Name: Passieve Toediening van monoklonale antilichamen tegen H. capsulatum Ea schimmels (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-14T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Leer passieve toediening van monoklonale antilichamen tegen Histoplasma capsulatum in C57BL/6 muizen. Deze methode onderzoekt de beschermende werking van humorale immuniteit tegen histoplasmose.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Groei van H. Capsulatum <ol><li> Bereid een bioveiligheid kast voor het werken met de schimmel door het schoonmaken van de kast met 10% bleekmiddel, gevolgd door 20 minuten UV-straling. H. capsulatum in de gist fase vereist Biosafety level (BSL) II praktijken, terwijl de schimmel vorm vereist BSLIII. Gebruik van gist vorm in de volgende stappen. </li><li> Volgende bereiden een 15 ml conische buis met 5 ml PBS. Oogst een kolonie van H. capsulatum (stam Hc ATCC G217B) van een BHI bloed agar plaat [glucose 10 g / L, cysteïne 0,1 g / L, penicilline-streptomycine 1% en schapen rode bloedcellen 50 ml / L (Colorado Serum Co, Colorado, USA) ] gekweekt bij 37 ° C of nemen een hoeveelheid van ingevroren gist voorraad bij -80 ° C en voeg deze toe aan het PBS. Vortex de cellen krachtig en centrifugeer voor 1100 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur. Verwijder voorzichtig het supernatans af zonder de pellet te verstoren en voeg 10 ml verse PBS. Herhaal deze procedure drie keer. Hang de cellen in 5 ml PBS en overdragen aan een 50 ml conische buis. </li><li> Te verstoren geaggregeerde cellen, passeren de gist celsuspensie door middel van een 26 G1 / 2 naald u zingen een 10 ml injectiespuit 5 keer in een bioveiligheid kast (met behulp van het gezicht bescherming). Te isoleren kleine, uniform-en kleinbedrijf gist, centrifuge de cellen bij 55 xg gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur en verwijder vervolgens de top 1 ml. </li><li> Voeg de celsuspensie om een ​​steriele erlenmeyer met 100 ml van HAM F12 medium (GIBCO), aangevuld met 16g / L glucose, 1 g / L glutaminezuur, 8.4mg / L cystine, 6g / L glutaminezuur en dan groeien de cellen op 37 ° C gedurende 48 uur in een incubator met 150rpm schudden. </li></ol> 2. Hybridoma Groei en zuivering van monoklonale antilichamen <ol><li> Overdracht van de geselecteerde hybridoma's te DMEM medium met 10% foetaal kalf serum, 10% NCTC, 1% niet-essentiële aminozuren en 1% penicilline-streptomycine. Groeien de cellen in een celkweek kolf (Becton Dickenson) voor 5-7 dagen bij 37 ° C / 5% CO 2. </li><li> Centrifugeer het medium op 1100 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur en het verzamelen van alle bovenstaande vloeistof zonder verstoring van de pellets. </li><li> Vervolgens zuiveren de cel vrij supernatant met behulp van een proteïne A / G hars door de FPLC. </li><li> De mAb concentratie kan dan worden berekend door een capture ELISA (1) met behulp van een IgG isotype controle als standaard (Figuur 1B). </li></ol> 3. Histoplasma capsulatum Inoculum Voorbereiding <ol><li> Neem een 48 uur Histoplasma capsulatum (stam Hc ATCC G217B) gist fase cultuur gekweekt in HAM F-12 medium. </li><li> Centrifugeer de cellen bij 1100 xg gedurende 10 minuten. Verwijder het supernatant en voeg verse PBS. </li><li> Herhaal de procedure 3.2 3 keer. </li><li> Passeren de gist celsuspensie 5 keer door middel van een 26G1 / 2 naald met behulp van een injectiespuit. </li><li> Centrifugeer de suspensie bij 55 xg gedurende 1 minuut tot pellet resterende cel clusters. Breng de bovenstaande met de enkele celsuspensie naar een nieuwe buis. </li><li> Inventariseer de enkele celsuspensie met behulp van een hematocytometer. </li><li> Pas de cel concentratie om 1.25 x 10 7 gist (overleving) of 5,0 x 10 6 (CFU, cytokines en histologie) in een suspention van &lt;50 il (figuur 2) te bereiken. </li></ol> 4. Intraperitoneale toediening van de MAbs <ol><li> Pak de muis bij zijn staart en het nekvel (afb. 3A). Immobiliseren de muis door het nekvel van zijn nek zo dicht mogelijk bij theears mogelijk (zorg ervoor dat tot het nemen van voldoende huid, zodat de muis zijn hoofd cannotturn aan de persoon die behandeling het bijten, Figuur 3B en 3C). </li><li> Het stabiliseren van de staart metde pink voorzichtig gedrukt tegen de palm van de hand (Figuur 3D). </li><li> Wattenstaafje de injectieplaats met 70% ethanol voor het plaatsen van de naald en te zuigen om voor bloed te kijken alvorens te injecteren. </li><li> Gebruik de 26G1 / 2 tot en met huid en abdominalmuscles piercethe de mAb oplossing die 500μg (PBS, isotype controle antilichaam mAb of het te testen, verdund in 1 ml PBS) in thelower naar links of rechts onderaan de buik kwadrant (intraperitoneaal holte) injecteren, met het dier in het hoofd omlaag, en zorg ervoor dat het diafragma andother interne organen (figuur 3E) te vermijden. </li><li> Wacht even voor intrekking van de needleto verkleinen de kans op lekkage. </li><li> Wacht een minimum van twee uur voordat u verder gaat met de volgende stap. </li></ol> 5. Muis Anesthesie en Intranasale Infecties <ol><li> De voorbereiding van de anesthesie met ketamine en xylazine bij 100 mg / kg en 10 mg / kg, respectievelijk. Voer intraperitoneale toediening van PBS, isotype controle antilichaam, of experimenteel antilichaam zoals beschreven in de bijgevoegde geschreven protocol. Wacht twee uur na mAb injectie voor verlamming van de muis en verder gaat met de intranasale infectie. Bereid anesthesie met behulp van ketamine en xylazine bij 100 mg / kg en 10 mg / kg respectievelijk (7). </li><li> Tijdens de 2h wachttijd, de voorbereiding van de Histoplasma capsulum inoculum, zoals beschreven in de bijbehorende geschreven protocol. </li><li> Ga verder volgens de Itens 5,1 tot 5,5. Toe knijpen de dieren met een pincet en de afwezigheid van reflex te controleren en te bevestigen dat de verdoving werkte. Na anaesthetization, zachtjes de muis te