Het beoordelen van Signalering Eigenschappen van ectodermale epitheel Tijdens craniofaciale ontwikkeling
March 24th, 2011
Dit artikel beschrijft een weefseltransplantatie techniek die is ontworpen om de signalering en patroonvorming eigenschappen van de oppervlakte Cephalic ectoderm tijdens de craniofaciale ontwikkeling test.
Het algemene doel van deze procedure is om chimerische embryo's te creëren door ectoderm van donor-embryo's te transplanteren naar de zich ontwikkelende bovenste kaak van kippenembryo's. Dit wordt bereikt door eerst de donor derm voor transplantatie te verwijderen. Vervolgens wordt de gastheersite voorbereid voor aanplanting.
De laatste stap van de procedure is om het donorweefsel op de gastheersite te plaatsen en het graft op zijn plaats te bevestigen. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die exclusieve aanplanting van donor ectoderm laten zien, en door middel van moleculaire en morfologische analyse kan de functie van donor recod derm worden bepaald. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de ontwikkelingsbiologie, zoals het identificeren van de rol van verschillende weefsels tijdens morfogenese.
Het demonstreren van de procedure zal door Dr.Diane worden gedaan, een senior onderzoeker van ons laboratorium. Voordat u met deze procedure begint, bereidt u media voor en zorgt u ervoor dat alle vereiste oplossingen toegankelijk zijn en op de juiste temperatuur staan. Draag vervolgens, terwijl u voldoende oogbescherming draagt, micro capillaire buizen tot een fijn punt over een alcoholvlam.
Om glaspennen te maken, slijp je tungsteennaalden door ze in de vlam van een propaanbrander te houden. Begin met het verwijderen van het donor-embryo uit de schaal door een stukje plakband over het uiteinde van het ei te plakken. Gebruik vervolgens het punt van een dissectienaald om een klein gaatje in het midden van het plakband te maken.
Plaats een 10 milliliter spuit en een 18 gauge hypodermische naald in het gaatje en verwijder één milliliter albumine uit het ei. Maak vervolgens met behulp van een dissectienaald een klein gaatje in de bovenkant van de schaal. Plak een tweede stukje plakband om dit gaatje te bedekken.
Snij een ronde opening in het ei met behulp van twee paar pincetten. Pak het embryo en plaats het in een schaaltje met ijskoud PBS om te wassen. Nadat de kop van het embryo is verwijderd, plaatst u het in een weefselkweekschaaltje met kamertemperatuur, serumvrij DMEM.
Plaats de schaal onder de dissectiemicroscoop terwijl u de kop met pincetten vasthoudt. Gebruik veerschaar om de bovenste kaak en lagon grof te dissekteren van de rest van het hoofd. Trim vervolgens met behulp van een meshouder met een scherpe scheermes de frontale nasale proces van de bovenste kaak.
Gebruik een pipette om het frontale nasale proces over te brengen naar een 30 millimeter petrischaaltje met een voldoende hoeveelheid diss in PBS en incubeer het 20 minuten op ijs. Nadat de incubatietijd is verstreken, zuigt u de dispa-oplossing op zonder het weefsel te verstoren. Bedek de weefsels vervolgens volledig met DMEM met 1%BSA.
Om de vertering te stoppen, brengt u het weefsel over in een nieuw kweekschaaltje. Werk vervolgens onder een dissectiemicroscoop. Houd het weefsel vast met een ongeslepen tungsteennaald met behulp van een geslepen tungsteennaald.
Separeer het ectoderm door het van de andere weefsels te pellen. Zodra het preparaat klaar is, bewaart u het graftweefsel in DMEM met BSA op ijs tot de gastheer klaar is voor transplantatie. Gebruik de eerder gedemonstreerde methode om een venster in het kippenei te maken.
Plaats het ei met het embryo onder de dissectiemicroscoop met behulp van twee paar pincetten. Pak het IGN-membraan en het amnion en scheur voorzichtig om een gaatje te maken en de gastheerembryo bloot te leggen. Draai het hoofd door een paar pincetten op het rechteroog te plaatsen en druk uit te oefenen terwijl het hoofd stevig wordt vastgehouden.
Gebruik een tong en naald om het gastheer derm te verwijderen om ruimte te maken voor het graft. Voeg twee microliters neutrale rood toe aan het petrischaaltje met de voorbereide grafts. Gebruik een glazen pipette om het graft naar de gastheer over te brengen.
Plaats het graft op zijn plaats om het verwijderde ectoderm te vervangen. Plaats in elke hoek van het getransplanteerde weefsel een glazen pin om het graft op zijn plaats te pinnen na aanplanting. Sluit het venster strak met plakband.
Plaats het embryo terug in de incubator tot het vereiste ontwikkelingsstadium voor analyse, deze afbeelding toont weefsel van een kwartelkippenembryo URA dat is gekleurd met anti Q-C-P-N-A kwartelspecifiek antilichaam. Het getransplanteerde weefsel bevindt zich tussen de twee pijlen. Er is geen bewijs van QCPN-kleuring in het meen kindweefsel van een muiskippenembryo. Hier is weer een spiegel te zien. Het getransplanteerde weefsel bevindt zich tussen de twee pijlen in C twee hybridisatie met goedgekeurd specifiek voor de sign B twee repetitieve sequentie.
