Name: Met behulp van Luciferase naar Afbeelding bacteriële infecties in Muizen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-18T18:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: Leer bioluminescentiebeeldvorming van bacteriële infecties in muizen met luciferase-expressie. Deze methode maakt real-time visualisatie en kwantificatie van pathogenen in levende dieren mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs bedanken de Cirillo laboratorium leden voor waardevolle discussies en hulp in deze studie. Wij danken dr. Joshua Hill en het laboratorium van Dr James Samuel voor hulp bij het tijdens de opnames van dit protocol. Dit werk werd gefinancierd door subsidie ​​48.523 van de Bill &amp; Melinda Gates Foundation en het verlenen van AI47866 van de National Institutes of Health.

1. Longinfectie door intratracheale intubatie <ol><li> Weeg muizen en, optioneel, markeringen kan worden gemaakt op de oren voor gemakkelijke identificatie. </li><li> Verdoven van de muizen met ketamine (100 pg per gram muis gewicht) en xylazine (10 pg per gram van muis gewicht) door intraperitoneale inenting. </li><li> Plaats muizen in kooien tot volledig verdoofd. Knijp de pads van hun voeten te trappen reflex te controleren. Muizen getoond moet worden verminderd of geen reflex reactie. </li><li> Plaats de muis op de intubatie stand liggend op zijn rug. </li><li> Fix een rubberen band om intubatie staan ​​en dan plaats onder de bovenste snijtanden van de muis. Gebruik tape om armen en benen op de intubatie stand te lossen. </li><li> Beweeg tougue uit de mond met behulp van pincet. </li><li> Plaats speculum met octoscope binnenkant van de mond en kijk naar oropharynx tot strottenhoofd opening zichtbaar is. </li><li> Advance voerdraad bedekt met cathether in de luchtpijp tot catether hub is bij de snijtanden. Verwijder de voerdraad. Doe lucht in cathether tot aan de borst groei te observeren en te corrigeren intubatie te bevestigen. </li><li> Injecteer 50 ul van bacteriële (in de getoonde afbeeldingen gebruikten we Bacillus Calmette Guerin (BCG) te drukken klikt u kever rood luciferase (CBRLuc), gebouwd in ons laboratorium, maar elke lichtgevende bacteriële stam kan worden gebruikt)-oplossing door middel van cathether met behulp van een 1 ml spuit. </li><li> Plaats de muis in een kooi en observeren tijdens het herstel van anesthesie. </li></ol> 2. Dier verdoving en voorbereiding voor het Bioluminescentie Imaging Muizen worden verdoofd met isofluraan het gebruik van de XGI-8 Gas Aneshesia System. <ol><li> Voordat u de XGI-8 anesthesie-systeem, wegen elk koolstoffilter bus en schrijf het gewicht en de datum erop. Als het gewicht is 50 gram over van het oorspronkelijke gewicht, vervang deze door een nieuwe bus. </li><li> Controleer het isofluraan niveau in de verdamper en vul deze indien nodig. </li><li> Zet de evacuatie pomp aan de voorkant van de XGI-8 anesthesie systeem en ingesteld op 8 lpm (liter per minuite). </li><li> Zet de zuurstoftoevoer van de hoge druk cilinder en zet deze op 55 psig. </li><li> Zet de zuurstof schakelen (groen) aan de voorzijde van de XGI-8 anesthesie-systeem. </li><li> Zet de gastoevoer naar de beeldvorming kamer om het niveau van de gasstroom in te stellen. Ingesteld op 0,25 lpm en zet de gasstroom. </li><li> Zet de gasstroom naar de anesthesie inductie kamer tot het niveau van de gasstroom in te stellen. Ingesteld op 1,5 lpm en zet gasstroom. </li><li> Zet de isofluraan met de verdamper en ingesteld op 2-2,5 procent. De isofluraan niveau kan worden aangepast afhankelijk van het aantal dieren dat wordt gebruikt en gewicht. </li><li> Plaats muizen in de inductie kamer en sluit het deksel. Zet de gastoevoer aan inductie kamer. Plaats muizen in de kamer voor 5 - 10 minuites tot ze volledig verdoven. </li><li> Van toepassing zijn optische zalf op de ogen om de muis ogen te beschermen tijdens beeldvorming en de muizen in de beeldvorming kamer in een van de neus kegels op de anesthesie spruitstuk. Gebruik lichte baffle tussen muizen om de reflectie van het licht te voorkomen dat op aangrenzende dier onderwerpen. </li><li> Injecteren luciferine (150 ug / gram lichaamsgewicht) door intraperitoneale inenting. </li></ol> 3. Bioluminescentie beeldvorming <ol><li> Start de Living Imaging Software. </li><li> Als het systeem niet