Name: Efficiënte polyethyleenglycol (PEG) gemedieerde transformatie van de Moss Physcomitrella patens /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 54 s
Description: Leer een efficiënte PEG-gemedieerde transformatiemethode voor protoplasten van het mos Physcomitrella patens. Dit protocol maakt betrouwbare genetische manipulatie mogelijk voor onderzoek naar genfunctie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

LV wordt ondersteund door de NSF (IOS 1002837)

1. Het maken van de Protoplasten <ol><li> Voeg 9 mL van 8% mannitol tot een petrischaal. </li><li> Met behulp van een spatel, zet zeven dagen oud mos 2-3 PPNH4 platen van 5 - in de petrischaal met mannitol. </li><li> Voeg 3 ml van 2% Driselase (Sigma D9515-25G) om de petrischaal. </li><li> Incubeer de petrischaal bij kamertemperatuur onder zacht schudden gedurende 1 uur. </li><li> Filter de protoplast suspensie door een 100 um mesh (BD Falcon 352.350). </li><li> Spin het gefilterde suspensie bij 250 g gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant. </li><li> Resuspendeer de protoplasten heel voorzichtig met 500 pl van 8% mannitol. </li><li> Voeg 9,5 ml 8% mannitol in de cultuur buis. Zorg ervoor dat protoplasten zijn volledig opgehangen. </li><li> Herhaal de filtratie en de resuspensie stappen (1.6, 1.7 en 1.8) nog twee keer. </li><li> Neem 10 pi van de protoplast oplossing en tel de protoplasten in een hemocytometer. </li><li> Vermenigvuldig het aantal protoplast in een 16 vierkant gebied met 10.000 om het aantal protoplasten per ml (zie figuur 1). </li></ol> 2. Transformatie <ol><li> Spin de protoplast suspensie bij 250 g gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant. </li><li> Re-schorten protoplasten in MMG oplossing bij de concentratie van 1,6 miljoen protoplasten / ml. </li><li> Incubeer de protoplast suspensie bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten. </li><li> Voeg 600 ul van protoplast suspensie in een cultuur buis met 60 pg DNA. Schud de buis voorzichtig. </li><li> Voeg 700 ul van PEG / Ca-oplossing in de protoplast / DNA-mengsel. Schud de buis voorzichtig tot hele mengsel homogeen is. </li><li> Incubeer het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. </li><li> Tijdens deze wachttijd, cover PRM-B platen met cellofaan (80 mm diameter cirkels, AA Packaging Limited, Verenigd Koninkrijk), toestaan ​​cellofaan te hydrateren op de plaat oppervlakte voor ten minste 5 minuten. </li><li> Met een spatel, verwijder eventuele luchtbellen gevangen tussen het cellofaan en de plaat. </li><li> Verdun het mengsel met 3 ml van de W5-oplossing. </li><li> Draai het mengsel bij 250 g gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant. </li><li> Re-schorten protoplasten in gesmolten 2 ml van PRM-T (voordat u deze aan de protoplasten deze oplossing kan vloeistof worden bewaard bij 42 ° C). Plaat 1 mL van het opnieuw te schorten protoplasten per PRM-B plaat onder cellofaan. Wikkel de platen met Micropore (3M, Health Care). Houd de platen bij 25 ° C in een groeikamer. </li><li> Als alternatief kan protoplasten opnieuw worden gesuspendeerd in 1 ml vloeistof plating medium en vergulde 0,5 ml op een PRM-B plaat bedekt met cellofaan. Hierdoor kan sneller herstel, maar het aantal regenereren planten lager is. </li><li> Groeikamer is ingesteld voor een 16 uur. licht en 8 uur. donker cyclus. </li><li> Verplaats het cellofaan op om een ​​nieuwe selectie plaat 4 dagen na de transformatie. </li></ol> 3. Representatieve resultaten: Een voorbeeld van transformatie is weergegeven in figuur 2. Het DNA in dit voorbeeld gebruikte was een helix 7,8 kb plasmide dat een hygromycine resistent cassette. De hoeveelheid plated protoplasten werd teruggebracht tot 50% voor de fotografie. De foto's werden genomen twee weken na het planten werden verplaatst naar de selectie platen. De transformatie-efficiëntie wordt niet beïnvloed door de DNA-concentratie tot 60 microgram. Hogere concentraties van DNA zijn nadelig voor de efficiëntie van de transformatie. De gegevens bleek dat deze methode consistent resultaat over een breed scala van DNA hoeveelheden levert. Deze methode kan ook leiden tot een stabiele transformanten effectief, zoals aangegeven in tabel 1, kunnen we ongeveer 4 stabiele transformanten per microgram van het gelineariseerde DNA, dat is veel hoger dan wat eerder werd gemeld 14. We hebben ook het effect getest van heat shock op de transformatie-efficiëntie door het transformeren van een helix plasmide dat een gen voor een fluorescerend eiwit als marker. De heat shock werd uitgevoerd 10 minuten na kamertemperatuur incubatie (in stap 2.6) door het incuberen van het mengsel in een 45 ° C waterbad gedurende 3 minuten. Het mengsel werd geïncubeerd in een water op kamertemperatuur bad onmiddellijk na heat shock voor 17 minuten. De resultaten werden opgenomen 22 uur na de transformatie. De verhoudingen van de transformanten verkregen met en zonder heat shock waren zeer vergelijkbaar (~ 25%), maar zagen we een negatief effect van heat shock op de levensvatbaarheid van de protoplasten (gegevens niet getoond). <img src="/files/ftp_upload/2560/2560fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Bekijk de protoplasten in hemocytometer. De afdeling die nodig is voor het tellen van protoplastfusie wordt aangegeven door een rood vierkant. Let op de 16 vierkantjes die nodig zijn voor het tellen van protoplasten (zie 1.11), de afbeelding toont een telling van 24 protoplasten (240.000 cellen / ml). <img src="/files/ftp_upload/2560/2560fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Foto's van 18 dagen oud voorbijgaande transformanten. Protoplasten waren transgevormd met de aangegeven hoeveelheid van de dubbele helix plasmide. A: 15μg, B: 30μg, C: 60μg; D: 120μg. <table border="1"><tbody><tr><td> Hoeveelheid DNA (ug) </td><td> Efficiëntie (tranformants / ug DNA) </td></tr><tr><td> 15, supercoiled plasmide </td><td> 120 ± 24 </td></tr><tr><td> 30, supercoiled plasmide </td><td> 145 ± 54 </td></tr><tr><td> 60, supercoiled plasmide </td><td> 121 ± 60 </td></tr><tr><td> 120, supercoiled plasmide </td><td> 71 ± 38 </td></tr><tr><td> 60, gelineariseerde plasmide </td><td> 4 ± 1 </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Transformatie efficiëntie op verschillende DNA bedragen.