schorten door haar voortanden naar een nylon of katoenen touw. Gebruik 2 kolom staat de snaren binden, om de dieren op te schorten. </li><li> Langzaam toedienen van ongeveer 50 ul inoculum in een nare met behulp van een micropipet terwijl nauwlettend de muis ademhaling. Laat de muis om in deze positie rust voor 2-5 min na intranasale infectie aan de afzetting van de gist te vergemakkelijken in de longen van het dier (figuur 3F). </li><li> Nadat de muis is geïnfecteerd, blijven de muis in een gecontroleerde, warme omgeving (temperatuur tussen 25 en 37 ° C), zorgvuldig gebruik te maken van een warmtelamp, indien nodig, totdat hij herstelt van de narcose. Wanneer de muis wakker, terug te sturen naar een schone kooi met ad libitum toegang tot voedsel en water. De kooien worden terug gestuurd naar onze dierlijke faciliteit en bewaard in een schone dier kamer (BLSI). </li></ol> 6. Survival Studies <ol><li> Klinisch beoordelen geïnfecteerde en mock-besmette dieren voor tachypneu, lethargie, verdoving, en gewichtsverlies. Moeten de dieren twee keer per dag worden gecontroleerd door het laboratorium van de leden en dagelijks door de dierverzorgers. </li><li> Met muizen histoplasmose, tot vlak voor het einde van het leven, zijn er meestal geen duidelijke tekenen van de infectie anders dan een lichte verhoging van de ademhaling. Met gevorderde ziekte, die meestal gebeurt vanuit 10-11 dagen, de muizen beduidend tachypneic en hebben verminderde activiteit. Typisch ze in korte tijd uitgegroeid stervende en vervallen. </li><li> Verontruste dieren moeten adequaat worden gedood met CO 2 in een speciale kamer, moet Overleden dieren dagelijks worden opgesomd. </li></ol> 7. CFU Studies, Histologie en cytokinen Studies <ol><li> Bereid 15 ml conische buizen met 10 ml PBS voor elk orgaan te worden verzameld. </li><li> Euthanaseren dieren 7 en 14 dagen na infectie met een subletale inuculum (5,0 x 10 6), zoals eerder aangegeven en verwijder onmiddellijk de longen, milt en lever. </li><li> Verwijder een stuk van het orgel te evalueren en uit te voeren de fixatie in formaline 's nachts. De secties worden onderzocht onder de microscoop voor pathologische evaluatie. </li><li> Bereid 50 ml conische buizen met 5 ml PBS afgewerkt met 70 micrometer cel zeven voor elk orgaan te worden gehomogeniseerd. Afzonderlijk maceraat elke resterende deel van de organen in de 50 ml buizen met behulp van steriele spuit 5 ml plunjers. </li><li> Volgende, in serie verdunnen orgel homogenaten (1:100, 1:1000 en 1:5000) en de plaat 100μL van elke verdunning op BHI-bloed agar platen (2). </li><li> Voeg protease-remmer tabletten om de homogenaten volgens de fabricage van de instructies (Roche, Duitsland). </li><li> Incubeer de platen bij 37 ° C gedurende maximaal 14 dagen en sommen CFU's. </li><li> Centrifugeer het orgel homogenaten op 4000xg gedurende 10 minuten en verwijder orgel supernatant, zal wens worden gebruikt in gebruikt in de cytokine testen uitgevoerd door standaard methoden volgens de fabrikant. </li></ol> 8. Monoklonale antilichaam Bescherming tegen H. Capsulatum is afhankelijk van antilichaamspecificiteit en isotype <ol><li> MAb isotype is van cruciaal belang in de bescherming tegen H. capsulatum, zoals muizen behandeld met IgG1 of IgG2a mAbs te HSP60 zijn aanzienlijk verlengde overleving in vergelijking met muizen die een IgG2b mAb aan HSP60 of een van een isotype controle mAb of PBS (figuur 4) te controleren. </li><li> Verder, in muizen die beschermende mAb's ontvangen, was er een significante vermindering van het aantal pulmonaire en milt CFU op dag 7 en de afname van 2 en 2,5 log-eenheden van gist nummers in de longen op dag 14 (figuur 5). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2532/2532fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1: Groei van H. capsulatum en hybridoma's. (A) Liquid HAM F-12 de bereiding van een enkele kolonie afkomstig van H. capsulatum gekweekt op een BHI-bloed agar platen. (B) Hybridoma groei in celkweek kolven en mAb zuivering door proteïne A / G hars met behulp van affiniteit cromatography. <img src="/files/ftp_upload/2532/2532fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2: H. capsulatum inoculum voorbereiding voor intranasale infectie. Celsuspensie verkregen na H. capsulatum aggregaten verstoring door de spuit en centrifugeren wordt geïnventariseerd door het tellen in een hemocytometer. Celconcentratie wordt aangepast aan 1,25 x 10 7 (overleving experimenten) of 5 x 10 6 (CFU's, cytokines en histologie) in &lt;50 uL. upload/2532/2532fig3.jpg "alt =" Figuur 3 "/&gt; Figuur 3: Muis behandeling tijdens mAb administratie. (A) De muis wordt opgepikt door de staart en (B en C) geïmmobiliseerd door die de nekvel van zijn nek zo dicht mogelijk bij theears. (D) De staart is gehouden tussen de pink en de handpalm. (E) De mAb oplossing wordt geïnjecteerd met behulp van een 26G1 / 2 naald. (F) De H. capsulatum inoculum wordt intranasaal toegediend door voorzichtig pipetteren de celsuspensie in een nare. <img src="/files/ftp_upload/2532/2532fig4.jpg" alt="Figuur 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4: MAbs tot HSP60 kunnen de pathogenese van histoplasmose veranderen. ip injecties met 500 ug van IgG1, of IgG2a mAbs twee uur voorafgaand aan de infectie significant langere overleving (p &lt;0,05, in vergelijking met controles), maar een IgG2b mAb. <img src="/files/ftp_upload/2532/2532fig5.jpg" alt="Figuur 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 5"> Figuur 5: CFU bepalingen in de longen op 7 en 14 dagen na een subletale intranasale uitdaging met 5x10 6 Hc gisten van muizen behandeld ip met geselecteerde mAbs te HSP60 of irrelevante mAb toonde aan vermindering van de lasten voor de schimmel IgG1 en IgG2a mAb's behandelde dieren. Zwarte balken geven CFU's op dag 7 en witte balken 14 dagen na de infectie (* p &lt;0,001 na 7 dagen en ** p &lt;0,001 na 14 dagen na besmetting).