geïnitialiseerd, initialiseren van de IVIS Imaging systeem. </li><li> Stel de parameters voor beeldverwerking door te klikken op volgorde setup in IVIS overname bedieningspaneel. Selecteer luminescentie en foto in de Imaging-modus. Als de optie uit te voeren DLIT 3D reconstructie gewenst is, selecteer fotografische, luminescente en structurele licht beelden als deel van het beeld sequentie. De belichting tijd van 0,5 sec tot 10 minuten. Stel binning en F / stop op basis van de verwachte helderheid van het monster. Stel excitatiefilter te blokkeren en emissie-filter te openen, tenzij van plan om alleen bepaalde golflengten van het licht te verwerven. In het geval van DLIT 3D-grondwet, die meerdere emissie filters van verschillende golflengten om nauwkeurige lokalisatie van de bron mogelijk te maken. Set FOV van A naar D, afhankelijk van het aantal muizen of het gebied van dier worden afgebeeld. Selecteer A en B voor een muis, C voor 2-3 muizen, en D voor 4-5 muizen. </li><li> Klik op toevoegen in de Image Wizard in de Overname Control Panel om de reeks setup toe te voegen. </li><li> Begin imaging volgorde door te klikken op verwerven. In het geval van DLIT 3D-constructie, zal lichtgevende beelden worden verworven voor meerdere emissie filters bij verschillende golflengten. Fotografische en gestructureerd licht beelden zullen ook worden verkregen. </li><li> Tijdens overname van het imago en bewerken van foto niveaus panelen zullen zichtbaar zijn. Vul zo gedetailleerd mogelijke informatie voor elk experiment als u wijzigingen op afbeelding om gemakkelijk traceren van beelden op latere tijdstippen te waarborgen en sla uw beelden. </li><li> ReRemove de muizen van IVIS beeldvorming kamer en breng ze terug naar hun kooien. Let op herstel van eenesthesia om muizen te waarborgen, werden niet significant beïnvloed door de procedure. Dieren moeten voortdurend worden gecontroleerd totdat ze volledig herstellen van anesthesie (meestal 1-2 min.). </li></ol> 4. Ex vivo Imaging en CFU-analyse voor de kwantificering van bacteriën in de longen <ol><li> Injecteren muizen met luciferine intraperitoneaal op dezelfde wijze als voor de beeldvorming, net voor euthanasie. </li><li> Euthanaseren de muizen door intraperitoneale injectie van 100 mg / kg pentobarbitol 5 minuten na luciferine injectie. </li><li> Explantatie de longen van de muizen en de plaats in de steriele petri-schalen met steriele pincet en een schaar. </li><li> Plaats petri-schaaltje met geëxplanteerd orgel in de beeldvorming kamer en verwerven bioluminescentie beelden op dezelfde wijze als voor de hele muis. </li><li> Na de beeldvorming, te verwijderen geëxplanteerde orgel uit petrischaal met behulp van steriele pincet en homogeniseren in 1 ml PBS. </li><li> Maak verdunningen en plaat weefsel op de juiste selectieve media. Gehomogeniseerd weefsel kan worden opgeslagen -80 ° C voor re-plating zou het nodig zijn. Als alternatief kan gehomogeniseerd weefsel worden gebruikt voor RNA-of DNA-extractie van bacteriële aantallen te kwantificeren door qPCR. </li></ol> 5. Analyse van de Luminescentie Imaging <ol><li> Start "Living Imaging Software" en zoek de beeldbestanden. </li><li> Gebruik "Tool Palette 'om beelden aan te passen. Klik op de afbeelding aanpassen om correctie / filter-instellingen en min / max voor individuele kleurschalen te wijzigen. </li><li> Gebruik ROI tools in pulldown lijst voor de kwantificering van de lichtintensiteit. Selecteer ROI vorm, aantal en grootte. Sleep ROI frame regio van de rente op beeld. Zorg ervoor dat alle ROI dezelfde grootte en vorm. Klik op ROI meten en op te slaan, te kopiëren en / of export kwantitatieve gegevens. </li><li> In het geval van DLIT 3D-reconstructies, load image sequence inclusief het gestructureerd licht beeld. Klik Surface topografie in de Tool Platte. In pulldown lijst, klikt u op het tabblad Reconstrueer aan de oppervlakte topografie te genereren. Een oppervlak puinhoop zal dan verschijnen in het venster. </li><li> Selecteer DLIT 3D reconstructie in de Tool Platte. In pulldown lijst, klikt u op het tabblad Eigenschappen om weefsel eigenschappen en de bron spectrum in te stellen. Spier is aan te bevelen onder de meeste omstandigheden. In de pulldown lijst, klik op het tabblad Analyseren van de golflengte voor analyse te selecteren. Klik op het tabblad