<ol><li>Abel, S., Theologis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+transformation+of+Arabidopsis+leaf+protoplasts%3A+a+versatile+experimental+system+to+study+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Transient transformation of Arabidopsis leaf protoplasts: a versatile experimental system to study gene expression.</a> Plant J. 5, 421-427 (1994).</li>
<li>Wood, A. J., Oliver, M. J., Cove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bryophytes+as+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Bryologist%22%5BJournal%5D)">Bryophytes as model systems.</a> Bryologist. 103, 128-133 (2000).</li>
<li>Schaefer, D. G., Zrÿd, J. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+targeting+in+the+moss+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Efficient gene targeting in the moss Physcomitrella patens.</a> Plant J. 11, 1195-1206 (1997).</li>
<li>Schaefer, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+targeting+in+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Gene targeting in Physcomitrella patens.</a> Curr. Opin. Plant Biol. 4, 143-150 (2001).</li>
<li>Kamisugi, Y., Cuming, A. C., Cove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parameters+determining+the+efficiency+of+gene+targeting+in+the+moss+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Parameters determining the efficiency of gene targeting in the moss Physcomitrella patens.</a> Nucleic Acids Res. 33, e173-e173 (2005).</li>
<li>Cove, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+moss+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">The moss Physcomitrella patens.</a> Annu. Rev. Genet. 39, 339-358 (2005).</li>
<li>Kamisugi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+gene+targeting+in+Physcomitrella+patens%3A+homologous+recombination%2C+concatenation+and+multiple+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The mechanism of gene targeting in Physcomitrella patens: homologous recombination, concatenation and multiple integration.</a> Nucleic Acids Res. 34, 6205-6215 (2006).</li>
<li>Vidali, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+formin-mediated+actin-filament+elongation+is+essential+for+polarized+plant+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Rapid formin-mediated actin-filament elongation is essential for polarized plant cell growth.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2009).</li>
<li>Sawahel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+foreign+DNA+into+Physcomitrella+protonemal+tissue+by+using+the+gene+gun%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Transfer of foreign DNA into Physcomitrella protonemal tissue by using the gene gun.</a> Plant Mol. Biol. 10, 315-316 (1992).</li>
<li>Schaefer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+transformation+of+the+moss+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Gen.+Genet%22%5BJournal%5D)">Stable transformation of the moss Physcomitrella patens.</a> Mol. Gen. Genet. 226, 418-424 (1991).</li>
<li>Cho, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+bombardment+mediated+transformation+and+GFP+expression+in+the+moss+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cells%22%5BJournal%5D)">Particle bombardment mediated transformation and GFP expression in the moss Physcomitrella patens.</a> Mol. Cells. 9, 14-19 (1999).</li>
<li>Ashton, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bryophyte+Physcomitrella+patens+replicates+extrachromosomal+transgenic+elements%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">The bryophyte Physcomitrella patens replicates extrachromosomal transgenic elements.</a> New Phytol. 146, 391-402 (2000).</li>
<li>Hohe, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+and+highly+standardized+transformation+procedure+allows+efficient+production+of+single+and+multiple+targeted+gene-knockouts+in+a+moss%2C+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Genet%22%5BJournal%5D)">An improved and highly standardized transformation procedure allows efficient production of single and multiple targeted gene-knockouts in a moss, Physcomitrella patens.</a> Curr. Genet. 44, 339-347 (2004).</li>
<li>Vidali, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profilin+is+essential+for+tip+growth+in+the+moss+Physcomitrella+patens%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Profilin is essential for tip growth in the moss Physcomitrella patens.</a> Plant Cell. 19, 3705-3722 (2007).</li>
</ol>

