Methoden voor snelle overdracht en localisatie van Lyme pathogenen in de Tick Gut
14 februari 2011
De ziekte van Lyme studies vereisen vaak generatie van de teken besmet met de ziekteverwekker Borrelia burgdorferi, een proces dat normaal gesproken duurt enkele weken. Hier laten we zien een micro-injectie-based tick infectie procedure die kan worden bereikt binnen enkele uren. We tonen ook aan een immunofluorescentie methode voor het in situ lokalisatie van B. burgdorferi in teken.
Het algemene doel van deze procedure is om borrelia berg de ferry cellen micro-injecteren en te lokaliseren in de darm van de teek. Dit wordt bereikt door eerst de glas capillaire naalden voor te bereiden en deze te vullen met beberg de ferry cellen. Vervolgens worden de beberg defer cellen overgebracht naar de darm van de teek via micro-injectie.
De teek wordt vervolgens gedissecteerd en de darmweefsels worden verwijderd. Ten slotte wordt immunofluorescence-labeling van beberg defer in de darm van de teek uitgevoerd. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de lokalisatie van beberg naar ferry in de darm van de teek aantonen met behulp van confocale microscopie.
Hallo, ik ben Dr.Ruth Paul Paul, assistent-professor aan de Universiteit van Maryland in het Departement van Veterinaire Geneeskunde. Vandaag zullen twee van mijn labledenden Toro Cairo, een postdoctoraal onderzoeker en Adam Coleman, een afgestudeerde student, u de procedure laten zien voor kunstmatige infectie van teken via micro-injectie die we routinematig in het laboratorium uitvoeren. Na micro-injectie, zullen we de teek dissecteren en de bacteriën in de darm van de teek afbeelden met behulp van confocale CE microscoop.
Het belangrijkste voordeel van micro-injectie van teken van een generatie van natuurlijk geïnfecteerde teken is de duur van de procedure. Micro-injectie verkort de hele procedure van weken tot uren, omdat ongeveer vijf weken nodig zijn om geïnfecteerde teken te genereren door natuurlijk voedingsproces. Deze techniek kan ook worden aangepast om andere nuttige reagentia te injecteren, zoals dubbelstrengs RNA voor RNAi of antisera voor specifieke antilichaaminterferentie in de teek.
Om te beginnen, fabriceert u verschillende micro-injectie naalden door één millimeter glazen capillaire buizen te verhitten en te trekken in een glazen micropipet trekapparaat. Verwijder voorzichtig de kwetsbare capillaire buizen. Bewaar de gepoolde naalden met de punt naar boven op plakband in een petrischaal.
Vervolgens, groei b berg de ferry in BSK cultuur. Medium tot een concentratie van ongeveer 10 tot de zeven cellen per milliliter pellet b berg de ferry door centrifugatie bij 3000 keer G gedurende 10 minuten. Bij kamertemperatuur, verwijder de snat en suspendeer de pellet volledig opnieuw in BSK medium door voorzichtig door een 200 microliter steriele microtip te leiden tot een eindconcentratie van 10 tot de negen cellen per milliliter.
Aangezien de cellen in hoge celdichtheid worden gesuspendeerd en zich kunnen bundelen, moet de celsuspensie onmiddellijk worden gebruikt voor micro-injectie om teken te bereiden, plaats dubbelzijdig plakband op een glazen plaat werken op een plakkerige mat, verwijder voorzichtig teken uit de container Gebruik een kleine borstel plaats het vereiste aantal teken dat moet worden geïnjecteerd op het plakband buikzijde omhoog in dezelfde richting. Laad vijf microliter van de beberg de ferry cultuur in de gepoolde capillaire naald. Gebruik een 20 microliter micro laadpijp tip, inspecteer de naald op vastzittende luchtbellen en laad de naald opnieuw met bacteriecultuur.
Indien nodig, bekijk de teek onder de dissectie binoculaire microscoop en focus op het anale apertuurgebied van de teek. Raak voorzichtig met de punt van de capillaire naald aan om het buisje te breken waar de diameter iets kleiner is dan die van het anale apertuur van de teek, waardoor de micro-injectienaald wordt gevormd. Deze stap is cruciaal, aangezien elke poging om teken te injecteren met niet-geschikte naaldpunta's letsel en mogelijk de dood veroorzaakt.