Parameter en bevestig standaardwaarden of aan te passen DLIT parameters indien nodig. Klik op het tabblad Reconstrueer om 3D-analyse te starten. </li><li> Wanneer 3D-reconstructie is voltooid, zal de 3D-weergave van de resultaten van 3D-reconstructie. Klik op het tabblad resultaten voor analyse gegevens te bekijken voor foton dichtheid, voxels en DLIT algoritme parameters. </li><li> Op te slaan en / of export van de resultaten van de 3D-reconstructie analyses in cijfers en gegevens-bestanden. </li></ol> 6. Representatieve resultaten: De bioluminescentie beelden van muizen geïnfecteerd met bioluminescente bacteriën, samen met een niet-geïnfecteerde besturing van de muis zijn weergegeven in figuur 1. De muizen die besmet zijn met pulmonale bioluminescente bacteriën produceren significant signaal van de longen (figuur 1). Luminescentie-intensiteit wordt gekwantificeerd als de totale flux binnen een ROI (regio van belanghebbende) (figuur 2). De kwantitatieve gegevens voor licht-intensiteit is genormaliseerd voor kolonievormende eenheden (CFU) van bacteriën afkomstig van de longen om te bevestigen dat het signaal wordt geproduceerd uit de lichtgevende bacteriën en kan vergeleken worden met negatieve controle. De locatie en de intensiteit van het signaal kan verder worden geanalyseerd door DLIT 3D reconstructie van de luminescentie bron op basis van tomografie van de muis oppervlak 11. Deze analyses laten kwantificering en lokalisatie van de geproduceerde lichtgevende signaal. De resultaten van de 3D-reconstructie van een lichtgevende bron in geïnfecteerde muizen toont aan dat het licht wordt geproduceerd uit de longen van de muis (figuur 3). De ex vivo beelden van de resulterende muis longen te bevestigen dat luminescentie wordt uitgestoten uit de longen, in plaats van dan sommige andere nauw naast elkaar weefsel of orgaan (figuur 2C). <img src="/files/ftp_upload/2547/2547fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Luminescentie beeldvorming van pulmonale geïnfecteerde muizen met lichtgevende bacteriën getagd met CBRluc. Onbesmette controle muis is aan de linkerkant en twee geïnfecteerde muizen aan de rechterkant. Muizen werden besmet met bacteriën uiten CBRluc (n = 2) via de intratracheaal route. 10 minuten na luciferine injectie werden luminescentie beelden die gedurende 10 min bij 4 posities: rug-, buik, links en rechts. <img src="/files/ftp_upload/2547/2547fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. De kwantitatieve lichtintensiteit van muizen geïnfecteerd met bacteriën uiten CBRluc. (A, B) Luminescentie beelden van ROI-analyse en de gekwantificeerde totale flux van het licht van ROI in dorsale en ventrale posities, respectievelijk. Niet-geïnfecteerde muizen zijn aan de linkerzijde en twee geïnfecteerde muizen aan de rechterkant. Luminescentie beelden werden overgenomen van de longen of niet-geïnfecteerde muizen en geïnfecteerd met CBRlux (n = 2). De lichtintensiteit rond de longen werd gekwantificeerd door ROI-analyse. C) ex vivo beelden van de longen van niet-geïnfecteerde (boven) en geïnfecteerde (onderste twee sets van de longen) muizen. Luciferine werd geïnjecteerd 5 miniuts voor van de euthanasie en de beelden werden vervolgens overgenomen. De gekwantificeerde waarden zijn genormaliseerd naar CFU. <img src="/files/ftp_upload/2547/2547fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. De 3D-reconstructie van bioluminescentie bron (nen) van een long geïnfecteerd muis. De muis was besmet met bacteriën te drukken CBRluc intratracheale injectie. Het beeld sequentie werd verkregen met behulp van verschillende filters emissie van seriële golflengtes van 540 nm tot 700 nm. Een beeld sequentie werd gebruikt voor de 3D-reconstructie voor luminescentie bron in dier onderwerpen die een gestructureerde imag bevatte. A) De tomografie voor de muis is te zien in verschillende posities: voor, achter, links en rechts. Lichtbronnen worden weergegeven als voxels (rode vakjes in 3D-muis), die zich binnen de longen, zoals bepaald door de wederopbouw. B) Photon densiy kaart van gemeten en gesimuleerde data. Het vergelijken van de gemeten en gesimuleerde foton dichtheid rondingen geven de informatie van de kwaliteit van de wederopbouw. Goede kwaliteit reconstructies resulteren in vergelijkbare gemeten en gesimuleerde foton dichtheden.

