Uitbreiding, zuivering, en functionele beoordeling van de humane perifere bloed NK-cellen

Het algemene doel van deze procedure is het snel expanderen van grote aantallen menselijke NK-cellen. Begin ex vivo met het isoleren van pBMC's of NK-cellen uit een buffy coat of een monster volbloed. Co-cureer vervolgens de pbmc met kunstmatige antigeenpresenterende cellen voor de expansie van NK-cellen.

Medium aangevuld met IL-2 wordt gebruikt om de kweek van NK-cellen gedurende drie weken in stand te houden, met wekelijkse stimulaties met aPCs, waarbij erop wordt gelet dat het aantal NK-cellen onder 1 × 10⁶ per milliliter kweek blijft. De functionele effectiviteit van de geëxpandeerde NK-cellen wordt ten slotte gevalideerd met een niet-radioactieve cytotoxiciteitstest. Een typische opbrengst aan NK-cellen via dit expansieschema resulteert aan het einde van 21 dagen in een mediane 21.000-voudige expansie van NK-cellen die, zoals bepaald via een calciumvrijgave-assay, een hoge cytotoxiciteit vertonen tegen diverse tumoren.

Deze medische procedure kan helpen bij het beantwoorden van een cruciale vraag in het veld van de NK-celbiologie, aangezien het historisch gezien zeer moeilijk was om grote aantallen NK-cellen te verkrijgen. Deze techniek heeft implicaties voor de immunotherapie van menselijke kanker, omdat het genereren van voldoende NK-cellen voor dergelijke therapie historisch gezien zeer moeilijk is geweest. Deze techniek zal worden gedemonstreerd door Cecily, de senior onderzoeksassistent van mijn laboratorium, om PBMC's te verkrijgen uit bloed van gezonde donoren.

Doorgaans wordt Buffy coat uit een bloedbank als bron gebruikt. Voeg eerst PBS toe om het volume van de Buffy coat aan te passen naar 140 milliliters. Laag vervolgens 35 milliliters monster op 15 milliliters fial PA voor de gradiëntscheidingscentrifuge bij 400 G gedurende 20 minuten.

Zonder de interface te verstoren. Herstel voorzichtig de P BMC's uit de Fial PA plasma-interface en zet de buis met RBC's apart voor later gebruik. Was de P BMC's drie keer met PBS door elke keer te centrifugeren bij 400 G gedurende 10 minuten.

Gebruik deze fractie P BMC's voor de expansie van NK-cellen. Keer nu terug naar de gradiëntbuis. Aspireer de fi.

Oogst de RBC's en breng ze over in twee centrifugebuizen van 50 milliliter en was deze met PBS tot aan de markering van 50 milliliter. Aspireer na centrifugatie het supernatant door de bovenlaag van de RBC-laag af te schepelen om granulocyten te verwijderen.

Voer drie wasbeurten uit, resuspendeer de RBC's vervolgens in een gelijk volume van else's oplossing en bewaar deze bij vier graden Celsius voor maximaal één maand. Deze RBC-fractie kan worden gebruikt voor roset SEP-zuivering van NK-cellen aan het einde van twee weken expansie. Om functionele NK-cellen ex vivo efficiënt te expanderen, worden K 5 62 kloon negen cellen met membraangebonden IL 21 gebruikt, hierna aangeduid als K 5 62.

Kloon negen IL 21 wordt gebruikt als kunstmatige antigeenpresenterende cel. Tel eerst de PBMC's en bereken het volume voor vijf keer 10⁶ cellen die gezaaid moeten worden voor NK-celexpansie. Voor elke vijf keer 10⁶ PBMC's worden 10 keer 10⁶ K 5 62 kloon negen IL 21 cellen geteld en bestraald. Met behulp van een gamma-bestralingsapparaat bij 100 Gy kunnen de bestraalde cellen ook worden ingevroren voor toekomstig gebruik. Was nu de vooraf bestraalde cellen met PBS en resuspendeer deze in NK-celexpansiemedium.

Voeg nu een twee-op-één verhouding van bestraalde cellen met PBMC toe aan 40 ml NK-cel-expansiemedium en plaats de T75-fles rechtop in een incubator bij 37 °C en 5% CO₂. Verzamel op dag drie de gestimuleerde cellen door centrifugatie bij 400 ×g gedurende vijf minuten, vervang de helft van het medium door vers NKEM en zet de kweek voort. Herhaal de mediumverversing op dag vijf. Tel aan het einde van één week het aantal cellen en zet 5 × 10⁵ cellen apart voor fenotypering via flowcytometrie. Tel voor de tweede stimulatie een één-op-één verhouding van K 562-cellen en bestraal deze.

