Name: Het beoordelen van Signalering Eigenschappen van ectodermale epitheel Tijdens craniofaciale ontwikkeling (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-24T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Leer een weefseltransplantatietechniek om chimerische embryo's te creëren en de signaleringseigenschappen van ectoderm tijdens craniofaciale ontwikkeling te bestuderen. Deze methode onthult weefselinteracties.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd gefinancierd door R01-R01-DE018234 en DE019638.

1. De voorbereiding van het donorweefsel <ol><li> Bereid cultuur media, scherp glas spelden, scherper wolfraam naalden. </li><li> Verzamel embryo van Shell, wassen in ijskoud PBS. <ol class="lalpha"><li> Met behulp van een 10 ml spuit en een 18 gauge naald te verwijderen 1,0 ml albumine uit het puntige uiteinde van de eierschaal. </li><li> Maak een klein gaatje aan de bovenzijde van het reservoir met behulp van de punt van de schaar, en sneed een ronde opening aan de embryo bloot </li></ol></li><li> Verwijder de kop en plaats in DMEM (serum vrij, kamertemperatuur) </li><li> Ontleden Frontonasal Proces van het embryo (of andere donor site, zoals de bovenkaak of onderkaak proces) </li><li> Digest in 2.4U / mL dispase in PBS op ijs gedurende 20 minuten </li><li> Bedek weefsels met DMEM met 1% BSA om de spijsvertering te stoppen </li><li> Gebruik geslepen wolfraam naald te scheiden ectoderm, mesenchym, en neuroectoderm </li><li> Bewaar graft weefsel in DMEM 1% BSA op ijs totdat gastheer klaar is voor transplantatie </li></ol> 2. De voorbereiding van de Host <ol><li> Expose het embryo <ol class="lalpha"><li> Met behulp van een 10 ml spuit en een 18 gauge naald te verwijderen 1,0 ml albumine uit het puntige uiteinde van de eierschaal. </li><li> Maak een klein gaatje aan de bovenzijde van het reservoir met behulp van de punt van de schaar. Leg een stukje tape over het gat, en snijd een ronde opening aan de embryo bloot te leggen. </li></ol></li><li> Met behulp van twee paar pincet, pak de amnion en voorzichtig scheuren om een ​​gat te maken. </li><li> Draai het hoofd door het plaatsen van een paar pincetten aan de rechter oog en druk uit te oefenen. Houd het hoofd stabiel, gebruik maken van een wolfraam naald aan de gastheer ectoderm verwijderen om het transplantaat te passen. </li><li> Breng de graft aan de gastheer met een glazen pipet. </li><li> Plaats de graft aan de verwijderde ectoderm te vervangen. Plaats een glas speld in elke hoek van de geënte weefsel om het transplantaat pin op zijn plaats. Te maken glas pinnen, trek een microcapillaire buis tot een fijne punt meer dan een alcohol vlam. </li><li> Strak plaats tape over het gat en terug te keren embryo naar de incubator voor de juiste lengte van de tijd voor analyse. </li><li> zie ook: 9 </li></ol> 3. Representatieve resultaten: Voor de beoordeling van hersenschimmen, moeten embryo's worden verzameld en verwerkt voor de analyse van de distributie van gastheer en donor weefsels. Voor de detectie van kwartel cellen, immunohistochemie met behulp van de QcPN antilichaam (zoals beschreven in: 3) wordt gebruikt, en voor de detectie van de muis cellen, in situ hybridisatie op paraffinecoupes wordt gebruikt 6. Donorcellen moet worden beperkt tot het epitheel, en er mag geen bewijs van donor mesenchymale weefsels (figuur 1). De aanwezigheid van geïsoleerde donor cellen in het mesenchym duidt op de aanwezigheid van verontreiniging neurale cellen, die een morfologische interpretatie te wijten aan de invloed van deze cellen op vele aspecten van het gezicht ontwikkeling (bv. 10) zal beschamen. Zodra er van overtuigd dat het transplantaat techniek is vrij van vervuilende mesenchym, verder kan morfologische of moleculaire uitkomstmaten worden gebruikt om de hersenspinsels te beoordelen. Voor ons doel, we ontdekt de aanwezigheid van ectopische kraakbeen en botten die overeenkwam met verdubbelingen van de bovenkaak die werden veroorzaakt door de getransplanteerde weefsels (figuur 2), en moleculaire veranderingen in de mesenchymale weefsels in reactie op de geënte ectoderm (Figuur 3) 5,6. <img src="/files/ftp_upload/2557/2557fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Beoordeling van chimerisme (A) Anti-QcPN kleuring wordt gebruikt om cellen te detecteren in de kwartel kwartel-chick hersenschimmen. Er is geen bewijs van kleuring in het mesenchym. (B) In situ hybridisatie wordt gebruikt om de uitdrukking van SINE B2 transcripten detecteren in de muis-chick hersenschimmen. Expression is beperkt tot het ectoderm, bestaande uit het transplantaat. <img src="/files/ftp_upload/2557/2557fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Trichroom kleuren toont verdubbeling van de bovenkaak skelet in (A) kwartel-chick chimera, en (B) muis-chick hersenschimmen. <img src="/files/ftp_upload/2557/2557fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Het ectoderm regultes genexpressie in het mesenchym. (A) Normaal Bmp7 uitdrukking in het mesenchym van een kippenembryo (radioactieve in situ hybridisatie met een positieve signaal pseudo-rood gekleurd in Adobe Photoshop). (B) Bmp7 expressie wordt geïnduceerd in de mesenchym grenzend aan het transplantaat (pijl) in chimère embryo's.