<ol><li>Casadevall, A., Mukherjee, J., Scharff, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibody+based+ELISAs+for+cryptococcal+polysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibody based ELISAs for cryptococcal polysaccharide.</a> J. Immunol. Methods. 154, 27-35 (1992).</li>
<li>Guimaraes, A. J., Frases, S., Gomez, F. J., Zancope-Oliveira, R. M., Nosanchuk, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+to+heat+shock+protein+60+alter+the+pathogenesis+of+Histoplasma+capsulatum.+Infect+Immun+77%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies to heat shock protein 60 alter the pathogenesis of Histoplasma capsulatum. Infect Immun 77.</a> , 1357-1367 (2009).</li>
<li>Guimaraes, A. J., Hamilton, A. J., de M Guedes, H. L., Nosanchuk, J. D., Zancope-Oliveira, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+function+and+molecular+mapping+of+M+antigen+in+yeast+phase+of+Histoplasma+capsulatum%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Biological function and molecular mapping of M antigen in yeast phase of Histoplasma capsulatum.</a> PLoS One. 3, e3449-e3449 (2008).</li>
<li>Nosanchuk, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+antibodies+and+endemic+dimorphic+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Protective antibodies and endemic dimorphic fungi.</a> Curr Mol Med. 5, 435-442 (2005).</li>
<li>Nosanchuk, J. D., Steenbergen, J. N., Shi, L., Jr, D. eepe, &amp, G. S., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+a+cell+surface+histone-like+protein+protect+against+Histoplasma+capsulatum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Antibodies to a cell surface histone-like protein protect against Histoplasma capsulatum.</a> J Clin Invest. 112, 1164-1175 (2003).</li>
<li>Nosanchuk, J. D., Steenbergen, J. N., Shi, L., Deepe, G. S. Jr, ,, Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+a+cell+surface+histone-like+protein+protect+against+Histoplasma+capsulatum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Antibodies to a cell surface histone-like protein protect against Histoplasma capsulatum.</a> J. Clin. Invest. 112, 1164-1175 (2003).</li>
<li>Smith, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+of+laboratory+animals+to+some+injectable+anaesthetics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Responses of laboratory animals to some injectable anaesthetics.</a> Lab Anim. 27, 30-39 (1993).</li>
</ol>