Kloon negen IL 21-cellen om deze te expanderen en combineer de cellen vervolgens in NK-celexpansiemedium bij een totale concentratie van 2,5 × 10⁵ cellen per milliliter. Plaats de cellen nu in T75-flesjes en cultiveer ze verder; op dag 10 en 12 worden de cellen gepasseerd in NK-celexpansiemedium bij 2,5 × 10⁵ cellen per milliliter. Tel op dag 14 van de expansie opnieuw de cellen en bepaal het fenotype van een monster via flowcytometrie.

Zuiver deze uit PBMC's afgeleide cel-expansie met behulp van het rosette SEP-zuiveringsprotocol en verifieer de zuiverheid van de NK-cellen via flowcytometrie-fenotypering. Voer een derde stimulatie uit op de gezuiverde NK-cellen met een een-op-een verhouding van bestraalde K 5 62 kloon negen IL 21-cellen. Analyseer ten slotte op dag 21 de geamplificeerde NK-cellen via flowcytometrie met een volledig antilichaampanel voor fenotypering.

Bevries celvoorraden in FBS met 10% DMSO bij een maximale dichtheid van vijf keer 10⁷ cellen per vial. Gebruik voor de cytotoxiciteitstest of verse of bevroren NK-cellen. Indien bevroren NK-cellen worden gebruikt, ontdooi dan eerst de vial met NK-cellen en zaai deze 24 uur voor de dag van de assay uit in NKEM om herstel van de cellen mogelijk te maken; resuspendeer 10⁶ doelcellen in één milliliter NKEM met calcium en incubeer gedurende één uur bij 37 °C met af en toe schudden in een U-bodem 96-wells plaat; voeg in triplo 200 µL NK-cellen toe, gesuspendeerd op 1 × 10⁶ cellen per milliliter, en voer de seriële verdunning van de cellen uit zoals aangegeven.

Na één uur calciumbelading worden de doelcellen tweemaal gewassen in NK-celexpansiemedium door vijf minuten te centrifugeren bij 400 G. Tel nu de doelcellen opnieuw en resuspendeer deze op een concentratie van 1 × 10⁵ cellen per milliliter. Voeg 100 µL doelcellen toe aan elke well van de 96-wells plaat en centrifugeer één minuut bij 100 G om celcontact te initiëren; incubeer vervolgens gedurende vier uur bij 37 °C en 5% CO2.

Om het vrijgekomen calcium uniform te suspenderen, mengt u de cultuur voorzichtig door de pelletcellen vijf minuten lang bij 100 G te pipetteren en brengt u 100 µL van het supernatant over naar een nieuwe vlakke 96-wellplaat. Let er hierbij op dat er geen bellen ontstaan; indien nodig verwijdert u eventuele bellen met een fijne naald. Lees de plaat uit met een fluorescentieplaatlezer ingesteld op een excitatiefilter van 485 nanometers en een emissiefilter van 530 nanometers.

Bereken het percentage specifieke lysis. Doorgaans levert de expansie van vijf keer 10⁶ PBMC's geïsoleerd uit de buffycoat tussen 1 x 10⁹ en 10¹⁰ geëxpandeerde NK-cellen. Deze geëxpandeerde NK-cellen brengen verschillende NK-celreceptoren tot expressie die vergelijkbaar zijn met die van de niet-geëxpandeerde primaire NK-cellen in de buffycoat.

NK-cellen kunnen op dag 14 twee tot 18% van de pbmc vormen. Rosette SEP-zuivering van uitgebreide cellen kan 40 tot 70% van de in de kweek aanwezige NK-cellen terugwinnen, met een NK-celzuiverheid van 99%, aangetoond door CD3-negatieve CD56-positieve cellen. Uitgebreide NK-cellen hebben cytotoxiciteit aangetoond tegen een reeks tumorcellijnen, waaronder neuroblastoom, AML, osteosarcoom en melanoma.

Hier wordt de representatieve A ML-doding weergegeven als percentage specifieke lysis. De live BIOT-video toont de doding door NK-cellen van de neuroblastoom-cellijn CHP 1 34 beladen met calcium am na deze procedure. Andere methoden, zoals de analyse van cytokinenproductie door NK-cellen en adaptieve transfer in tumor-diermodellen, kunnen worden uitgevoerd om aanvullende vragen over de functies van de NK-cellen te beantwoorden.

Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe u grote aantallen NK-cellen kunt expanderen en zuiveren. Dit kan direct vanuit perifere mononucleaire bloedcellen worden gedaan, waarna de NK-cellen worden gezuiverd, of de expansie kan worden gestart met NK-cellen die zijn gezuiverd via de rosette-methode. Aan het begin zal een typisch buffy coat 15 tot 40 miljoen NK-cellen opleveren, die allemaal gebruikt kunnen worden om zeer grote aantallen NK-cellen te expanderen volgens het in deze methode beschreven schema.