Bij het spiegelen van klasse een genen blijkt dat expressie van sign B twee beperkt is tot de ome die de graft omvat, hier getoond als een afbeelding van een kwartelkippenembryo dat trichrom gekleurd is. De duplicatie van het skelet van de bovenste kaak is te zien zoals aangegeven door de pijl. Deze afbeelding toont een muiskippenembryo dat opnieuw trichrom gekleurd is.
Duplicatie van het skelet van de bovenste kaak is te zien. Deze afbeelding toont radioactief in C twee hybridisatie van normale BMP zeven expressie in de mechy van een getransplanteerd kippenembryo. Hier is weefsel van een muiskippenembryo te zien. Het is te zien dat BMP zeven expressie wordt geïnduceerd in de mechy naast de graft zoals aangegeven door de pijl.
Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u kippenembryo's kunt manipuleren om mechanismen te beoordelen die de ontwikkeling van de front en nasale proces reguleren.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel beschrijft een weefseltransplantatietechniek gericht op het creëren van chimerische embryo's om de signaal- en patroonvormingseigenschappen van het oppervlakkige cephalische ectoderm tijdens de ontwikkeling van de craniofaciale structuur te bestuderen.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Ontwikkelingsbiologie
- Craniofaciale ontwikkeling
- Weefselengineering
Achtergrond
- De studie richt zich op de rol van het ectoderm in de craniofaciale morfogenese.
- Het begrijpen van weefselinteracties is cruciaal voor de ontwikkelingsbiologie.
- Chimeerische embryo's bieden inzichten in weefselfunctie en ontwikkeling.
- Deze techniek kan helpen bij het identificeren van de bijdragen van verschillende weefsels tijdens de ontwikkeling.
Doel van het onderzoek
- Om de signaaleigenschappen van het oppervlakkige cephalische ectoderm te testen.
- Om de patroonvormingseffecten van het ectoderm tijdens de craniofaciale ontwikkeling te analyseren.
- Om de rol van donorectoderm in de ontwikkeling van het gastheerweefsel te onderzoeken.
Gebruikte methoden
- Transplantatie van ectoderm van donorembryo's naar kikeembryo's.
- Voorbereiding van de gastheersite voor aanplanting.
- Plaatsing en bevestiging van donorweefsel op de gastheersite.
- Moleculair en morfologisch onderzoek van het aangeplante weefsel.
Belangrijkste resultaten
- Er werd een succesvolle aanplanting van donorectoderm waargenomen.
- Moleculair onderzoek onthulde de functionele rol van donorectoderm.
- De resultaten dragen bij aan het begrip van weefselinteracties tijdens de ontwikkeling.
- De bevindingen geven inzicht in de mechanismen van craniofaciale morfogenese.
Conclusies
- De transplantatietechniek is effectief voor het bestuderen van de functie van het ectoderm.
- De resultaten vergroten de kennis van craniofaciale ontwikkelingsprocessen.
- Deze methode kan worden toegepast om vragen in de ontwikkelingsbiologie verder te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This method enables mechanistic interrogation of tissue signaling in craniofacial morphogenesis, supporting target validation in developmental pathways. By establishing chimeric models, researchers can assess ectoderm-derived signaling properties relevant to congenital disorder mechanisms. The approach provides a disease-relevant system for de-risking hypotheses about epithelial-mesenchymal interactions in early development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Tests signaling properties of donor ectoderm to clarify molecular mechanisms in facial development.
- Operational Value: Uses nucleolar or repetitive element markers to distinguish host and donor tissues for unambiguous lineage tracing.
- Scientific Value: Enables functional assessment of ectoderm from mutant embryos to link genotype to phenotypic patterning outcomes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream molecular and morphological analysis of signaling induction.
- Operational Value: Standardizes graft placement and affixation to ensure reproducible engraftment across experimental conditions.
- Scientific Value: Supports quantitative readouts such as BMP7 expression in adjacent mesenchyme to measure pathway activation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Establishes disease-relevant system using mouse ectoderm to model human craniofacial mutant phenotypes.
- Operational Value: Enables continuity from discovery through preclinical validation by testing tissue interactions in a vertebrate embryo model.
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking by isolating ectoderm function in patterning upper jaw skeleton duplication.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows where tissue transplantation assays clarify signaling hierarchies before target prioritization in craniofacial pathways.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of ectoderm signaling in frontonasal process development through chimeric embryo generation.
- Screening: Describes assay readiness via standardized host site preparation and graft positioning for consistent molecular readouts.
- Analytics: Highlights molecular analysis (e.g., in situ hybridization, immunostaining) and morphological scoring (e.g., trichrome staining) to evaluate signaling outcomes.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by enabling testing of mutant mouse ectoderm in chick hosts to model human developmental variants.
- Enterprise Reuse: frames the chimera platform as a reusable capability for testing multiple donor tissues or genetic variants across studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through direct assessment of ectoderm-induced signaling in host tissues.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via defined transplantation steps and tissue-specific markers for donor-host discrimination.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in epithelial-mesenchymal signaling pathways.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of targets based on validated ectoderm signaling in craniofacial morphogenesis models.
Implementation Considerations
- Required expertise in embryonic dissection, tissue handling, and chimeric embryo culture.
- Instrumentation needs include dissecting microscope, microcapillary tools, and tissue culture setup for embryo manipulation.
- Cross-team standardization requires consistent host staging, graft viability assessment, and molecular analysis protocols.
- Adaptation considerations across model systems involve optimizing digestion times and culture media for different donor species (quail, mouse).
- Practical limitations include graft viability windows and host embryo survival rates post-transplantation, as noted in procedural timing constraints.