<ol><li>Wilson, T., Hastings, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 14, 197-230 (1998).</li>
<li>Contag, C. H., Bachmann, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+in+vivo+bioluminescence+imaging+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Advances in in vivo bioluminescence imaging of gene expression.</a> Annu Rev Biomed Eng. 4, 235-260 (2002).</li>
<li>Hutchens, M., Luker, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+bioluminescence+imaging+to+the+study+of+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Applications of bioluminescence imaging to the study of infectious diseases.</a> Cell Microbiol. 9, 2315-2322 (2007).</li>
<li>Doyle, T. C., Burns, S. M., Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+bioluminescence+imaging+for+integrated+studies+of+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">In vivo bioluminescence imaging for integrated studies of infection.</a> Cell Microbiol. 6, 303-317 (2004).</li>
<li>Wood, K. V., Lam, Y. A., Seliger, H. H., McElroy, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementary+DNA+coding+click+beetle+luciferases+can+elicit+bioluminescence+of+different+colors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Complementary DNA coding click beetle luciferases can elicit bioluminescence of different colors.</a> Science. 244, 700-702 (1989).</li>
<li>Wet, J. R. de, Wood, K. V., Helinski, D. R., DeLuca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+firefly+luciferase+cDNA+and+the+expression+of+active+luciferase+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cloning of firefly luciferase cDNA and the expression of active luciferase in Escherichia coli.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 82, 7870-7873 (1985).</li>
<li>Hastings, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemistries+and+colors+of+bioluminescent+reactions%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Chemistries and colors of bioluminescent reactions: a review.</a> Gene. 173, 5-11 (1996).</li>
<li>Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emission+spectra+of+bioluminescent+reporters+and+interaction+with+mammalian+tissue+determine+the+sensitivity+of+detection+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Emission spectra of bioluminescent reporters and interaction with mammalian tissue determine the sensitivity of detection in vivo.</a> J Biomed Opt. 10, 41210-41210 (2005).</li>
<li>Rice, B. W., Cable, M. D., Nelson, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+light-emitting+probes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of light-emitting probes.</a> J Biomed Opt. 6, 432-440 (2001).</li>
<li>Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photonic+detection+of+bacterial+pathogens+in+living+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts.</a> Mol Microbiol. 18, 593-603 (1995).</li>
<li>Kuo, C., Coquoz, O., Troy, T. L., Xu, H., Rice, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstruction+of+in+vivo+bioluminescent+sources+based+on+multispectral+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstruction of in vivo bioluminescent sources based on multispectral imaging.</a> J Biomed Opt. 12, 024007-024007 (2007).</li>
<li>Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clearer+vision+for+in+vivo+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A clearer vision for in vivo imaging.</a> Nat Biotechnol. 19, 316-317 (2001).</li>
</ol>