De methode hier gepresenteerde maakt een eenvoudige en consistente DNA transformatie in Physcomitrella patens protoplasten. Deze methode werd oorspronkelijk ontwikkeld voor Arabidopsis 1, maar hier hebben we aangetoond dat het goed presteert met protoplasten van Physcomitrella patens, een eenvoudiger en andere planten. Daarom kan deze methode worden toegepast op andere plantensoorten met kleine aanpassingen. Eventuele wijzigingen voor optimalisatie zijn protoplastfusie concentratie in MMG, incubatie tijd in MMG en PEG / Ca-oplossing. Kiezen we ervoor om 60 ug DNA gebruiken in onze routine experimenten, omdat het aantal transformanten lineair toeneemt met de DNA-concentratie tot dit punt (tabel 1). We konden krijgen ongeveer 7000 voorbijgaande transformanten of 200 stabiel transformanten op een enkel 60 ug DNA transformatie, die het mogelijk maakt voor verdere screening en analyse van een grote populatie van planten. De getransformeerde protoplasten kan verspreiden met vloeibare plating medium of PRM-T worden. Hoewel de regeneratie rendement is lager als vloeibaar plating medium wordt gebruikt, kiezen we voor deze methode als de protoplasten werden getransformeerd met plasmiden dubbele helix. Zoals getoond in tabel 1, transformaties gedaan met helix plasmide DNA te genereren transformanten veel meer en dus kunnen we nog steeds grote aantallen van planten te verkrijgen met vloeibaar plating medium. Bovendien, het verspreiden van protoplasten met vloeibare plating medium kan er sneller herstel, wat belangrijk is voor experimenten met voorbijgaande fenotypes, zoals RNAi knock down experimenten 9,15. Naast de afwezigheid van de top agar zorgt voor makkelijke plant isolatie voor immunokleuring en RT-PCR 9,15.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Bestanddeel </td></tr><tr><td> PPNH 4 </td><td> 1,84 mM KH 2 PO 4 3,4 mM Ca (NO 3) 2 1 mM MgSO 4 2,72 mM diammonium tartraat 54 uM FeSO 4 0.7 H 2 O 9,93 uM H 3 BO 3 1,97 uM MnCl 2 0.4 H 2 O 0,23 uM CoCl 2 0.6 H 2 O 0,19 uM ZnSO 4. 7H 2 O 0,22 uM CuSO 4. 5H 2 O 0,10 uM Na 2 MoO 4 .2 H 2 O 0,168 uM KI Voeg 0,7% agar voor vaste medium. </td></tr><tr><td> PRM-B </td><td> PPNH 4 met 6% mannitol en 0,8% agar. Voeg 10 mL 1 M CaCl2 tot 1 liter voor het storten platen. </td></tr><tr><td> PRM-T </td><td> PPNH 4 met 6% mannitol en 0,6% agar. Voeg 0,5 mL 1 M CaCl2 tot 50 ml voor gebruik. </td></tr><tr><td> Vloeistof Plating Medium </td><td> PPNH 4 met 8,5% mannitol zonder agar. Voeg 0,5 mL 1 M CaCl2 tot 50 ml voor gebruik. </td></tr><tr><td> 2% Driselase </td><td> Voeg 4 g van Driselase (Sigma D9515-25G) tot 200 ml van 8% mannitol. Roer zachtjes gedurende 30 minuten. bij kamertemperatuur, incubeer 30 minuten. bij 4 ° C, en zachtjes roeren gedurende 5 minuten. bij kamertemperatuur. Spin 2.500 g gedurende 10 min, gooi pellet. Filter met 0,22 micrometer, en op te slaan bevroren als 10 ml. Dooi in een kamer temperatuur waterbad voor gebruik. </td></tr><tr><td> MMG </td><td> 0.4 M mannitol 15 mM MgCl 2 4 mM MES (pH 5,7) </td></tr><tr><td> PEG / Ca </td><td> 4 g PEG4000 3 mL H 2 O 2,5 ml 0,8 M mannitol 1 mL 1M CaCl 2 </td></tr><tr><td> W5 </td><td> 154 mM NaCl 125 mM CaCl 2 5 mM KCl 2 mM MES (pH 5,7) </td></tr></tbody></table>