Het protocol hier gepresenteerde laat zien dat mAb&#39;s te H. capsulatum kunt de loop van de experimentele muizen histoplasmose. MAbs aan het celoppervlak antigenen van ziekteverwekkers kunt de complexe dynamiek die zich voordoen tijdens het samenspel tussen een host en een ziekteverwekker. Deze studie stelt vast dat mAbs bescherming in een muizenmodel van dodelijke histoplasmose bemiddelen bij het intraperitoneaal geïnjecteerd, en het suggereert de kandidaat-eiwitten voor de ontwikkeling van vaccins, zoals H2...

<table border="1"><tbody><tr><th> Stofnaam </th><th> Vennootschap </th></tr><tr><td> Biologische veiligheid kast (BSL2) </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml conische buizen </td><td> Falcon, BD </td></tr><tr><td> HAM F-12 medium </td><td> Gibco </td></tr><tr><td> 37 ° C shaker </td><td></td></tr><tr><td> Draaikolk </td><td></td></tr><tr><td> 50 ml conische buizen </td><td> Falcon, BD </td></tr><tr><td> 26G1 / 2 naald </td><td> BD </td></tr><tr><td> 10 ml spuit </td><td> BD </td></tr><tr><td> 250 ml flesjes </td><td></td></tr><tr><td> FPLC (Fast eiwit vloeistofchromatografie) systeem </td><td> GE Helthcare </td></tr><tr><td> ELISA-lezer </td><td> BioTek </td></tr><tr><td> Anesthesie (ketamine en xylazine) </td><td></td></tr><tr><td> Kolom staat </td><td></td></tr><tr><td> Nylon snaar </td><td></td></tr><tr><td> Warmtelamp </td><td></td></tr><tr><td> 70μm cel filters </td><td> Falcon, BD </td></tr><tr><td> BHI agarplaten </td><td> Gibco </td></tr></tbody></table>

passieve toediening van monoklonale antilichamen tegen h. capsulatum ea schimmels

Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

Het doel van het gebruik van deze methodiek is 1) om onze capaciteit verder te gaan naar personen met een antilichaam of vaccin voor het voorkomen of behandelen histoplasmose veroorzaakt door de schimmel Histoplasma capsulatum en 2) de rol van virulentiefactoren te onderzoeken als doelwit voor de therapie te beschermen. Voor het genereren van mAb&#39;s, muizen geïmmuniseerd, worden de immuunreacties beoordeeld met behulp van een vaste fase ELISA-systeem ontwikkeld in ons laboratorium, en de beste responder muizen zijn geselecteerd voor het isoleren van splenocyten voor de fusie met hybridoma cellen. C57BL / 6 muizen zijn uitgebreid gebruikt om de H. studie capsulatum pathogenese en bieden het beste model voor het verkrijgen van de vereiste gegevens. Om de rol van de mAbs in infectie te beoordelen, muizen intraperitoneaal toegediend met mAb aan H. capsulatum of isotype gematchte controle mAb en vervolgens geïnfecteerd door een intraveneuze (iv), intraperitoneale (ip) of intranasaal (in) routes. In de wetenschappelijke literatuur, werkzaamheid van mAbs voor schimmelinfecties in muizen is gebaseerd op de sterfte als een eindpunt, in combinatie met kolonie formin eenheden (CFU) taxaties op eerdere tijdstippen. Overleving (tijd tot overlijden) studies zijn nodig omdat zij het best vertegenwoordigen menselijke ziekten. Zo zou doeltreffendheid van onze interventie niet afdoende worden vastgesteld zonder overlevingscurven. Dit geldt ook voor het vaststellen van de werkzaamheid van het vaccin of het testen van de mutanten voor de virulentie. Met histoplasmose, de muizen gaan vaak van die energieke om dode gedurende een aantal uren. De capaciteit van een interventie, zoals het toedienen van een mAb kan een dier in eerste instantie te beschermen tegen ziekte, maar de ziekte kan terugvallen, die niet zou worden gerealiseerd op korte CFU experimenten. In aanvulling op de overleving en schimmels last testen, onderzoeken we de inflammatoire respons op infectie (histologie, cellulair werving en selectie, cytokine responsen). Om te overleven / tijd om dood experimenten, zijn de muizen geïnfecteerd en gecontroleerd minstens tweemaal per dag op tekenen van ziekelijkheid. Voor de beoordeling van schimmel last, histopathologie, en cytokine respons, zijn de muizen gedood op verschillende tijdstippen na infectie. Dierproeven worden uitgevoerd volgens de richtlijnen van het Institute for Animal Studies van de Albert Einstein College of Medicine.

C57BL / 6 muizen werden gebruikt om Hc pathogenese bestuderen en het beste model te bieden. We zijn het verkennen van de potentiële voordelen van humorale immuniteit tegen deze schimmel en genereerde verschillende mAb&#39;s [om histon H2B en een heat shock protein 60kDa] die we getest op hun beschermende werking na intraperitoneale toediening.

Passieve Toediening van monoklonale antilichamen tegen H. capsulatum Ea schimmels

Het doel van het gebruik van deze methodologie is 1) our vermogen te vergroten om individuen te beschermen met antilichamen of een vaccin voor het voorkomen of behandelen van ...