Dierstudies werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en voorschriften uiteengezet door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van Texas A &amp; M University in te stellen.

Hoewel het volgen van deze protocollen zal meestal resulteren in hoge kwaliteit beelden, is het belangrijk om een ​​paar belangrijke punten te overwegen om accurate en consistente gegevens uit beeldvormend onderzoek te verkrijgen. Luminescentie afbeeldingen moeten worden verworven die telt van 600 tot 60.000 om ervoor te zorgen dat het signaal boven de achtergrond en de camera is niet verzadigd. Indien de verkregen signaal is minder dan 600 de blootstelling voorwaarden moeten worden aangepast aan de tellingen te verhoge...

<table><tbody><tr><td>Isofluraan</td><td>VETONE</td><td>501027</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine </td><td>Butler Animal Health Supply</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylazine </td><td>MP Biomedicals</td><td>158307</td><td></td></tr><tr><td>Luciferine</td><td>GMT</td><td>LUCK-100</td><td></td></tr><tr><td>Fetal plus-oplossing</td><td>Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Catheter (22G x 1&amp;#8221;)</td><td>Terumo Medical Corp.</td><td>OX2225CA</td><td></td></tr><tr><td>Geleiderdraad </td><td>Hallowell EMC</td><td>210A3491</td><td></td></tr><tr><td>Octocope met speculum </td><td>Hallowell EMC</td><td>000A3748</td><td></td></tr><tr><td>Xenogen IVIS-systeem</td><td>Caliper Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XGI-8-gas anesthesiesysteem</td><td>Caliper Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Living Imaging-software</td><td>Caliper Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transparante neuskappen</td><td>Caliper Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lichtscherm-scheidingswand </td><td>Caliper Life Sciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

met behulp van luciferase naar afbeelding bacteriële infecties in muizen

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Imaging is een waardevolle techniek die gebruikt kan worden om biologische processen te controleren. In het bijzonder, kan de aanwezigheid van kankercellen, stamcellen, specifieke immuun soorten cellen, virale pathogenen, parasieten en bacteriën worden gevolgd in real-time in levende dieren 1-2. Toepassing van de bioluminescentie beeldvorming aan de studie van pathogenen heeft voordelen ten opzichte van conventionele strategieën voor de analyse van infecties in diermodellen 3-4. Infecties kunnen gevisualiseerd worden binnen individuele dieren na verloop van tijd, zonder dat euthanasie op de locatie en hoeveelheid van de ziekteverwekker te bepalen. Optische beeldvorming maakt uitgebreid onderzoek van alle weefsels en organen, in plaats van bemonstering van de sites die eerder bekend te zijn besmet. Daarnaast kan de nauwkeurigheid van de enting in specifieke weefsels direct worden bepaald voor de verdere uitvoering van dieren die zonder succes werden ingeënt in het hele experiment. Variabiliteit tussen de dieren kunnen worden gecontroleerd voor, omdat imaging maakt het mogelijk elk dier afzonderlijk worden gevolgd. Imaging heeft het potentieel om grote behoefte aantal dieren te verminderen vanwege de mogelijkheid om gegevens uit tal van tijd punten te verkrijgen zonder dat u afgenomen weefsels te bepalen pathogeen laden 3-4. Dit protocol beschrijft methoden om infecties in levende dieren met behulp van bioluminescentie beeldvorming voor recombinante stammen van bacteriën te drukken luciferase te visualiseren. De klik kever (CBRLuc) en vuurvlieg luciferases (FFluc) gebruiken luciferine als een substraat 5-6. Het licht geproduceerd door zowel CBRluc en FFluc heeft een breed golflengte van 500 nm tot 700 nm, waardoor deze luciferases uitstekende verslaggevers voor de optische beeldvorming in het leven diermodellen 7-9. Dit komt vooral doordat golflengten van het licht groter is dan 600 nm zijn verplicht om absorptie te voorkomen door hemoglobine, en dus efficiënt reizen door weefsel van zoogdieren. Luciferase is genetisch ingebracht in de bacteriën om te lichtsignaal 10 te produceren. Muizen worden pulmonale geënt met bacteriën bioluminescente intratracheaal de monitoring van infecties in real time mogelijk te maken. Na luciferine injectie, worden de beelden verkregen met behulp van de IVIS Imaging System. Tijdens de beeldvorming, muizen verdoofd met isofluraan met behulp van een XGI-8 Gas Anethesia System. Beelden kunnen worden geanalyseerd om te lokaliseren en het signaal bron, die de bacteriële infectie site (s) en het nummer staat voor respectievelijk kwantificeren. Na de beeldvorming, is CFU bepaling uitgevoerd op gehomogeniseerd weefsel om de aanwezigheid van bacteriën te bevestigen. Meerdere doses van bacteriën worden gebruikt om bacteriële aantallen correleren met luminescentie. Beeldvorming kan worden toegepast op studie van de pathogenese en de evaluatie van de werkzaamheid van antibacteriële verbindingen en vaccins.

Methoden voor bioluminescentie beeldvorming van bacteriële infecties bij levende dieren beschreven. Ziekteverwekkers worden aangepast om luciferase te drukken waardoor optisch het gehele lichaam van infecties in levende dieren. Diermodellen kunnen besmet zijn met luciferase uitdrukken pathogenen en de daaruit voortvloeiende beloop van de ziekte gevisualiseerd in real-time door bioluminescentie imaging.