Naar de geïnjecteerde teek. Plaats de geïmmobiliseerde teken onder de dissectie binoculaire microscoop en focus op de anale apertuur, die bedekt is met twee beweegbare anale platen. Gebruik fijne pincetten, raak voorzichtig aan en breng zeer lichte druk uit op elk gebied nabij de anale apertuur.
Dit zal scheiding van de anale platen en opening van de anale porus die verbonden is met de darm toestaan. Breng voorzichtig de punt van de naald lichtjes in de anale apertuur door de gedwongen opening van de anale platen. De naaldinseratie moet tot een minimum worden beperkt, aangezien de glazen punt de semi-transparante achterdarm die verbonden is met het rectum kan beschadigen.
Gebruik een micro-injector uitgerust met een geautomatiseerde voetbediening om beberg de ferry oplossing te injecteren met behulp van de volgende parameters. 1000 Hector Pascals injectiedruk 0,2 seconden injectietijd en acht Hector Pascal's compensatiedruk. Elke teek ontvangt een enkele injectie na micro-injectie.
De teek zou tekenen van beweging of kruipen moeten vertonen als reactie op stimuli, vergelijkbaar met vóór de injectie. Om teken voor immunofluorescentiemicroscopie te dissecteren, plaatst u eerst een druppel fosfaatgebufferde zoutoplossing op een schone glazen plaat voor dissectie en een andere op een poly L lysine gecoate plaat Voor microscopie, bereidt u een andere glazen plaat met dubbelzijdig plakband voor. Vervolgens verwijdert u de teek uit de container en plaatst u deze op dubbelzijdig plakband.
Gebruik een kleine borstel onder de dissectiemicroscoop en focus op de teek, plaats een scherpe scheermes op de teek tussen de eerste en tweede paar poten. Druk stevig in en snijd de teek in twee stukken, waarbij de buik onmiddellijk ondergedompeld wordt in een druppel PBS met behulp van fijne pincetten. Pak de dorsale en ventrale exoskelet rond de snedesite.
Trek voorzichtig de dorsale schild omhoog en weg van de teek en exposeer de bruinachtige darmdivertikel. Wees voorzichtig om de dissectie teken onder de PBS te allen tijde te houden. De semi-transparante sali klierbundels bevinden zich aan weerszijden van het voorste gebied van de darm en kunnen op dit punt worden verwijderd indien gewenst.
Houd het resterende exoskelet op zijn plaats met pincetten, trek voorzichtig de darm uit de buik. Reinig de darm voorzichtig door eventuele gevangen weefsels zoals de trachia te verwijderen. Gebruik de punt van fijne pincetten, breng de darm van de teek snel over in een druppel PBS op een poly L lysine glazen plaat.
Scheid de darm in kleinere stukken met behulp van fijne bladen of door voorzichtig te drukken met de punt van fijne pincetten. Zuig voorzi
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een micro-injectie-gebaseerde methode voor het infecteren van teken met Borrelia burgdorferi, waardoor de tijd die nodig is voor tekeninfectie aanzienlijk wordt verminderd. Bovendien wordt een immunofluorescentietechniek gedemonstreerd voor het lokaliseren van het pathogeen binnen tekenweefsels.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Microbiologie
- Vectorbiologie
- Pathogeen lokalisatie
Achtergrond
- De ziekte van Lyme wordt veroorzaakt door de bacterie Borrelia burgdorferi.
- Teken zijn de primaire vectoren voor de overdracht van dit pathogeen.
- Traditionele methoden voor het infecteren van teken zijn tijdrovend.
- Snelle infectiemethoden kunnen de onderzoeksefficiëntie verbeteren.
Doel van de studie
- Om een snellere methode te ontwikkelen voor het infecteren van teken met B. burgdorferi.
- Om in situ lokalisatie van het pathogeen in tekenweefsels mogelijk te maken.
- Om de kennis over teken-pathogeen interacties te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Bereiding van glazen capillaire naalden voor micro-injectie.