<ol><li>Noden, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+the+Neural+Crest+in+Patterning+of+Avian+Cranial+Skeletal%2C+Connective%2C+and+Muscle+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The Role of the Neural Crest in Patterning of Avian Cranial Skeletal, Connective, and Muscle Tissues.</a> Developmental Biology. 96, 144-144 (1983).</li>
<li>Bronner-Fraser, M., Stern, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Mesodermal+Tissues+on+Avian+Neural+Crest+Cell+Migration%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Effects of Mesodermal Tissues on Avian Neural Crest Cell Migration.</a> Developmental Biology. 143, 213-213 (1991).</li>
<li>Schneider, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+can+form+cartilages+normally+derived+from+mesoderm+during+development+of+the+avian+head+skeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Neural crest can form cartilages normally derived from mesoderm during development of the avian head skeleton.</a> Developmental Biology. 208, 441-441 (1999).</li>
<li>Couly, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+Hox-negative+cephalic+neural+crest+cells+and+the+foregut+endoderm+in+patterning+the+facial+skeleton+in+the+vertebrate+head%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Interactions between Hox-negative cephalic neural crest cells and the foregut endoderm in patterning the facial skeleton in the vertebrate head.</a> Development. 129, 1061-1061 (2002).</li>
<li>Evans, D. J., Noden, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+relations+between+avian+craniofacial+neural+crest+and+paraxial+mesoderm+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Spatial relations between avian craniofacial neural crest and paraxial mesoderm cells.</a> Dev Dyn. , (2006).</li>
<li>Hu, D., Marcucio, R., Helms, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+zone+of+frontonasal+ectoderm+regulates+patterning+and+growth+in+the+face%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A zone of frontonasal ectoderm regulates patterning and growth in the face.</a> Development. 130, 1749-1749 (2003).</li>
<li>Hu, D., Marcucio, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+organization+of+the+frontonasal+ectodermal+zone+in+birds+and+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Unique organization of the frontonasal ectodermal zone in birds and mammals.</a> Dev Biol. 325, 200-200 (2009).</li>
<li>Le Lièvre, C. S., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+derivatives+of+the+neural+crest%3A+analysis+of+chimaeric+quail+and+chick+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Embryology+and+Experimental+Morphology%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal derivatives of the neural crest: analysis of chimaeric quail and chick embryos.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 34, 125-125 (1975).</li>
<li>Bollag, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+repetitive+mouse+B2+element+to+identify+transplanted+mouse+cells+in+mouse-chick+chimeras%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Use of a repetitive mouse B2 element to identify transplanted mouse cells in mouse-chick chimeras.</a> Exp Cell Res. 248, 75-75 (1999).</li>
<li>Korn, M. J., Cramer, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Windowing+chicken+eggs+for+developmental+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Windowing chicken eggs for developmental studies.</a> J Vis Exp. , (2007).</li>
<li>Eames, B. F., Schneider, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quail-duck+chimeras+reveal+spatiotemporal+plasticity+in+molecular+and+histogenic+programs+of+cranial+feather+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Quail-duck chimeras reveal spatiotemporal plasticity in molecular and histogenic programs of cranial feather development.</a> Development. 132, 1499-1499 (2005).</li>
<li>Odent, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+Sonic+hedgehog+%28SHH+%29+gene+during+early+human+development+and+phenotypic+expression+of+new+mutations+causing+holoprosencephaly%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Expression of the Sonic hedgehog (SHH ) gene during early human development and phenotypic expression of new mutations causing holoprosencephaly.</a> Hum Mol Genet. 8, 1683-1683 (1999).</li>
<li>Szabo-Rogers, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+skeletogenic+patterning+roles+for+the+olfactory+pit%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Novel skeletogenic patterning roles for the olfactory pit.</a> Development. 136, 219-219 (2009).</li>
</ol>