Met behulp van Luciferase naar Afbeelding bacteriële infecties in Muizen

Beeldvorming is een waardevolle techniek die kan worden gebruikt om biologische processen te monitoren. In het bijzonder de aanwezigheid van kankercellen, stamcellen, specifieke ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om een kwantitatief beeld te verkrijgen van een infectie in levende dieren, waardoor lokalisatie van het infecterende organisme binnen de weefsels en organen van de gastheer mogelijk is. Geanestheseerde muizen worden eerst intratracheaal geïnfecteerd met bioluminescente bacteriën. Geïnfecteerde muizen worden vervolgens geïnjecteerd met Luciferian, waardoor live-imaging in het IVIS-systeem kan worden uitgevoerd.Zodra de beelden van het gehele lichaam zijn verkregen, worden de geïnfecteerde longen geoogst. Beeldvorming van de geïsoleerde organen kan worden uitgevoerd om de exacte lokalisatie van het pathogeen aan te tonen. Na de beeldvorming worden de longen gehomogeniseerd en in verdunningsreeksen uitgeplaat op bacterieel groeimedium voor kwantificering van de microbiële last.Uiteindelijk worden resultaten verkregen die in real time de locatie en het aantal pathogenen in de gastheer tonen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is dat pathogenen in levende dieren kunnen worden gevisualiseerd en gemonitord via real-time imaging, wat inzicht geeft in de ruimtelijke dynamiek van microbiële infecties. Deze procedure zal worden gedemonstreerd door Dr. Mihi Chang, een postdoctoraal onderzoeker in mijn laboratorium, en SWAT Cillo, een onderzoeker in mijn laboratorium.Begin met het intraperitoneaal injecteren van 6 tot 12 weken oude BALB/c-muizen met een vooraf gemengde anesthesie-oplossing die 100 micrograms ketamine en 10 micrograms xylazine per gram lichaamsgewicht van de muis bevat. Plaats de muizen terug in hun kooien totdat de anesthesie is ingetreden. Om vast te stellen of de anesthesie volledig is, knijp dan in het voetzoolkussentje van elke muis om te controleren of er geen pedaalreflex optreedt.Zodra de dieren volledig zijn geanestheseerd, neemt u één muis en plaatst u deze op de intubatiestand. Leg de muis op haar rug. Gebruik tape om de poten en armen van de muis op de standaard te fixeren.Bevestig een elastiekje aan de intubatiestandaard. Plaats het vervolgens onder de bovenste snijtanden van de muis. Zodra de muis is geïmmobiliseerd, gebruikt u een pincet om de tong voorzichtig uit de mond te trekken.Voer vervolgens voorzichtig het speculum met de otoscoop in de bek van de muis in en zoek de larynxopening, die zich vóór de slokdarm aan de ventrale zijde van de orofarynx bevindt. Zodra de larynxopening is geïdentificeerd, wordt een 22 gauge katheter van één inch met een geleidingsdraad in de trachea ingebracht tot de hub van de katheter de snijtanden bereikt. Verwijder de geleidingsdraad en verbind de katheter met de plastic pomp.Duw vervolgens lucht in de katheter. De borstkas van de muis zal opbollen als de intubatie correct is uitgevoerd. Zodra de correcte plaatsing van de katheter is bevestigd, pipetteer je 50 µL bioluminescente bacteriële oplossing met de gewenste concentratie in de katheter, en bevestig je een spuit van 1 mL met 50 µL lucht om de oplossing in de longen van de muis te duwen.Verwijder de katheter twee of drie keer en plaats de muis terug in de kooi omstreeks het herstel van de anesthesie. Voorafgaand aan de bioluminescentie-imaging worden de muizen geanestheseerd met isofluraan. Zodra de muizen volledig geanestheseerd zijn, worden ze uit de inductiekamer gehaald en wordt er voorzichtig optische zalf aangebracht om de ogen van het dier te beschermen.Plaats de muizen tijdens de beeldvorming elk in de beeldvormingskamer en één van de neuskegels op het anesthesiemanifold. Gebruik een lichtscherm tussen de muizen om reflectie van licht tussen aangrenzende proefdieren te voorkomen. Injecteer tenslotte elke muis intraperitoneaal met 150 micrograms per gram lichaamsgewicht Lucifer.Laat de Lucifer 10 minuten lang verspreiden door het lichaam van het dier. Begin vervolgens met de beeldvorming. Start de software voor live-imaging en initialiseer het IVIS-beeldvormingssysteem.Klik eerst op sequence setup om de parameters in te stellen. Selecteer vervolgens de modus voor luminescentie- en fotografische beeldvorming. Selecteer fotografische luminescentie- en structurele lichtbeelden als onderdeel van de beeldsequentie om DLIT 3D-reconstructie mogelijk