Het algemene doel van deze procedure is om ons vermogen te verbeteren om individuen te beschermen met antilichamen of vaccins voor het voorkomen of behandelen van histoplasmose, en om de rol van virulentiefactoren bij de pathogenese van de ziekte te onderzoeken. Dit wordt bereikt door eerst monoklonale antilichamen tegen doelantigenen te isoleren en te karakteriseren. De tweede stap van de procedure is het intraperitoneaal toedienen van de geselecteerde monoklonale antilichamen, twee uur voorafgaand aan de intranasale infectie.Om deze moleculen de tijd te geven zich door het hele lichaam te verspreiden, is de derde stap van de procedure het anesthetiseren van de muizen en het intranasaal infecteren ervan met het gewenste inoculum. De laatste stap van de procedure is het monitoren van de gezondheid van de dieren. De dieren worden ofwel op verschillende intervallen geëuthanaseerd om de schimmelbelasting te bepalen en de ontstekingsreacties te beoordelen, of ze worden gevolgd op overleving.Uiteindelijk kunnen resultaten worden behaald die een verlenging van de overleving en een modificatie van pathologische reacties in de aangetaste organen van letaal geïnfecteerde muizen aantonen door peritoneale toediening van de beschermende monoclonale antilichamen voorafgaand aan de infectie. De procedure zal worden gedemonstreerd door Ally Emer, een postdoctoraal onderzoeker met uitgebreide ervaring in fungal pathogenesis en dierinfectiemodellen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals antimycotica, is dat de monoclonale antilichamen moleculen zijn met specifieke eigenschappen die werken via interactie met de gastheerfactoren. Een visuele demonstratie van deze methode is cruciaal voor het begrijpen van de respons op de ziekte.Aangezien de stappen voor de toediening van een monoklonaal antilichaam en de intranasale infectie moeilijk aan te leren zijn omdat ze expertise vereisen in het omgaan met de dieren. Bereid een biosafety level twee-kast voor om met de schimmel in gistvorm te werken door de kast te reinigen met bleekmiddel, gevolgd door UV-bestraling. Bereid een conische buis van 15 milliliter voor met vijf milliliter PBS.Oogst een kolonie H caps AUM uit een aliquot van de voorraad, bevroren bij -80 °C, en voeg deze toe aan de PBS-vortex. Vortex de cellen krachtig en centrifugeer 10 minuten lang bij 1100 ×g. Verwijder bij kamertemperatuur voorzichtig het supernatant zonder de pellet te verstoren en voeg ten minste 10 ml verse PBS toe.Herhaal deze procedure drie keer na de laatste wasbeurt. Resuspendeer de cellen in vijf milliliter PBS. Alle wasbeurten moeten bij kamertemperatuur worden uitgevoerd. Om geaggregeerde cellen te verbreken, worden de gistcellen vijf keer door een naald van 26 gauge en een halve inch geleid met behulp van een spuit van 10 milliliter, waarbij de gistcellen worden opgevangen in een conische buis van 50 milliliter.Om kleine gistcellen van uniforme grootte te isoleren, worden de cellen één minuut lang gecentrifugeerd bij 55 ×g, waarna de bovenste 1 mL wordt verwijderd. Voeg de celsuspensie toe aan een steriele glazen erlenmeyer van 250 mL die 100 mL HAM-F12-medium bevat, en kweek de cellen vervolgens gedurende 48 uur bij 37 °C in een incubator met schudfunctie bij een CO2-concentratie gelijk aan die van de omgevingslucht. Deze cultuur zal worden gebruikt voor de bereiding van het inoculum, waarna de effectiviteit van de monoklonale antilichamen die in de volgende stap worden gegenereerd, zal worden beoordeeld.Kweek de geselecteerde hybridoma's gedurende vijf tot zeven dagen in DMEM. Na incubatie worden de antilichamen geoogst door al het medium uit de kweekfles te verzamelen en het medium vervolgens 10 minuten te centrifugeren bij 1100 ×g. Net als bij de gistcellen kunnen de antilichamen bij kamertemperatuur worden gewassen.Verzamel het supernatant zonder de pellets te verstoren. Zuiver vervolgens het celvrije supernatant met behulp van een proteïne AG-hars via F-P-L-C-A-capture. Eli SA wordt gebruikt om de concentratie van het monoklonale antilichaam te berekenen om te bepalen hoeveel van het gezuiverde antilichaam geïnjecteerd moet worden.Voer de intraperitoneale toediening van het PBS isotype-controleantilichaam of het experimentele antilichaam uit zoals beschreven in het bijbehorende schriftelijke protocol. Wacht twee uur na de injectie met het monoklonale antilichaam voordat de muis wordt geanestheseerd en wordt overgegaan tot de intranasale infectie; bereid tijdens deze wachttijd het Histoplasma capsulatum-inoculum voor zoals beschreven in het bijbehorende schriftelijke protocol en stel de draadapparatuur voor de infectie van de muis samen door een nylon- of katoenen draad strak tussen twee statieven te binden en de statieven vervolgens uit elkaar te trekken zodat de draad gespannen staat.De anesthesie bestaat uit ketamine met 100 mg/kg en xylazine met 10 mg/kg. Dit kan op dit moment worden voorbereid, wanneer de antilichamen voldoende tijd hebben gehad om te verspreiden. Anestheseer de muis en bevestig de sedatie door het ontbreken van een reactie bij een prikkel aan de teen.Pak de muis vast met een pincet. Hang de muis voorzichtig aan de draad bij de voortanden. Dien langzaam ongeveer 50 µL inoculum toe in de lucht met behulp van een micropipet.Houd de ademhalingsfrequentie van de muis nauwlettend in de gaten. Laat de muis na de intranasale infectie twee tot vijf minuten in deze positie rusten om de depositie van de gist in de longen van het dier te vergemakkelijken. Houd de muis in een gecontroleerde, warme omgeving, waarbij indien nodig voorzichtig gebruik wordt gemaakt van een warmtelamp, totdat het dier is hersteld van de anesthesie.Wanneer de muis ontwaakt, plaatst u deze terug in een schone kooi. Beoordeel de geïnfecteerde en schijngeïnfecteerde dieren klinisch, waarbij zij ad libitum toegang hebben tot voedsel en water. Voor het optimaliseren van de detectie van tachypneu, lethargie en gewichtsverlies moeten de dieren tweemaal daags door laboratoriumleden en dagelijks door dierverzorgers worden gecontroleerd.Bij acute histoplasmose tot vlak voor het einde van het leven zijn er doorgaans geen duidelijke tekenen van de infectie, afgezien van een lichte toename van de ademhalingsfrequentie. Bij een gevorderd stadium van de ziekte worden de muizen aanzienlijk magerder en vertonen ze een verminderde activiteit. Meestal worden ze snel lethargischer en komen ze te overlijden.Dieren in nood moeten op passende wijze worden geëuthanaseerd met koolstofdioxide in een speciale kamer. De dood moet worden bevestigd door het ontbreken van een reflexreactie op een kneepje in de teen; de overleden dieren moeten dagelijks worden geteld.Bereid 15 ml conische buizen voor met 10 ml PBS voor elk te verzamelen orgaan. Euthanaseer de dieren die zijn geïnoculeerd met de sublethale dosis van 5 × 10⁶ gistcellen zoals eerder aangetoond, en verwijder onmiddellijk de longen, milten en levers; bereid vervolgens 50 ml conische buizen voor met 5 ml PBS.Plaats een Petrischaal met celzeven van 70 micron voor elk orgaan dat gehomogeniseerd moet worden. Maceer elk orgaan afzonderlijk met zuigers van vijf milliliter en breng deze over naar buisjes van 50 milliliter. Verdun vervolgens het orgaanhomogenaat in drie seriële verdunningen van 1:100, 1:1.000 en 1:5.000, en plaat 100 microliters op BHI.Incubeer de bloedagarplaten bij 37 °C in een incubator met een normale kamerconcentratie aan koolstofdioxide gedurende maximaal 14 dagen en tel de CFU's. Het isotype van het monoclonale antilichaam is cruciaal voor de bescherming tegen hcaps Lotum, aangezien muizen die behandeld zijn met IgG1- of IgG2a-monoclonale antilichamen tegen HSP 60 een significant verlengde overleving vertoonden in vergelijking met controlemuizen die een IgG2b-monoclonaal antilichaam tegen HSP 60 of een isotype-controle-monoclonaal antilichaam of PS ontvingen. Bovendien was er bij muizen die beschermende monoclonale antilichamen ontvingen een significante afname van het aantal pulmonale en splenische CFU's op dag 7, en een afname van 2 en 2,5 log-eenheden van het aantal gisten in de longen op dag 14. Na deze procedure kunnen andere methoden worden uitgevoerd, zoals het bepalen van de fungale last (indicatief voor colony forming units), de cytokines die betrokken zijn bij de infectie en het evalueren van de topologie, om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals het definiëren van het werkingsmechanisme van de ziektebeïnvloeding door de antilichamen tijdens het uitvoeren van deze procedure.Het is belangrijk om eraan te denken om onder biologische veiligheidscondities te werken bij het hanteren van de knockout en om te werken volgens de diverzorgingsvoorschriften voor intranasale infecties.

