Genotypische Inferentie van HIV-1 tropisme de populatie-gebaseerde Sequencing van V3

Het algemene doel van deze procedure is om het virale tropisme bij een HIV-geïnfecteerde patiënt af te leiden door de V drie-regio van het virale envelopgen te sequencen om te beginnen H-I-V-R-N-A uit het bloedplasma van de patiënt te extraheren. Vervolgens de V drie-regio van HIV GP een 20 versterken met geniste R-T-P-C-R. Dan de aanwezigheid van het product identificeren met gelelektroforese, gevolgd door populatiegebaseerde sequencing van de versterkte V drie-producten.

Ten slotte de sequenties analyseren met base calling software en de co-receptorgebruik afleiden met behulp van de genoom naar feno algoritme. Uiteindelijk kunnen deze resultaten aantonen of de virale troep van een patiënt R vijf of niet R vijf is door middel van populatiegebaseerde sequencing van de HIVV drie-lus. Dus het belangrijkste voordeel van deze techniek is een troeptest over bestaande methoden zoals fenotypische celgebaseerde assays is dat het kan worden uitgevoerd in elk laboratorium uitgerust met sequencingapparatuur voor lagere kosten in minder tijd met minder uitgangsmateriaal.

Deze techniek is relevant voor de behandeling met antiretrovirale therapie omdat het kan identificeren of de virale populatie van een patiënt waarschijnlijk zal reageren op een CCR vijf antagonist. Van 500 microliter plasma. Gebruik een easy mag geautomatiseerde extractor om H-I-V-R-N-A te extraheren. Ga nu naar een PCR schone ruimte om de R-T-P-C-R op te zetten om voldoende bemonstering van de virale populatie te garanderen.

Plan om elke reverse transcriptiereactie in drievoudige uit te voeren in deze eenstapsreactie. Gebruik virale RNA om CDNA te synthetiseren, specifiek het HIVV drie-gebied versterken met de SQV drie F1 en CO 6 0 2 prime reparatie. Gebaseerd op componenten per reactie.

Maak een voorraadoplossing die voldoende is voor het aantal te versterken monsters met behulp van een repeater pipet. Voeg 36 microliter monstermix toe aan elke put van de PCR-plaat. Schakel nu over naar een multikanaals pipet om microliters RNA-monsterextract naar elke aangewezen put over te brengen. Zorg ervoor dat u de tips verwisselt tussen elke toevoeging.

Zodra de overdracht voltooid is, bedek de putten met PCR-stripdoppen. Plaats vervolgens de PCR-plaat in een thermocycler geprogrammeerd voor een eenstaps R-T-P-C-R van de HIVV drie-regio. Gebruik voor de geneste PCR de SQV drie F twee en CD vier R primer reparatie.

Bereken de hoeveelheid reagens vereist voor het aantal te versterken monsters in een PCR schone ruimte. Genereer de geneste PCR-mix en gebruik vervolgens een repeater pipet om 19 microliter per put van een schone PCR-plaat te doseren. Na voltooiing van de R-T-P-C-R, ga naar een post-amplificatieruimte.

Gebruik een achtkanaals multikanaals pipet om één microliter van de R-T-P-C-R-sjabloon over te brengen naar de geneste PCR-mix. Verwissel tips tussen elke toevoeging. Bedek de putten met PCR-stripdoppen en breng de plaat over naar een thermocycler voor amplificatie.

Verwijder de plaat uit de thermocycler nadat de temperatuur is teruggekomen naar 25 graden Celsius. Om te bevestigen dat de V drie-regio met succes is versterkt, analyseer eerst de producten met gelelektroforese. Bereid een 1,6% AROS-gel met cyberveilige gelkleurstof voor.

Gebruik een 10 microliter meerkanaals pipet. Breng acht microliter PCR-monsters over naar de respectieve putten. Laad ook een DNA-ladder in ten minste één put per rij.

Laat de gel draaien bij ongeveer 100 volt gedurende 10 minuten. Visualiseer banden door ultraviolette fluorescentie en documenteer het beeld door fotografie. Maak aantekeningen van de monsters waar alle drievoudige versterkingen succesvol waren.

Herhaal indien nodig R-T-P-C-R voor die monsters met minder dan drie productversterkingen. De versterkte virale CDNA-monsters worden verder geverifieerd door DNA-sequencingreacties die worden uitgevoerd met behulp van de V 3 0 2 F en S QV drie R één primers. Haal de grote di reagens uit de vriezer en laat het op kamertemperatuur ontdooien.

Bereken en bereid de reagensa's voor die vereist zijn voor het aantal monsters dat moet worden uitgevoerd. Doseer vijf microliter van de sequencingreactiemix in de juiste putten van de plaat met behulp van een multikanaals pipet. Bedek de plaat met een Kim-doek en laat het opzij liggen.

Bereid ondertussen een een op vijftien verdunning van het versterkte PCR-product voor door 180 microliter steriele water toe te voegen aan het resterende PCR-product. Pipetteer een microliter van het verdunde monster op de bodem van de juiste putten. Verwissel altijd de tips tussen monsters wanneer de monsteroverdracht is voltooid.

Versluit de plaat met stripdoppen en vortex gedurende één seconde. Om de plaat te centrifugeren, stel de snelheid in op 140 5G. Wanneer de centrifugeersnelheid 140 5G bereikt, stopt u met centrifugeren.

Plaats de plaat in een thermocycler om de reactie te laten verlopen. In elke put de DNA met vier microliter drie molaire natriumacetaat en 40 microliter gekoelde 95% ethanol precipiteren, sluit de doppen weer. Vortex de plaat gedurende 10 seconden en tik op de plaat om eventuele luchtbellen los te maken.

Plaats de platen op min twintig graden Celsius gedurende 30 minuten tot twee uur. Herstel DNA door centrifugatie bij 2000 G gedurende 20 minuten. Verwijder en gooi de stripdoppen weg.

Keer de plaat om over de afvalcontainer en decanteer de super natin. Verwijder alle resterende super natin. Door de omgekeerde platen op een papieren handdoek te stippen.

Vouwen twee vellen papieren handdoek om de plaat te sardijnen. Plaats de plaat met de achterkant omlaag in de centrifuge en draai met 140 5G. Stop met draaien wanneer het 140 5G bereikt.

Was vervolgens met 155 microliter 95% ethanol en decanteer. Herhaal vervolgens de centrifugatie. Laat de plaat twee tot vijf minuten staan om eventueel laatste ethanol te laten verdampen.

Om de DNA-monsters te