te maken.Stel vervolgens de belichtingstijd in op één minuut. Pas daarna de binning aan naar medium en de F-stop naar één. Stel het excitatiefilter in op blokkeren en de emissiefilters op open; voor 3D-reconstructie kunnen meerdere filters met verschillende golflengten worden ingeschakeld.Selecteer het FOV dat overeenkomt met het aantal te visualiseren muizen om een nauwkeurige lokalisatie van de signaalbron mogelijk te maken. Zodra alle instellingen zijn gedefinieerd, klikt u in de image wizard in het acquisitiecontrolepaneel op 'add' om de sequentie-instellingen toe te voegen en klikt u op 'acquire' om de beeldgevingssequentie tijdens de acquisitie te starten. Noteer de experimentele details en condities in het venster 'edit image' en sla de beelden op.Verwijder ten slotte de muizen uit de beeldvormingskamer en plaats ze terug in hun kooien. Houd de dieren constant in de gaten tot ze volledig hersteld zijn van de anesthesie. Voor weefselbeeldvorming worden de muizen humaan geëuthanaseerd.Oogst op dit punt aseptisch de longen van elke muis en breng de organen over naar een steriele petrischaal. Plaats de petrischaal met de geïnfecteerde longen in de beeldvormingskamer en neem bioluminescentiebeelden op op dezelfde manier als eerder in deze video beschreven. Zodra de beelden zijn verkregen, verwijder je de petrischaal uit de beeldvormingskamer en breng je de longen met een steriele pincet over naar een buisje met één milliliter steriele PBS; homogeniseer de longen vervolgens gedurende twee tot vijf minuten met een homogenisator.Bereid seriële verdunningen van de longhomogenaten in steriele PBS. Plateer vervolgens 100 µL van elke verdunning op Petri-schalen met selectief medium. Incubeer de culturen bij 37 °C totdat bacteriële kolonies duidelijk zichtbaar zijn.Tel vervolgens de CFU om het infectieniveau te bepalen. Start de living image-software en open de gewenste afbeeldingsbestanden via de bestandsbrowser. In het gereedschapspalet.Klik op beeldinstellingen om de correctie- en filterinstellingen en de drempelwaarden van de kleurenschaal aan te passen. Om de luminescentie-intensiteit te kwantificeren, gebruikt u de tools voor het interessegebied of ROI uit de vervolgkeuzelijst en selecteert u de vorm, het aantal en de grootte van de ROI. Klik vervolgens op ROI-meting en sla de kwantitatieve data-output op om 3D-beelden te reconstrueren.Laad eerst de beeldreeks, inclusief de beelden met gestructureerd licht. Klik op surface topography in het toolpalet. Selecteer vervolgens in de uitklaplijst het tabblad reconstruct om een oppervlaktopografie te genereren.Selecteer vervolgens DILT 3D reconstruction in het gereedschapspalet. Klik in de uitklaplijst op het tabblad properties en stel de weefseleigenschappen en het bronspectrum in op muscle. Klik op het tabblad analyze en selecteer de golflengte voor analyse.Klik vervolgens op start. Zodra alle instellingen zijn aangepast, klikt u op reconstruct om de 3D-analyse te starten. Wanneer de 3D-reconstructie voltooid is, selecteert u 3D-weergave om de resultaten weer te geven; door op het tabblad resultaten te klikken, kunnen de fotonendichtheid, datavoxels en algoritmeparameters worden bekeken. Sla de resultaten op en exporteer de gegevens en afbeeldingen voor verdere analyse.Zoals in deze figuur wordt getoond, produceren de twee muizen aan de rechterkant, die intratracheaal zijn geïnfecteerd met 10⁶ CFU bioluminescente bacteriën, een sterk signaal vanuit het longgebied, terwijl de niet-geïnfecteerde muis aan de linkerkant dit niet doet. Een soortgelijke analyse met enkel gedissecteerde longen van geïnfecteerde muizen bevestigt dat de luminescentie afkomstig is uit de longen en niet uit een ander dichtbij gelegen weefsel. Het signaal dat van het monster uitgaat, kan eenvoudig worden gekwantificeerd als de totale flux binnen een region of interest.Een tomografische analyse bevestigt dat de positie van de luminescentie, in deze afbeeldingen weergegeven als rode kaders, binnen het gebied van de longen van de muis valt, zoals bepaald door 3D-reconstructie. Ten slotte getuigt de overeenkomst tussen de gemeten foton-dichtheidscurve links en de gesimuleerde foton-dichtheidscurve rechts van de goede kwaliteit van de reconstructie. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe u dieren die zijn geïnfecteerd met precedent kunt beeldvormen en hoe u de beelden kunt analyseren voor de lokalisatie en kwantificering van reminiscence.

