biosystems</td><td>cat. # 4335613</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Polymer Pop-7 (25mL) Of Polymer Pop-7 (10mL)</td><td>Applied Biosystems</td><td>cat. # 44363929 of cat. # 4352759</td><td></td></tr><tr><td>3700/3730 BigDye Terminator v3.1 Sequencing Standard Kit</td><td>Applied Biosciences</td><td>Cat# 4336943</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge met plaatvoerders</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3730xl DNA Analyzer</td><td>Applied Biosciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

genotypische inferentie van hiv-1 tropisme de populatie-gebaseerde sequencing van v3

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Achtergrond: Voorafgaand aan het ontvangen van een geneesmiddel uit CCR5-antagonist klasse in HIV-therapie moet de patiënt worden onderworpen aan een HIV-test tropisme om te bevestigen dat zijn of haar viral de bevolking van de CCR5-coreceptor gebruikt voor cellulaire binnenkomst, en niet een alternatief coreceptor. Een benadering om tropisme testen is om te onderzoeken de volgorde van de V3 regio van de HIV-envelop, die samenwerkt met de coreceptor. Methoden: Viraal RNA wordt gewonnen uit bloedplasma. De V3 regio wordt versterkt in drievoud met geneste reverse transcriptase-PCR. De amplificaties worden vervolgens sequentie bepaald en geanalyseerd met behulp van de software, RE_Call. Sequenties worden vervolgens voorgelegd aan een bio-algoritme, zoals geno2pheno van virale tropisme afleiden uit de V3 regio. Sequenties worden afgeleid dat ze niet-R5 als hun geno2pheno valse positieve daalt onder de 5,75%. Als een van de drie sequenties van een steekproef is afgeleid als niet-R5, de patiënt is het onwaarschijnlijk om te reageren op een CCR5-antagonist.

HIV tropisme kan worden afgeleid uit de V3 gebied van de virale envelop. V3 is PCR geamplificeerde in drievoud met geneste RT-PCR, in volgorde, en geïnterpreteerd met behulp van bio-software. Monsters met met 1 of meer sequentie (s) met een lage G2P scores worden geclassificeerd als niet-R5-virus.

Genotypische Inferentie van HIV-1 tropisme de populatie-gebaseerde Sequencing van V3

Achtergrond: Voordat een patiënt een geneesmiddel uit de klasse van CCR5-antagonisten krijgt in de context van hiv-therapie, moet een hiv-tropismetest worden uitgevoerd om te bevestigen dat zijn of haar ...