Met behulp van deze transplantatie methode heeft ons toegestaan ​​om te bepalen dat het ectoderm signalering informatie die dorsoventral polariteit en proximodistal uitbreiding van de bovenkaak regelt bevat. De gelijkenis van de uitkomsten bij het ​​gebruik van kwartel of de muis ectoderm, en het behoud van de moleculaire signalen in dit weefsel onder veel diersoorten 6,11 geeft aan dat dit een zeer goed geconserveerd signalering centrum onder de gewervelde dieren. Bovendien hebben andere onderzoekers gebruik...

<table><tbody><tr><td>1x PBS</td><td>Tektronix, Inc.</td><td>TEKZR114</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>University of California - San Francisco</td><td>CCFDA003</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>35x10 mm Petrischaal</td><td>Falcon BD</td><td>1008</td><td></td></tr><tr><td>Dumont pincet nr. 5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Schaar</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-11</td><td></td></tr><tr><td>Veerschaar</td><td>Fine Science Tools</td><td>15010-11</td><td></td></tr><tr><td>Naaldvoerder</td><td>Fine Science Tools</td><td>26016-12</td><td></td></tr><tr><td>Wolfraamnaald</td><td>Fine Science Tools</td><td>26000</td><td></td></tr><tr><td>Microcapillaire buis</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-225-G</td><td></td></tr><tr><td>Pasteurpipetten</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-6B</td><td></td></tr><tr><td>Veerschaar</td><td>Fine Science Tools</td><td>15010-11</td><td></td></tr><tr><td>Meshouder</td><td>Fine Science Tools</td><td>10052-11</td><td></td></tr><tr><td>Scheermesje</td><td>Fine Science Tools</td><td>10050-00</td><td></td></tr></tbody></table>

het beoordelen van signalering eigenschappen van ectodermale epitheel tijdens craniofaciale ontwikkeling

Assessing Signaling Properties of Ectodermal Epithelia During Craniofacial Development