- Micro-injectie van B. burgdorferi cellen in de tekenbuik.
- Dissectie van teken om buikweefsels te isoleren.
- Immunofluorescentielabeling van B. burgdorferi in buikweefsels.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle micro-injectie van B. burgdorferi in tekenbuiken.
- Effectieve lokalisatie van het pathogeen aangetoond door immunofluorescentie.
- Resultaten gevisualiseerd met behulp van confocale microscopie.
- De methode vermindert de tijd voor tekeninfectie aanzienlijk.
Conclusies
- De micro-injectietechniek is een haalbaar alternatief voor tekeninfectie.
- Immunofluorescentie maakt nauwkeurige lokalisatie van pathogenen mogelijk.
- Deze benadering kan verder onderzoek naar de overdracht van de ziekte van Lyme vergemakkelijken.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Rapid and controlled infection of tick vectors with Borrelia burgdorferi enables efficient study of pathogen-vector interactions critical for Lyme disease research. This microinjection approach reduces infection timelines from weeks to hours, supporting high-throughput screening and mechanistic de-risking in early discovery. The method provides reproducible pathogen delivery, enhancing predictive confidence in target validation and assay development workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of Borrelia burgdorferi-tick gut interactions to validate therapeutic targets involved in pathogen persistence and transmission.
- Operational Value: Delivers standardized pathogen loads across tick cohorts, reducing variability in infection models and improving assay reproducibility.
- Predictive Value: Supports functional target de-risking by allowing controlled exposure to pathogen strains, including those attenuated in murine models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates infected tick tissues suitable for downstream immunofluorescence and confocal imaging assays to quantify pathogen localization and burden.
- Operational Value: Produces quantifiable, microscopy-ready outputs that enable standardization of pathogen detection readouts across screening campaigns.
- Scalability: Facilitates preparation of large numbers of uniformly infected ticks, supporting assay reproducibility and platform reuse in vector-based screening platforms.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Provides a disease-relevant system for studying Borrelia burgdorferi localization in the tick gut, bridging in vitro findings to vector-based pathophysiology.
- Mechanistic De-risking: Enables visualization of pathogen distribution within tick tissues, informing hypotheses about tissue-specific virulence factors and transmission mechanisms.
- Preclinical Model Refinement: Supports risk-adjusted advancement decisions by delivering consistent pathogen exposure for evaluating intervention efficacy in tick-borne disease models.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from target validation through preclinical evaluation by enabling rapid generation of infected tick vectors and standardized pathogen localization readouts.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of pathogen-vector interactions by delivering controlled quantities of Borrelia burgdorferi to the tick gut for mechanistic interrogation.
- Screening: Produces standardized, infected tick tissues suitable for quantitative immunofluorescence assays, enhancing reproducibility in pathogen detection workflows.
- Analytics: Generates confocal microscopy-based readouts of pathogen localization and burden, enabling comparative analysis across experimental conditions and interventions.
- Translational Research: Connects in vitro pathogen culture to tick tissue localization, supporting biomarker alignment and pathophysiological relevance in vector-borne disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for infecting ticks with diverse biological agents, including antibodies and RNAi reagents, extending utility beyond Borrelia burgdorferi studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in pathogen-vector interactions through localized pathogen detection.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability of tick infection models, reducing time and resource investment compared to natural feeding methods.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision efficiency in early discovery by providing rapid, standardized pathogen exposure models for target de-risking.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of Lyme disease research initiatives through reliable, high-fidelity infection models that reduce biological variability.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microinjection techniques, tick handling, and confocal immunofluorescence microscopy.
- Depends on glass capillary needle preparation, microinjector instrumentation, and fluorescence microscopy infrastructure.
- Necessitates standardization of injection parameters and gut dissection protocols across teams to ensure consistent pathogen delivery and localization readouts.
- Adaptation to different tick species or pathogen strains may require optimization of needle size, injection pressure, and bacterial concentration.
- Practical limitations include the technical skill required for successful microinjection and gut dissection, as well as the need for biosafety level two containment when handling human pathogens.