using-luciferase-to-image-bacterial-infections-in-mice

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Bioluminescent Bacteriële Imaging<em&gt; In Vivo</em

Source: Valentine, M. E., et al. Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the use of bioluminescence to visualize and compare the in vivo behavior of virulent and attenuated bacterial strains in mice. It outlines the preparation of bioluminescent bacterial suspensions and their intraperitoneal injection into mice. The virulent strain exhibits...

Tracking Bacterial Infection Dynamics in a Mouse Using Bioluminescence

Source: de Vries, C. R., et al., A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection. J. Vis. Exp. (2020).This video demonstrates a bioluminescent imaging technique to monitor bacterial infection progression in a live mouse model. Pathogenic bacteria engineered with the luxABCDE reporter system emit light at the infection site, allowing visualization of metabolically active bacteria. By imaging the mouse over time, researchers can non-invasively track infection...

Bioluminescence Imaging of Bacterial Infections in Mice

Source: Valentine, M. E., et al., Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the use of a bioluminescence-based imaging approach to monitor bacterial infection in a live mouse model. Sequential bioluminescent and X-ray imaging enables real-time visualization and anatomical localization of infection spread throughout the host.

Real-Time Imaging of Bacterial Infection in a Mouse Model Using Bioluminescence

Source: Luyts, N., et al. Longitudinal Follow-Up of Urinary Tract Infections and Their Treatment in Mice using Bioluminescence Imaging. J. Vis. Exp. (2021).This video demonstrates the induction and tracking of urinary tract infection in a mouse model using bioluminescent E. coli injected into the bladder, where bacterial adhesion, invasion, and intracellular replication occur. The emitted light from the bioluminescent operon serves as a real-time marker of bacterial load during infection...

Visualization of Urinary Tract Infection in a Mouse Model Using Bioluminescence

This video demonstrates a method to track viral infections in mouse models using a recombinant luciferase and fluorescence protein-expressing bi-reporter Influenza A virus. This method enables both in vivo and ex vivo studies, enabling researchers to gain insights into viral dynamics and the effects of interventions.

A Luciferase-Fluorescent Reporter Influenza Virus to Track Viral Infections

Multi-modaliteit beeldvorming is een waardevolle benadering voor het bestuderen van bacteriële kolonisatie in kleine proefdiermodellen. Dit protocol beschrijft infectie van muizen met...

4D multimodale beeldvorming van<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Infecties in Muizen

Streptococcus pneumoniae is de toonaangevende ziekteverwekker waardoor ernstige community-acquired pneumonie en verantwoordelijk voor meer dan 2 miljoen doden wereldwijd. De invloed van bacteriële factoren betrokken bij fitness of virulentie kan worden gevolgd in real-time in een acute muis longontsteking of bacteriëmie model met behulp van bioluminescentie bacteriën.

Na in Real Time de impact van Pneumokokken virulentiefactoren in een acute longontsteking Muis Model Met behulp van Bioluminescent Bacteriën

We beschrijven de optische beeldvorming van muizen besmet met Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) met behulp van verslaggever enzym fluorescentie (REF). Dit protocol vergemakkelijkt de gevoelige en specifieke detectie van M. tuberculosis in pre-klinische diermodellen voor pathogenese, therapeutics en vaccin onderzoek.

Mycobacterium tuberculosis in muizen met verslaggever enzym fluorescentie Imaging

Influenza A virussen (IAVs) zijn besmettelijke respiratoire pathogenen die jaarlijkse epidemieën en occasionele pandemie veroorzaken. Hier beschrijven we een protocol voor het opsporen van virale infecties in vivo met behulp van een roman recombinant plaats en fluorescentie-uitdrukken van bi-reporter iav (birflu). Deze aanpak biedt onderzoekers een uitstekend hulpmiddel om IAV in vivo te bestuderen.

Een Luciferase-fluorescerende reporter influenza virus voor Live beeldvorming en kwantificering van virale infectie

Dit manuscript beschrijft de intravesicale toediening van uropathogene bacteriën met een lux operon om een urineweginfectie bij muizen te induceren en de daaropvolgende longitudinale in vivo analyse van de bacteriële belasting met behulp van bioluminescentie beeldvorming.

Longitudinale follow-up van urineweginfecties en hun behandeling bij muizen met behulp van bioluminescentiebeeldvorming

Leer bioluminescentiebeeldvorming van bacteriële infecties in muizen met luciferase-expressie. Deze methode maakt real-time visualisatie en kwantificatie van pathogenen in levende dieren mogelijk.

Met behulp van Luciferase naar Afbeelding bacteriële infecties in Muizen

Meer video's verkennen