efficiënte polyethyleenglycol (peg) gemedieerde transformatie van de moss physcomitrella patens</em

Efficient Polyethylene Glycol (PEG) Mediated Transformation of the Moss Physcomitrella patens

<p class="jove_content"&gt; Een eenvoudige en efficiënte methode te transformeren<em&gt; Physcomitrella pantens</em&gt; Protoplasten is beschreven. Deze methode is een bewerking van protocollen voor<em&gt; Physocmitrella</em&gt; Protonemal protoplast en<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Bladmoes protoplast transformatie<sup&gt; 1</sup&gt;. Door zijn vermogen om efficiënte mitotische ondergaan homologe recombinatie<em&gt;, Physcomitrella patens</em&gt; Heeft zich ontpopt als een belangrijk modelsysteem in de afgelopen jaren<sup&gt; 2</sup&gt;. Deze capaciteit kan hoge frequenties van gentargeting<sup&gt; 3-9</sup&gt;, Die niet gezien wordt in andere model planten zoals<em&gt; Arabidopsis</em&gt;. Ten volle te profiteren van dit systeem, moeten we een effectieve en eenvoudige methode om DNA te leveren in mos cellen. De meest voorkomende manieren om dit mos te transformeren zijn deeltjesbombardement<sup&gt; 10</sup&gt; En PEG-gemedieerde DNA-opname<sup&gt; 11</sup&gt;. Hoewel deeltjesbombardement kan produceren een hoog rendement transformatie<sup&gt; 12</sup&gt;, Gen wapens zijn niet direct beschikbaar voor veel laboratoria en het protocol is moeilijk te standaardiseren. Aan de andere kant, is PEG gemedieerde transformatie niet vereisen gespecialiseerde apparatuur, en kan worden uitgevoerd in een laboratorium met een steriele kap. Hier tonen we een eenvoudige en zeer efficiënte methode voor transformatie van mos protoplasten. Deze methode kan leiden tot meer dan 120 tijdelijke transformanten per microgram DNA, dat is een verbetering ten opzichte van de meest efficiënte protocol eerder gemeld<sup&gt; 13</sup&gt;. Door zijn eenvoud, efficiëntie en reproduceerbaarheid, kan deze methode worden toegepast op projecten die groot aantal transformanten als voor routine transformatie.</p

Een eenvoudige en efficiënte methode te transformeren<em&gt; Physcomitrella pantens</em&gt; Protoplasten is beschreven. Deze methode is een bewerking van protocollen voor<em&gt; Physocmitrella</em&gt; Protonemal protoplast en<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Bladmoes protoplast transformatie<sup&gt; 1</sup&gt;.

