Het beoordelen van Signalering Eigenschappen van ectodermale epitheel Tijdens craniofaciale ontwikkeling

Het algemene doel van deze procedure is om chimerische embryo's te creëren door ectoderm van donorembryo's te transplanteren naar de ontwikkelende bovenkaak van kiजembryo's. Dit wordt bereikt door eerst de donorderm te verwijderen voor transplantatie. Vervolgens wordt de gastheerplaats voorbereid voor transplantatie.

De laatste stap van de procedure is het plaatsen van het donorteweefsel op de gastheerplaats en het vastzetten van het transplantaat in positie. Uiteindelijk kunnen resultaten worden behaald die een exclusieve inkapseling van het donorectoderm tonen, en via moleculaire en morfologische analyse kan de functie van de recodereerde derm van de donor worden bepaald. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de ontwikkelingsbiologie, zoals het identificeren van de rol van diverse weefsels tijdens de morfogenese.

De procedure zal worden gedemonstreerd door Dr. Diane, een senior onderzoeker uit ons laboratorium. Bereid vóór aanvang van deze procedure de media voor en zorg dat alle benodigde oplossingen toegankelijk zijn en de juiste temperatuur hebben. Trek vervolgens, terwijl u adequate oogbescherming draagt, microcapillaire buisjes tot een fijn punt boven een alcoholvlam.

Gebruik glazen pinnen om wolfraamnaalden te verscherpen door deze in de vlam van een propaansnijbrander te houden. Begin met het extraheren van het donorembryo uit de schaal door een stukje plakband over het uiteinde van het ei te plaatsen. Gebruik vervolgens de punt van een dissectienaald om een klein gaatje in het midden van het plakband te maken.

Plaats een spuit van 10 milliliter en een hypodermische naald van 18 gauge in het gat en verwijder één milliliter albumine uit het ei. Maak vervolgens met een dissectienaald een klein gaatje in de bovenkant van de schaal. Plaats een tweede stukje tape om dit gaatje af te dekken.

Maak met twee pincetten een cirkelvormige opening in het ei. Pak het embryo vast en plaats het in een schaal met ijskoud PBS om het te wassen. Nadat de kop van het embryo is verwijderd, wordt deze in een kweekschaal geplaatst met serumvrij DMEM op kamertemperatuur.

Plaats de schaal onder de dissectiemicroscoop terwijl u de kop met een pincet vasthoudt. Gebruik veerscharen om de bovenkaak en het lagon grof te dissekeren van de rest van de kop. Trim vervolgens met een meshouder met een scherp scheermes het frontonasale proces van de bovenkaak.

Gebruik een pipet om het frontonasale proces over te brengen naar een Petrischaal van 30 millimeter die een voldoende volume dispa in PBS bevat en incubeer dit gedurende 20 minuten op ijs. Nadat de incubatietijd is verstreken, wordt de dispa-oplossing weggezogen zonder het weefsel te verstoren. Bedek de weefsels vervolgens volledig met DMEM dat 1% BSA bevat.

Om de digestie te stoppen, brengt u het weefsel over naar een nieuwe kweekschaal. Werk vervolgens onder een dissectiemicroscoop. Houd het weefsel vast met een onscherpe wolfraamnaald en gebruik een scherpe wolfraamnaald.

Scheid het ectoderm door het los te pellen van de andere weefsels. Bewaar het voorbereide transplantaatweefsel in DMEM met BSA op ijs totdat de gastheer klaar is voor transplantatie. Maak, met gebruik van de eerder gedemonstreerde methode, een venster in het kippenei.

Plaats het ei met het embryo onder de dissectiemicroscoop met behulp van twee pincetten. Pak het IGN-membraan en het amnion vast en scheur deze voorzichtig open om een gat te maken en het gastembryo bloot te leggen. Draai de kop door een pincet op het rechteroog te plaatsen en druk uit te oefenen terwijl de kop stevig wordt vastgehouden.

Gebruik een pincet en een naald om de dermis van de gastheer te verwijderen om ruimte te maken voor het transplantaat. Voeg twee µL neutraalrood toe aan de petrischaal met de voorbereide transplantaten. Gebruik een glazen pipet om het transplantaat naar de gastheer over te brengen.

Plaats het transplantaat zodanig dat het het verwijderde ectoderm vervangt. Steek in elke hoek van het getransplanteerde weefsel een glazen pen om het transplantaat na de transplantatie op zijn plaats te fixeren. Sluit het venster stevig af met tape.

Plaats het embryo terug in de incubator tot het vereiste ontwikkelingsstadium voor analyse; deze afbeelding toont weefsel van een URA van een kwartelskuik dat is gekleurd met een kwartelspecifiek anti-Q-C-P-N-A-antilichaam. Het gegrafts weefsel bevindt zich tussen de twee pijlen. Er is geen bewijs van QCPN-kleuring in het weefsel van de gastheer; hier is een muis-kuiken-chimeera te zien. Opnieuw bevindt het gegrafts weefsel zich tussen de twee pijlen in C; twee hybridisaties met een probe specifiek voor de sign B two repetitieve sequentie.

In het spiegelen van klasse één-genen blijkt dat de expressie van sign B twee beperkt is tot de regio bestaande uit het transplantaat, hier getoond als een afbeelding van een kwartel-kip-chimeer dat met trichroom is gekleurd. Trichroomkleuring kleurt collageen en bot blauw. Duplicatie van het skelet van de bovenkaak is zichtbaar, zoals aangegeven door de pijl. Deze afbeelding toont een muis-kip-chimeer dat opnieuw met trichroom is gekleurd.

Een duplicatie van het skelet van de bovenkaak is zichtbaar. Deze afbeelding toont radioactieve in situ hybridisatie van normale BMP7-expressie in de mesenchym van een geënt kiemembryo; hier is weefsel van een muis-kip-chimeer weergegeven. Er is te zien dat BMP7-expressie wordt geïnduceerd in het mesenchym grenzend aan het transplantaat, zoals aangegeven door de pijl.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u kiजembryo's kunt manipuleren om de mechanismen te beoordelen die de ontwikkeling van het frontale en nasale proces reguleren.