Het algemene doel van deze procedure is om het virale tropisme bij een HIV-geïnfecteerde patiënt af te leiden door het sequencen van de V3-regio van het virale envelopgen. Begin met het extraheren van HIV-RNA uit het bloedplasma van de patiënt. Amplificeer vervolgens de V3-regio van HIV gp120 middels nested RT-PCR. Identificeer daarna de aanwezigheid van het product via gelelektroforese, gevolgd door populatiegebaseerde sequencing van de geamplificeerde V3-producten.Analyseer tot slot de sequenties met base-callingsoftware en leid het gebruik van co-receptoren af met het genome-to-pheno-algoritme. Uiteindelijk kunnen deze resultaten aantonen of de virale tropisme van een patiënt R5 of non-R5 is via populatiegebaseerde sequencing van de HIV-1 V3-loop. Het primaire voordeel van deze tropisme-assay ten opzichte van bestaande methoden, zoals fenotypische celgebaseerde assays, is dat deze in elk laboratorium met sequencingapparatuur kan worden uitgevoerd, tegen lagere kosten, in minder tijd en met minder startmateriaal.Deze techniek is relevant voor de behandeling met antiretrovirale therapie, omdat hiermee kan worden vastgesteld of de virale populatie van een patiënt waarschijnlijk zal reageren op een CCR5-antagonist op basis van 500 µL plasma. Gebruik een EasyMag geautomatiseerde extractor om HIV-RNA te extraheren. Ga nu naar een PCR-schone ruimte om de RT-PCR voor te bereiden, om zo een adequate bemonstering van de virale populatie te garanderen.Plan om elke reverse transcriptiereactie in drievoud uit te voeren in deze één-stapsreactie. Gebruik viraal RNA om cDNA te synthetiseren, waarbij specifiek de HIVV three-regio wordt geamplificeerd met de SQV three F1 en CO 6 0 2 prime repair. Gebaseerd op de componenten per reactie.Maak met een repeaterpipet een voorraadmixoplossing die voldoende is voor het aantal te amplificeren monsters. Voeg 36 µl van de monstermix toe aan elke put van de PCR-plaat. Schakel nu over op een multikanalpipet om microliters RNA-monsterextract over te brengen naar elke aangewezen put. Let erop dat de tips tussen elke toevoeging worden gewisseld.Zodra de overdracht is voltooid, worden de wells afgesloten met PCR-stripdoppen. Plaats vervolgens de PCR-plaat in een thermocycler die is geprogrammeerd voor een one-step RT-PCR van de HIVV three regio. Gebruik voor de nested PCR de SQV three F two en CD four R primer pair.Bereken de hoeveelheid reagens die nodig is voor het aantal monsters dat in een PCR-schone ruimte moet worden geamplificeerd. Maak de nested PCR-mix en gebruik vervolgens een repeaterpipet om 19 µL per well van een schone PCR-plaat te aliquoteren. Na voltooiing van de R-T-P-C-R dient men naar een ruimte voor na-amplificatie te gaan.Gebruik een achtkanals multichannelpipet om één µL van het RT-PCR-sjabloon over te brengen naar het nested PCR-mengsel. Verschoon de tips tussen elke toevoeging. Sluit de wells af met PCR-stripdoppen en plaats de plaat in een thermocycler voor amplificatie.Verwijder de plaat uit de thermocycler nadat de temperatuur is teruggekeerd naar 25 °C. Om te bevestigen dat de V3-regio succesvol is geamplificeerd, worden de producten eerst geanalyseerd middels gelelektroforese. Bereid een 1,6% agarosegel voor met cyber safe gelkleuring.Gebruik een multichannelpipet van 10 µL. Breng 8 µL PCR-monsters over naar de betreffende putjes. Laad daarnaast een DNA-ladder in ten minste één putje per rij.Laat de gel ongeveer 10 minuten lopen bij circa 100 volt. Visualiseer de banden via ultraviolette fluorescentie en leg het beeld vast met een foto. Noteer de monsters waarbij alle triplicaat amplificaties succesvol waren.Indien nodig wordt de R-T-P-C-R herhaald voor die monsters met minder dan drie productamplificaties. De geamplificeerde virale cDNA-monsters worden verder geverifieerd door DNA-sequencingreacties uit te voeren met de V 3 0 2 F en S QV three R one primers. Haal het big di-reagens uit de vriezer en laat het ontdooien bij kamertemperatuur.Bereken en bereid de reagentia voor die nodig zijn voor het aantal te analyseren monsters. Pipetteer vijf microliters van het sequeneringsreactiemengsel in de juiste putjes van de plaat met behulp van een multichannelpipet. Bedek de plaat met een Kim wipe en zet deze opzij.Bereid ondertussen een verdunning van 1:15 van het geamplificeerde PCR-product voor door 180 µL steriel water toe te voegen aan het resterende PCR-product. Pipetteer 1 µL van het verdunde monster naar de bodem van de betreffende plaatputjes. Vers Jikaal altijd de tips tussen de monsters wanneer de monsteroverdracht is voltooid.Sluit de plaat af met stripdoppen en vortex deze gedurende één seconde. Om de plaat te centrifugeren, stelt u de snelheid