Intravitale Microscopie van de lies lymfkliertest

Het algemene doel van deze procedure is om de voedende slagader van de inguinale lymfeklier in vivo te visualiseren en te evalueren. Dit wordt bereikt door eerst een huidlap te creëren door de huid in de inguinale regio van de muis, die de inguinale lymfeklier bedekt, zorgvuldig te dissecteren. Vervolgens wordt het bindweefsel dat over het gebied van de lymfeklier ligt, losgemaakt.

Vervolgens moet het omliggende vetweefsel worden verwijderd om de aanvoerende arteriële vasculatuur van de lymfeklier bloot te leggen. Tot slot worden veranderingen in de vasculatuur van de lymfeklier gevisualiseerd en geëvalueerd via intravitale microscopie P, hoewel de preparatie die u vandaag zult zien de microcirculatie van de inguinale lymfeklier is. Deze chirurgische technieken kunnen worden toegepast voor andere preparaties, zoals skeletspieren en de hersenen.

Over het algemeen hebben beginners bij het uitvoeren van deze techniek met twee hoofdoorzaken moeite. Ten eerste heeft men te maken met een levend dier, en ten tweede kan, omdat de chirurgische ingreep op een zeer klein gebied plaatsvindt, elke vorm van verstoring van het vat zelf of het omliggende gebied een negatieve impact hebben, wat nadelig zou zijn voor het experiment dat u wilt uitvoeren. De visuele demonstratie van deze techniek is cruciaal voor het succes.

Er zijn een aantal complexe stappen betrokken die zich niet gemakkelijk vanuit tekst vertalen naar de feitelijke uitvoering van de techniek. Het is belangrijk om dit te zien om het correct uit te voeren. Veel succes.

De muis wordt eerst geanestheseerd en het operatiegebied wordt geschoren. Raadpleeg het tekstmanuscript voor details. De muis kan vervolgens in rugligging op een doorzichtige operatieplaat worden geplaatst.

Bevestig de muis aan het bord door elke voetpad vast te tapen. Meng de dag voor het experiment de thes guard 180 4 volgens de instructies van de fabrikant. Giet het mengsel vervolgens met een standaard wegwerppetrischaal als mal tot een diepte van ongeveer een kwart inch en laat het een nacht uitharden. Verwijder de thes guard uit de petrischaal en plaats deze op het chirurgische bord.

Plaats de geschoren, geanestheseerde muis onder de dissectiescoop. Maak een midline-incisie langs het ventrale oppervlak van de buikholte met roestvrijstalen pincetten nummer vijf en rechte veerschaartjes. Zet de midline-incisie vervolgens diagonaal voort richting de ledematen en trek de huid terug naar de wervelkolom.

Zodra de ln duidelijk zichtbaar is, wordt de teruggetrokken huid met roestvrijstalen insectenspeldjes en epoxygecoate inox pincetten op de cigar 180 4 pedestal vastgezet. Voeg fysiologische zoutoplossing of PSS toe aan het gebied.

Verwijder vervolgens de dunne laag bindweefsel die over het gebied rond de ln ligt. Gebruik een pincet om voorzichtig kleine stukjes bindweefsel op te pakken en deze weg te disseceren van de ln. Gebruik daarna een veerschaar om het vetweefsel dat over en rond de LN ligt te verwijderen, totdat het microvasculaire bed is blootgelegd.

Bij deze stap is het belangrijk om voorzichtig te zijn en er nooit contact te maken tussen de chirurgische instrumenten en de betreffende vasculatuur, of de vaten te beschadigen door te veel kracht uit te oefenen bij het manipuleren van het omliggende weefsel. Het vet wordt bij voorkeur rondom de ln verwijderd door het bindweefsel los te maken, het vetweefsel met een pincet vast te houden en dit vervolgens voorzichtig weg te nemen totdat het gezichtsveld vrij is. Zodra het bindweefsel en het vetweefsel zijn verwijderd, kunnen het belangrijkste arteriële segment naast de LN en de daaroverheen gelegen begeleidende ven worden gevisualiseerd.