Efficiënte polyethyleenglycol (PEG) gemedieerde transformatie van de Moss Physcomitrella patens</em

Er wordt een eenvoudige en efficiënte methode beschreven voor de transformatie van Physcomitrella patens-protoplasten. Deze methode is aangepast van protocollen voor Physcomitrella ...

Het algemene doel van deze procedure is het transformeren van SCO Metre-protoplasten. Dit wordt bereikt door de planten eerst te verteren met Drizly. Vervolgens worden de protoplasten gewassen met mannitol om het drizly te verwijderen, waarna ze worden geïncubeerd met DNA en peg.Ten slotte worden de getransformeerde protoplasten op platen uitgeplaat en geïncubeerd. Uiteindelijk kunnen de resultaten worden verkregen, die via fluorescentiemicroscopie laten zien dat de getransformeerde protoplasten fluorescent gelabelde eiwitten tot expressie brengen. De procedure zal worden gedemonstreerd door Y lu, een postdoc uit mijn laboratorium.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze effectief is en consistent protoplasten genereert die het eiwit van belang tot expressie brengen. Om protoplasten van mos te isoleren, begint u met het toevoegen van 9 mL 8% mannitol aan een Petrischaal met behulp van een spatel. Plaats vijf tot zeven dagen oud mos van twee tot drie PP NH 4-platen in de mannitol. Raadpleeg het bijbehorende geschreven protocol voor deze en aanvullende recepten voor reagentia. Voeg vervolgens 3 mL 2% drizly toe en incubeer gedurende één uur bij kamertemperatuur onder zachte schudding.Filter het mengsel door een gaas van 100 micron om een groene homogene suspensie te verkrijgen. Centrifugeer het filtraat vervolgens bij 250 G gedurende vijf minuten. Verwijder het supernatant zeer voorzichtig.Resuspendeer de protoplasten in 500 µL 8% mannitol. Voeg vervolgens nog eens 9,5 mL 8% mannitol toe. Zorg ervoor dat de protoplasten volledig gesuspendeerd zijn.Voer de wasstappen nog twee keer uit door de oplossing opnieuw vijf minuten te centrifugeren bij 250 G. Verwijder het supernatant en resuspendeer de protoplasten, eerst in 500 microliters.Voeg vervolgens 9,5 milliliters 8% mannitol toe en gebruik een hemocytometer. Tel het aantal protoplasten in 10 microliters van de suspensie om DNA in de geïsoleerde protoplasten te transformeren. Centrifugeer eerst het protoplastenmengsel bij 250 G gedurende vijf minuten.Verwijder het supernatant en resuspendeer de protoplasten in MMG-oplossing tot een concentratie van 1,6 miljoen per milliliter. Incubeer de suspensie gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Voeg vervolgens 600 microliters van de protoplastenoplossing toe aan een cultuurbuis die 60 microgram DNA bevat. Schud goed.Voeg voorzichtig 700 µL PEG-calciumoplossing toe en schud. Laat het monster gedurende deze wachttijd 30 minuten incuberen bij kamertemperatuur. Dek de PRMB-platen af met cellofaan.Verdun vervolgens de suspensie met drie milliliters W5-oplossing en centrifugeer bij 250 G gedurende vijf minuten. Om de PEG te verwijderen, worden de protoplasten opnieuw gesuspendeerd in twee milliliters PRMT; plateer één milliliter per PRMB-plaat bedekt met cellofaan. Bewaar de platen bij 25 °C in een groeikamer.Verplaats tenslotte, vier dagen na de transformatie, de cellofaan naar nieuwe selectieplaten. Deze figuur toont een voorbeeld van 18 dagen oude planten die zijn geregenereerd uit protoplasten, getransformeerd met 15 µg supercoiled plasmide-DNA dat een hygromycine-resistentiecassette bevat. Hier werden 30 µg van hetzelfde supercoiled plasmide-DNA in protoplasten getransformeerd.In dit monster werden 60 micrograms plaid DNA getransformeerd. Ten slotte werden deze planten geregenereerd uit protoplasten die waren getransformeerd met 120 micrograms van hetzelfde supercoiled plasma DNA dat de hygromycine-resistentiecassette bevat. De transformatie-efficiëntie wordt niet beïnvloed door DNA-concentraties tot 60 micrograms.Hogere DNA-concentraties zijn echter nadelig voor deze procedure. De gegevens geven aan dat deze methode consistente resultaten levert over een breed bereik van DNA-hoeveelheden per semester. Deze techniek kan in drie uur worden voltooid indien deze correct wordt uitgevoerd.Na deze procedure kunnen aanvullende methoden, zoals transiënte RNAi en gene knockouts, worden uitgevoerd om verdere vragen over genfunctie te beantwoorden.

efficient-polyethylene-glycol-peg-mediated-transformation-moss

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Het protocol beschrijft het gebruik van de eiwitexpressie methylotrofe...