passive-administration-monoclonal-antibodies-against-h-capsulatum

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Deze video toont de inductie en de klinische scoren van een diermodel van multiple sclerose: chronisch-recidiverende experimentele auto-immune encephalomyelitis in DA ratten. De ziekte, veroorzaakt door het immuniseren van ratten met een emulsie met hele rat het ruggenmerg en de volledige Freund's adjuvans, presenteert klinische symptomen lijken op de menselijke ziekte.

Inductie en Klinische Scoring van chronische-Relapsing experimentele autoimmune encefalomyelitis

Sommige muizenstammen in staat zijn om de inductie van experimentele auto-immuun encefalomyelitis (EAE) te weerstaan ​​met myeline basisch eiwit. Hier beschreven is een eenvoudige immunisatieprotocol dat het niet-reageren omkeert en induceert verlammende ziekte in een aantal typische EAE resistent muis vlekken.

Het overwinnen van reageert niet in experimentele autoimmune encefalomyelitis (EAE) Resistant muizenstammen door adoptieve overdracht en Antigene Challenge

This video demonstrates an efficient homogenization technique to generate an antigen-adjuvant emulsion to induce experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in a murine model. The emulsion contains an autoantigen — myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) — in the water phase, surrounded by a continuous oil phase comprising an inactivated pathogenic bacteria. The emulsion ensures a sustained release of antigens for a prolonged immune response.

Preparing an Antigen-Adjuvant Emulsion to Induce Autoimmune Encephalomyelitis

Experimentele autoimmuun encefalomyelitis (EAE) is een gevestigde diermodel voor multiple sclerose. C57BL / 6 muizen worden geïmmuniseerd met myeline oligodendrocyt glycoproteïne (MOG) peptide 35-55 (MOG 35-55), wat resulteert in een oplopende zwakke verlamming veroorzaakt door autoreactieve immuuncellen in het centrale zenuwstelsel. Protocollen voor de ziekte van inductie en toezicht zal worden besproken.