Zodra het betreffende vaatsegment onder het dissectiemicroscoop is blootgelegd, wordt het preparaat op de intravitale microscoop vastgezet. Stel de superfusie- en zuiglijnen in. Tijdens dit deel van de procedure is het essentieel dat het blootgelegde weefsel constant wordt gesuperfuseerd met de geëquilibreerde PSS-oplossing.

Superfusie van PSS vindt plaats door zwaartekracht. De vloeistof stroomt vanuit een initieel reservoir naar een verwarmd reservoir met watermantel dat wordt geperfundeerd met 5% koolstofdioxide in stikstof, en vloeit vervolgens via een druppelleiding met een snelheid van 10 milliliters per minuut naar beneden. Een zuiglijn moet worden gebruikt om de gesuperfuseerde PSS weg te trekken van het preparaat door deze aan de onderzijde van de huidflap te plaatsen; vervolgens moeten de temperatuur van het circulerende waterbad en de snelheid van de PSS-superfusie worden gecontroleerd en aangepast om een optimale temperatuur van ongeveer 36 °C te bereiken.

Laat het vaatstelsel gedurende de voorbereiding gedurende ten minste 60 minuten equilibreren met PSS. Gebruik een rectale thermometer om te controleren dat het dier niet hypotherm wordt en plaats een externe warmtelamp. Terwijl de PSS equilibreert, wordt de diameter van het bloedvat gekwantificeerd.

Gebruik de videomeetklauwen op meerdere tijdstippen om te controleren of het vat is gestabiliseerd; stabilisatie wordt gedefinieerd als een diameter die gedurende een periode van 20 minuten constant blijft binnen vijf micrometers. Diameter-metingen worden op een computer geregistreerd met behulp van ChartLab-software. Beoordeel na de equilibratieperiode de gezondheid van het vat met een agonist die specifiek is voor gladde spieren, zoals fenylefrine, zoals hier getoond met fenylefrine.

Voeg de agonist toe aan het preparaat. Acht agonisten moeten worden geëvalueerd bij elke log-toename van de cumulatieve concentratie van de agonist wanneer deze aan het preparaat wordt toegevoegd tussen de toedieningen van elke agonist. Er moet een wasfase met PSS worden uitgevoerd gedurende 30 minuten of totdat het vat terugkeert naar de rustdiameter.

Hier zijn representatieve resultaten van een inguinale lymfeklier na de equilibratieperiode. Het spoelen van de arterie met fysiologische zoutoplossing levert een duidelijk beeld op waarmee zowel de voedende arterie, hier aangegeven door de rode pijl, als de vene, aangegeven door de groene pijl, die de inguinale lymfeklier bevoorraden, kunnen worden geïdentificeerd. De grafiek toont een typische vasoactieve respons van een arterie van een inguinale lymfeklier op de cumulatieve toevoeging van SUP-gefuseerde fenylefrine aan fysiologische zoutoplossing.

Van een concentratie van 10⁻⁹ M tot 10⁻⁵ M is de aanwezigheid van een robuuste vasoconstrictie suggestief voor een normale gladspierfunctie in de arterie. In deze grafiek is een typische vasoactieve respons te zien op cumulatief toegevoegde acetylcholine aan fysiologische zoutoplossing. Er wordt een concentratie van 10⁻⁹ M tot 10⁻⁵ M getoond.

De aanwezigheid van een robuuste vasodilatatie wijst op een normale endotheelfunctie in de slagader. Bij het uitvoeren van deze preparatie is het essentieel om verstoringen van het vat en het omliggende gebied te minimaliseren om de kans op succes te maximaliseren. Na deze procedure kunnen andere methoden worden geïntroduceerd, zoals fluorescentie, om andere celfuncties zoals celtransport te onderzoeken.

Na de ontwikkeling van deze techniek heeft deze de weg vrijgemaakt om de vakgebieden immunologie en vasculaire biologie te verbinden tot een nieuw vakgebied: de vasculaire immunologie.