Expressie van recombinante eiwitten in het methylotrofe gist Pichia pastoris</em

Dit artikel beschrijft genetische transformatie van de eencellige mariene...

Genomic Transformatie van de Picoeukaryote<em&gt; Ostreococcus Tauri</em

Een high-throughput, geautomatiseerde, tabak protoplast productie en transformatie methode is beschreven. Het robotsysteem maakt massively parallel genexpressie en ontdekking in het model BY-2 systeem dat vertaalbaar naar niet-model gewassen zou moeten zijn.

Een Robotic Platform voor High-throughput protoplastisola- en Transformatie

We beschrijven een robuuste gen vervangende strategie om de vuiligheid schimmel Ustilago maydis genetisch te manipuleren. Dit protocol wordt uitgelegd hoe u deletiemutanten genereren om infectie fenotypes onderzoeken. Kan worden uitgebreid tot genen in elke gewenste wijze, bijvoorbeeld wijzigen door toevoeging van een sequentie die codeert voor een fluorescerend eiwit tag.

Genetische Manipulatie van de Plant Pathogeen<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Om Fungal Biology and Plant Microbe Interactions Studie

We ontwikkelden een eenvoudige en efficiënte protocol voor de voorbereiding van grote hoeveelheden soja protoplasten om te studeren van de ingewikkelde regelgeving en signalering mechanismen in levende cellen.

Een eenvoudige methode voor het isoleren van soja protoplasten en toepassing op voorbijgaande gen expressie Analyses

Agrobacterium-gemedieerde transformatie met een bloemen-dip-methode kan met succes worden gebruikt om het creëren van stabiele transgene lijnen van het extremophyte model Schrenkiella parvula. We presenteren een protocol aangepast ten opzichte van die voor Arabidopsis thaliana, overwegen verschillende groei gewoonten en fysiologische kenmerken van de extremophyte.

Planten groei en Agrobacterium-gemedieerde Floral-dip transformatie van de Extremophyte Schrenkiella parvula

Hier presenteren we een high-throughput protocol om miljoenen maïsprotoplasten tijdelijk te transfecteren voor het testen van grote bibliotheken van plasmiden in maïsmesofylcellen.

Schaalbare transfectie van maïs mesophyl protoplasten

Dit protocol schetst het gebruik van Agrobacterium tumefaciens-gemedieerde transformatie (AMT) voor het integreren van gen(en) van belang in het nucleaire genoom van de groene microalg Chlorella vulgaris, wat leidt tot de productie van stabiele transformatoren.

Agrobacterium tumefaciens-gemedieerde genetische manipulatie van groene microalgen, Chlorella vulgaris

We presenteren een eenvoudig, effectief en reproduceerbaar protocol voor Agrobacterium-gemedieerde transformatie van Phytophthora palmivora, dat ook toepasbaar is op P. capsici.

Een vereenvoudigde methode voor agrobacterium-gemedieerde transformatie van Phytophthora palmivora

Groeiende aantal vlas variëteiten onder voedingsstoffen stress resulteert in genomische variatie binnen een subset van het genoom en fenotypische variatie. Een complex plaatsing op een bepaalde locatie wordt geassocieerd met de groei onder verschillende voedingsstoffen regimes en met veranderingen in genexpressie rond deze site.

Milieuvriendelijk Induced erfelijke veranderingen in de Flax

Leer een efficiënte PEG-gemedieerde transformatiemethode voor protoplasten van het mos Physcomitrella patens. Dit protocol maakt betrouwbare genetische manipulatie mogelijk voor onderzoek naar genfunctie.

Efficiënte polyethyleenglycol (PEG) gemedieerde transformatie van de Moss Physcomitrella patens

Meer video's verkennen