in op 140 5G. Stop het centrifugeren zodra de spinsnelheid 140 5G bereikt.Plaats de plaat in een thermocycler om de reactie te laten verlopen. Precipiteer in elke well het DNA met 4 µL 3 M natriumacetaat en 40 µL gekoelde 95% Ethanol, en sluit de doppen opnieuw. Vortex de plaat 10 seconden en tik tegen de plaat om eventuele luchtbellen te verwijderen.Plaats de platen bij -20 °C gedurende 30 minuten tot twee uur. Win het DNA terug door centrifugatie bij 2000 G gedurende 20 minuten. Verwijder de stripdoppen en gooi deze weg.Keer de plaat boven de afvalbak om en schenk het supernatant af. Verwijder het resterende supernatant door de omgekeerde platen op een papieren handdoek te deppen.Vouw twee vellen keukenpapier om de plaat in te pakken. Plaats de plaat met de voorkant naar beneden in de centrifuge en centrifugeer bij 140 5G. Stop het centrifugeren zodra 140 5G is bereikt.Was daarna met 155 µL 95% ethanol en schenk dit af. Herhaal vervolgens de centrifugatie. Laat de plaat twee tot vijf minuten staan zodat de laatste resten ethanol kunnen verdampen.Om de DNA-monsters te denatureren, gebruikt u een meerkanaals pipet om 10 µL high dye for maide te verdelen over alle wells op de plaat, inclusief de lege wells. Sluit de plaat af met een septumafoer en plaats deze in een thermocycler bij 90 °C gedurende twee minuten. Plaats tot slot de monsterplaat in een sequencingplaat en vervolgens in de sequencer.Een aanvaardbare methode voor data-analyse is het gebruik van de software Recall om automatische base calling uit te voeren zonder menselijke tussenkomst. Recall is een gratis, op maat gemaakte software voor base calling; log in en selecteer met de optie 'browse' de monsterbestanden die moeten worden geüpload. Zoek het bestand met de ruwe sequencing-data en upload tot 20 megabytes.Stel vervolgens de referentiesequentie in op V drie. Klik op 'process data'. Selecteer de resulterende map aan de rechterkant van de pagina om de lijst met monsters weer te geven.De rode monsters zijn afgekeurd. De groene monsters zijn goedgekeurd. Door op een specifiek monster en vervolgens op de knop 'view' te klikken, kunt u de sequentie bekijken, de instructies aan de rechterzijde van de pagina volgen om door de sequentie te navigeren en bestanden downloaden in een zip-map.Viraal tropisme kan worden afgeleid uit sequenties die zijn gegenereerd via populatiegebaseerde sequencing met behulp van het geno-to-pheno co-receptoralgoritme. Selecteer in het vervolgkeuzemenu van de significante instelling de optie geoptimaliseerd op basis van analyse van klinische gegevens van motivate 2% en 5.75% FPR. Kies nu om een sequentie te uploaden of te plakken voor analyse.FASTA-bestanden zijn acceptabel. Voeg geen andere bestanden toe om over te gaan naar het verkrijgen van een geno Tono FPRA-voorspeller van de respons op CCR five-antagonisten. Het gegenereerde G two P-rapport geeft de V three-loopsequentie in aminozuren weer en geeft relevante posities aan van mutaties die geassocieerd zijn met non R five-gebruikend virus.Onderaan het rapport wordt de fout-positieve ratio gegeven en geïnterpreteerd in termen van de respons op een CCR5-antagonist. Dit rapport kan worden gedownload als PDF-bestand. Als uit één van de drie sequenties van een monster wordt afgeleid dat het geen R5 is, is de kans klein dat de patiënt reageert op een CCR5-antagonist zoals verwacht; gelelektroforese van RTP-CR-amplificaties van de HIV-1 V3-loop geeft aan dat niet alle klinische monsters een product produceren.De gegenereerde sequenties van de geamplificeerde monsters kunnen worden gevisualiseerd in een chromatogram dat via recall wordt uitgelezen. Er wordt een schone sequentie met weinig mengsels verwacht. Af en toe kunnen sequenties onduidelijk zijn en zich niet lenen voor een nauwkeurige basistoewijzing.Sommige patiënten kunnen worden geïdentificeerd als dragers van een virus dat geen gebruikmaakt van CCR five, zoals hier wordt getoond. Deze patiënten zullen waarschijnlijk niet reageren op een behandeling met een CCR five-antagonist. De meerderheid van de patiënten blijkt echter een virale populatie te hebben die bestaat uit een virus dat gebruikmaakt van CCR five, wat wordt aangegeven door een groen kader onderaan het G two P-analyserapport.Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze van begin tot eind in ongeveer vier dagen worden uitgevoerd. Dat omvat de periode van extractie tot analyse. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe viraal tropisme kan worden voorspeld met behulp van populatiegebaseerde sequencingsmethoden in combinatie met het genome pheno bioinformatica-algoritme.Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