Myeline Oligodendrocyte glycoproteïne (MOG<sub&gt; 35-55</sub&gt;) Geïnduceerde experimentele autoimmuun encefalomyelitis (EAE) in C57BL / 6 muizen

Een geoptimaliseerd protocol wordt gepresenteerd voor de generatie van monoklonale antilichamen op basis van de hybridoma-technologie. Muizen werden geïmmuniseerd met een immunoconjugaat. Miltcellen werden gefuseerd door PEG en een elektrische impuls met onsterfelijke myeloomcellen. Antilichaam-producerende hybridoma-cellen werden geselecteerd door HAT en antigeen-specifiek ELISA-screening.

Genereren van monoklonale muizenantilichamen door Hybridoma Technology

Dit artikel bevat een gedetailleerd protocol voor de voorbereiding en de evaluatie van monoklonale antistoffen tegen natuurlijke producten voor gebruik in verschillende immunoassay. Deze procedure omvat immunisatie, celfusie, indirecte competitieve ELISA voor positieve kloon screening en monoclonal hybridoma voorbereiding. De specificaties voor de karakterisering van het antilichaam met behulp van MALDI-TOF-MS en ELISA analyses zijn ook beschikbaar.

Generatie van monoklonale antistoffen tegen natuurlijke producten

Dit manuscript presenteert een protocol om actieve experimentele auto-immuunenceomyelitis (EAE) bij muizen te induceren. Een methode voor de isolatie en karakterisering van de geïnfiltreerde lymfocyten in het centrale zenuwstelsel (CNS) wordt ook gepresenteerd om te laten zien hoe lymfocyten betrokken zijn bij de ontwikkeling van cns auto-immuunziekte.

Flow Cytometrische Analyse van lymfocyten infiltratie in het centrale zenuwstelsel tijdens experimentele auto-immuunenceomyelitis

Dit protocol schetst de stappen voor het induceren van Primed Myco bacteriële Uveïtis (PMU) bij muizen. Deze methode schetst de stappen om betrouwbare en robuuste oogontsteking in het muismodelsysteem te helpen produceren. Met behulp van dit protocol genereerden we uveitische ogen en niet-ontstoken medeogen van afzonderlijke dieren voor verdere evaluatie met immunologische, transcriptomische en proteomische assays.

Geprimed mycobacteriële uveïtis (PMU) als model voor post-infectieuze uveïtis

Om experimentele auto-immune encefalomyelitis, een diermodel van multiple sclerose, te induceren, worden muizen geïmmuniseerd met een water-in-olie-emulsie die een autoantigeen bevat en het adjuvans van Freund compleet maakt. Hoewel er verschillende protocollen bestaan voor de bereiding van deze emulsies, wordt hier een snel, eenvoudig en gestandaardiseerd homogenisatieprotocol voor emulsievoorbereiding gepresenteerd.

Een snelle, eenvoudige en gestandaardiseerde homogenisatiemethode om antigeen / adjuvante emulsies voor te bereiden voor het induceren van experimentele auto-immune encefalomyelitis

Hier presenteren we een alternatief protocol om actief experimentele auto-immuun encefalomyelitis te induceren bij C57BL / 6-muizen, met behulp van het immunogene epitoop myeline oligodendrocyte glycoproteïne (MOG) 35-55 gesuspendeerd in onvolledig Freund's adjuvans met de hitte-gedode Mycobacterium avium ondersoort paratuberculosis.

Adjuvante activiteit van mycobacterium paratuberculosis bij het verbeteren van de immunogeniciteit van autoantigenen tijdens experimentele auto-immune encefalomyelitis

Muizen zijn over het algemeen resistent tegen infecties door Mycobacterium abscessus, wat de ontdekking en ontwikkeling van de broodnodige antibiotica tegen longinfecties bemoeilijkt. Hier beschrijven we een methode van inoculumbereiding en intratracheale infectie waarvan is aangetoond dat deze een aanhoudende infectie veroorzaakt bij immunocompetente muizen.

Bereiding van in agarkraal ingebedde Mycobacterium abscessus om immunocompetente muizen intratracheaal te inoculeren

Leer passieve toediening van monoklonale antilichamen tegen Histoplasma capsulatum in C57BL/6 muizen. Deze methode onderzoekt de beschermende werking van humorale immuniteit tegen histoplasmose.

Passieve Toediening van monoklonale antilichamen tegen H. capsulatum Ea schimmels

Meer video's verkennen