De toegankelijkheid van aviaire embryo&#39;s heeft geholpen experimentele embryologen begrijpen het lot van cellen tijdens de ontwikkeling en de rol van weefsel interacties die patronen en morfogenese van de gewervelde dieren (bijv. 1, 2, 3, 4) te regelen. Hier, illustreren we een methode die deze toegankelijkheid exploiteert aan de signalering en patroonvorming eigenschappen van de ectodermale weefsels te testen tijdens het gezicht ontwikkeling. In deze experimenten, maken we kwartel-chick 5 of muis-chick 6 hersenschimmen door het transplanteren van het oppervlak cefalische ectoderm dat de bovenkaak van de kwartel of de muis dekt op ofwel de dezelfde regio of een buitenbaarmoederlijke regio van kippenembryo&#39;s. Het gebruik van kwartels als donor weefsel voor transplantatie in kuikens werd ontwikkeld om te profiteren van een hergroepering van nucleoli marker aanwezig is in kwartel, maar niet kuiken cellen, waardoor de onderzoekers voor het hosten en de donor weefsels 7 te onderscheiden. Ook een repetitief element aanwezig is in de muis genoom en is alomtegenwoordig uitgedrukt, waardoor we gastheer en donor weefsels te onderscheiden in de muis-chick hersenschimmen 8. Het gebruik van de muis ectoderm als donor weefsel zal sterk uit te breiden ons begrip van deze weefsel interacties, want dit zal ons toelaten om de signalering eigenschappen van ectoderm ontleend aan diverse mutant embryo&#39;s te testen.

Dit artikel beschrijft een weefseltransplantatie techniek die is ontworpen om de signalering en patroonvorming eigenschappen van de oppervlakte Cephalic ectoderm tijdens de craniofaciale ontwikkeling test.

Het beoordelen van Signalering Eigenschappen van ectodermale epitheel Tijdens craniofaciale ontwikkeling

De toegankelijkheid van aviaire embryo's heeft experimenteel embryologen geholpen om het lot van cellen tijdens de ontwikkeling en de rol van weefsel te begrijpen ...

Het algemene doel van deze procedure is om chimerische embryo's te creëren door ectoderm van donorembryo's te transplanteren naar de ontwikkelende bovenkaak van kiजembryo's. Dit wordt bereikt door eerst de donorderm te verwijderen voor transplantatie. Vervolgens wordt de gastheerplaats voorbereid voor transplantatie.De laatste stap van de procedure is het plaatsen van het donorteweefsel op de gastheerplaats en het vastzetten van het transplantaat in positie. Uiteindelijk kunnen resultaten worden behaald die een exclusieve inkapseling van het donorectoderm tonen, en via moleculaire en morfologische analyse kan de functie van de recodereerde derm van de donor worden bepaald. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de ontwikkelingsbiologie, zoals het identificeren van de rol van diverse weefsels tijdens de morfogenese.De procedure zal worden gedemonstreerd door Dr. Diane, een senior onderzoeker uit ons laboratorium. Bereid vóór aanvang van deze procedure de media voor en zorg dat alle benodigde oplossingen toegankelijk zijn en de juiste temperatuur hebben. Trek vervolgens, terwijl u adequate oogbescherming draagt, microcapillaire buisjes tot een fijn punt boven

assessing-signaling-properties-ectodermal-epithelia-during

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Craniofaciale kraakbeen te ontwikkelen in nauw contact met andere weefsels en zijn moeilijk te manipuleren in levende dieren. Wij maken gebruik van elektroporatie van moleculaire tools te leveren tijdens de groei van het craniofaciale skelet, terwijl het omzeilen van de vroege embryonale effecten. Deze aanpak stelt ons in staat om efficiënt te testen...

Elektroporatie van Craniofaciale Mesenchym

De craniale mesenchym ondergaat dramatische morfogenische bewegingen die waarschijnlijk zorgt voor een drijvende kracht voor verhoging van de neurale...

Een Explantatie Assay voor het beoordelen van cellulair gedrag van de craniale mesenchym

Een protocol voor het scheiden van embryo gezichts ectoderm en mesenchym beschreven. We gebruiken Dispase II om eerst te behandelen hele embryo's, hele gezicht protuberansen ontleden, en dan scheiden de gezichts-ectoderm en mesenchym.