genotypic-inference-hiv-1-tropism-using-population-based-sequencing

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Kwantificeren niveaus van HIV-1 RNA in het plasma en de volgorde single HIV-1 genoom van individuen met een viral load onder de detectielimiet (50-75 kopieën / ml) is moeilijk. Hier beschrijven we hoe te winnen en te kwantificeren plasma virale RNA met behulp van een real-time PCR-test die een betrouwbare maatregelen HIV-1 RNA beneden tot 0,3 kopieën / ml en hoe virale genomen versterken door enkele genoom, van monsters met een zeer lage viral load.

Versterken en kwantificeren van HIV-1 RNA in HIV-geïnfecteerde personen met een viral load onder de limiet van de Opsporing van Standard Clinical Assays

De voorspelling van de coreceptor gebruik van HIV-1 is vereist voor de toediening van een nieuwe klasse antiretrovirale geneesmiddelen, namelijk coreceptor antagonisten. Het kan worden uitgevoerd door sequentieanalyse van...

Voorspelling van HIV-1 coreceptor Usage (tropisme) Sequentie analyse met een Genotypische Approach

Drug resistentie testen voor HIV-1 geïnfecteerde individuen falende antiretrovirale therapie (ART) kan toekomstige therapieën begeleiden en verbeteren behandelingsresultaten. Het optimaliseren van de individuele en de bevolking gezondheidsresultaten in hoge HIV-prevalentie, maar met beperkte middelen zal uiteindelijk vereisen betaalbaar en toegankelijk resistentie genotypering en interpretatie methoden.

Een betaalbare HIV-1 drug-resistentie Monitoring Methode voor het met beperkte middelen

HIV-1-pathogenese wordt bepaald door zowel virale kenmerken als genetische factoren van de gastheer. Hier beschrijven we een robuuste methode die reproduceerbare metingen mogelijk maakt om de impact van de gag gensequentieverschil op de in vitro replicatiecapaciteit van het virus te beoordelen.

Een restrictie-enzym Based Klonen Methode om de Beoordelen<em&gt; In vitro</em&gt; Replicatie Capaciteit van HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Virussen

Groeiconcurrentie tussen bijna isogene virussen biedt een gevoelige meting voor het bepalen van relatieve replicatiefitheid. De hier beschreven protocollen omvatten de constructie van recombinante HIV-1-klonen, viruspropagatie en groeiconcurrentie en analysemethoden geoptimaliseerd om gevoelige en consistente resultaten op te leveren.

Paarsgewijze Groei Competitie Assay voor het bepalen van de Replicatie Fitness van Human Immunodeficiency Virussen

We beschrijven een protocol voor het amplificeren van retrovirale integratieplaatsen vanuit het genomische DNA van geïnfecteerde cellen, het sequencen van de versterkte virus-gastheer grenzen, en vervolgens het in kaart brengen van deze sequenties naar een referentie-genoom. We beschrijven ook technieken om de verdeling van integratieplaatsen te kwantificeren ten opzichte van verschillende genomische annotaties met behulp van BEDTools.

Versterking, next-generation sequencing en Genomic DNA in kaart brengen van retrovirale integratie Sites

Dit manuscript beschrijft de experimentele procedure en software analyse voor een bidirectionele integratie site analyse die tegelijkertijd upstream en downstream vector-host junction DNA kan analyseren. Bidirectionele PCR producten kunnen worden gebruikt voor elk downstream sequencing platform. De resulterende gegevens zijn bruikbaar voor een high-throughput, kwantitatieve vergelijking van geïntegreerde DNA-doelen.

Tweerichtings retrovirale integratie site PCR methodologie en kwantitatieve data analyse werkstroom

Beschreven is een methode om te kwantificeren van de expressie van genen die 96 en 18 oppervlakte eiwitten door afzonderlijke cellen ex vivo, waardoor voor de identificatie van differentially uitgedrukte genen en proteïnen in virus-geïnfecteerde cellen ten opzichte van niet-geïnfecteerde cellen. Passen we de aanpak van de studie SIV-geïnfecteerde CD4+ T cellen geïsoleerd van rhesus makaken.

Eencellige kwantificatie van mRNA en oppervlak eiwituitdrukking in Simian Immunodeficiëntie Virus-geïnfecteerde CD4+ T cellen geïsoleerd van Rhesus Makaken

Full-length individuele proviraal sequencing (FLIPS) een efficiënte en hoog-productie methode voorziet in de versterking en sequentiebepaling van één, in de buurt van full-length (intact en defecte) HIV-1 proviruses en zorgt voor de bepaling van hun potentieel replicatie-competentie. FLIPS overwint beperkingen van eerdere tests ontworpen om de volgorde van het latente reservoir van HIV-1.

Versterking van in de buurt van Full-length HIV-1 Proviruses voor Next-Generation Sequencing

Hier presenteren we een diepe rangschikken benadering waarmee een onbevooroordeelde bepaling van ontluikende 3'-termini en vogelgriepvirus profielen van single-stranded DNA moleculen. De belangrijkste toepassing is de karakterisatie van ontluikende retrovirale complementaire Ani (cDNAs), de tussenproducten die tijdens het proces van retrovirale omgekeerde transcriptie gegenereerd.

Bepalende 3'-Termini en sequenties van ontluikende Single-Stranded virale DNA moleculen tijdens HIV-1 Reverse transcriptie in geïnfecteerde cellen

Leer genotypische inferentie van HIV-1-tropisme met populatie-gebaseerde sequencing van de V3-regio. Deze bio-informatica methode classificeert virus als R5 of non-R5 voor behandelingsselectie.

Genotypische Inferentie van HIV-1 tropisme de populatie-gebaseerde Sequencing van V3

Meer video's verkennen