Scheiding van muis embryonale Facial ectoderm en mesenchym

Een techniek voor het transplanteren "Extreme Voorste Domain" tissues tussen Xenopus laevis embryo ontwikkeld. Weefsel kan worden verplaatst van de ene genexpressie achtergrond in de andere, waardoor de studie van de lokale vereisten voor craniofaciale ontwikkeling en voor het signaleren van interacties tussen het gezicht regio.

Facial Transplantaties in<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryo&#39;s

Dit protocol beschrijft hoe premigratory craniale neurale lijst (NC) ontleden van Xenopus laevis neurulas. Deze explanten worden uitgeplaat op fibronectine en gekweekt in vitro of terug in gastheercellen embryo geënt. Deze techniek maakt het bestuderen van de mechanismen van NC epitheel naar mesenchym overgang, migratie en differentiatie.

Dissectie van<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Neurale lijst voor<em&gt; In vitro</em&gt; Explantaatkweek of<em&gt; In vivo</em&gt; Transplantatie

Time-lapse confocale beeldvorming is een techniek nuttig voor het karakteriseren van embryonale ontwikkeling. Hier beschrijven we de methode karakteriseren craniofaciale morfogenese in wildtype en PDGFRA, Smad5 en SMO mutant embryo's.

Het analyseren Craniofacial Morphogenesis in zebravis behulp 4D confocale microscopie

Dit artikel beschrijft een werkwijze voor chimeer embryo's die zijn ontworpen om de soortspecifieke bijdragen van neurale en / of andere weefsels craniofaciale ontwikkeling testen genereren.

Het beoordelen Soortspecifieke Bijdragen aan craniofaciale ontwikkeling met behulp van Quail-eend Chimeras

Protocollen die ondoordringbare barrières gebruiken om inductie-evenementen te blokkeren tussen weefsels van de hoofdlichaamsas en de flank in het kippenembryo, die nodig zijn voor ledeformatie, worden beschreven. Kralen gedrenkt in kandidaat-inductieve signalen worden gebruikt om het effect van barrièreplaatsing te overwinnen en analyse van genexpressie bevestigt dit.

Toepassing van Waterdicht Barrières In combinatie met de kandidaat-Factor Soaked Beads om Inductive Signalen studie in de Chick

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol om eiwit niveaus te detecteren en te kwantificeren tijdens craniofaciale morfogenese/pathogenese door immunokleuring met behulp van muis craniofaciale weefsels als voorbeeld. Daarnaast beschrijven we een methode voor het bereiden en cryosnijden van onverdecalcificeerde harde weefsels van jonge muizen voor immunokleuring.

Weefsel voorbereiding en immunokleuring van muis craniofaciale weefsels en Ondecalcificeerd bot

Dit artikel beschrijft een weefseltransplantatietechniek die is ontworpen om de signalerings- en patrooneigenschappen van basale voorhersenen tijdens craniofaciale ontwikkeling te testen.

Het creëren van aviaire voorhersenen chimaera's om de gezichtsontwikkeling te beoordelen

Het protocol presenteert een methode voor het isoleren van hele cel eiwitlysaten van ontleedde muis embryo gezichtsprocessen of gekweekte muis embryonale palatale mesenchym cellen en het uitvoeren van daaropvolgende western blotting om gefosforyleerde eiwitniveaus te beoordelen.

Isolatie van hele celproteïnelysaten uit gezichtsprocessen van muizen en gekweekte palatale mesenchymcellen voor fosfoproteïne-analyse

Leer een weefseltransplantatietechniek om chimerische embryo's te creëren en de signaleringseigenschappen van ectoderm tijdens craniofaciale ontwikkeling te bestuderen. Deze methode onthult weefselinteracties.

Het beoordelen van Signalering Eigenschappen van ectodermale epitheel Tijdens craniofaciale ontwikkeling

Meer video's verkennen