NanoDrop microvolume Kwantificering van nucleïnezuren

Het NanoDrop-monsterretentiesysteem is een innovatieve technologie die gebruikmaakt van de inherente oppervlaktespanning van vloeistoffen om microvolumemonsters vast te houden en te meten tussen twee optische voetstukken, zonder gebruik van kwartskuvetten of capillairen. Er wordt slechts één microliter monster direct op het onderste optische oppervlak gepipetteerd. Bij het sluiten van de spectrometerarm wordt een vloeistofkolom gevormd tussen de bovenste en onderste optische voetstukken.

Door de vorming van een verticaal optisch pad via oppervlaktespanning kan de verticale padlengte tijdens de meting in realtime automatisch veranderen. Door de padlengte te verkorten kunnen hogere concentraties worden gemeten, waardoor verdunningen voor de meeste nucleïnezuurmonsters effectief overbodig worden. Bovendien versnelt het monsterretentiesysteem het experimentele proces met een snelle reiniging, die enkel bestaat uit het afnemen van de optische oppervlakken met een laboratoriumdoekje.

Vandaag demonstreren we twee procedures voor het bepalen van de concentratie van nucleïnezuren met behulp van microvolume-instrumentatie van Thermo Scientific. Het eerste protocol is een directe meting van nucleïnezuren met de NanoDrop 2000 C spectrophotometer. Het tweede protocol is een indirecte fluorescentiemeting van nucleïnezuren met de NanoDrop 3, 300 fluoro spectrometer.

Om te beginnen: maak de bovenste en onderste optische oppervlakken van het monster-retentiesysteem van de microvolumespectrofotometer schoon door twee tot drie µL schoon gedeïoniseerd water op het onderste optische oppervlak te pipetteren. Sluit de hefboomarm zodat het bovenste voetstuk in contact komt met het gedeïoniseerde water. Til de hefboomarm op en veeg beide optische oppervlakken af met een schone, droge pluisvrije laboratoriumdoek.

Open vervolgens de NanoDrop-software en selecteer de applicatie voor nucleïnezuren. Gebruik een gekalibreerde micropipet met een klein volume om een nulmeting uit te voeren door één µL buffer op het onderste optische oppervlak aan te brengen. Laat de hendel zakken en selecteer 'blank' in de applicatie voor nucleïnezuren.

Zodra de nulmeting is voltooid, reinigt u beide optische oppervlakken met een laboratoriumdoekje. Kies, zoals eerder gedaan, de juiste constante voor het monster dat gemeten moet worden. Breng vervolgens één µL van het nucleïnezuurmonster aan op de onderste optische voet en sluit de hendelarm.

Omdat de meting onafhankelijk is van het volume, hoeft het monster enkel de opening tussen de twee optische oppervlakken te overbruggen. Selecteer voor het uitvoeren van een meting 'measure' in de applicatiesoftware; de software zal automatisch de nucleic acid-concentratie en de zuiverheidsratio's berekenen. Beoordeel na de monstermeting de spectrale output. Een typisch nucleic acid-monster vertoont een zeer kenmerkend profiel.

Spectrale indicatoren van een monster van slechte kwaliteit zijn onder meer golflengte-inkepingen in het dal en in de 260 nanometer piek. Veelvoorkomende bronnen van contaminanten die geassocieerd worden met specifieke nucleic acid-isolatietechnieken zijn fenol, triol en kolomextractie. In het geval van fenol-triol-extractie kan residuele reagenscontaminatie worden aangetoond door abnormale spectra tussen 220 en 240 nanometer, evenals door verschuivingen in de regio van 260 tot 280 nanometer.

Omgekeerd kunnen guaninestresten uit de kolomextractie bijdragen aan een piek nabij 230 nanometer en een verschuiving van het dal van 230 nanometer naar ongeveer 240 nanometer. Om de zuiverheid van het monster nauwkeurig te beoordelen, moeten de 2 62 80 en 2 62 30 ratio's worden geanalyseerd in combinatie met de algemene spectrale kwaliteit. Zuivere nucleïnezuren leveren doorgaans een 2 62 80 ratio op van ongeveer 1,8 voor DNA en ongeveer 2,0 voor RNA.

Deze ratio is afhankelijk van de pH en de ionsterkte van de buffer die wordt gebruikt voor de blanco- en monstermetingen. De Banana drop 3, 300 fluorescentiespectrometer maakt gebruik van hetzelfde gepatenteerde systeem voor het vasthouden van microvolume-monsters als de NanoDrop 2000 C spectrofotometer. Aangezien fluorescentiemetingen worden uitgevoerd met slechts één microliter monster, kiest de gebruiker een van de drie LED's als excitatiebron, die horizontaal op het monster schijnt.

De daaropvolgende fluorescentie van het monster wordt vervolgens in een hoek van 90 graden verticaal opgevangen in een interne spectrometer. Om de hoge gevoeligheid voor nucleic acid-kwantificering in microvolumes met de NanoDrop 3, 300 aan te tonen, wordt een PicoGreen fluorescentiekit gebruikt; begin met het equilibreren van de kitstandaarden en alle nucleic acid-monsters tot kamertemperatuur. Fluorescerende monsters zijn lichtgevoelig en moeten in amberkleurige of met aluminium omwikkelde buisjes worden bewaard.

Bereid voldoende 1X TE-buffer voor alle standaarden en monsters die gemeten moeten worden, evenals voor de benodigde pico green-werkoplossing. Bereid de 1X TE-buffer door de meegeleverde 20X TE-buffer te verdunnen met nucleasedestillatiewater volgens het protocol van de fabrikant. De reactievolumes kunnen variëren van 200 µL tot minimaal 10 µL.

In dit voorbeeld bereiden we reactievolumes van 10 µL voor. Bereid vervolgens seriële verdunningen van dubbelstrengs DNA-standaarden en nucleasevrije vials of buisjes. Hiermee wordt het verwachte concentratiebereik van de onbekende DNA-monsters gedekt.

Breng vijf µL van elke verdunde dubbelstrengs DNA-standaard over in een individueel gelabelde, nucleasevrije amberkleurige of met folie bedekte buis. Verdeel vervolgens vijf µL van elk dubbelstrengs DNA-monster van belang over de bijbehorende lichtbeschermde buis. Nadat de Pico Green-werkoplossing volgens het protocol van de fabrikant is bereid, wordt een gelijk volume van de oplossing overgebracht naar elke buis met een dubbelstrengs DNA-standaard of een dubbelstrengs DNA-monster, in dit geval vijf µL.

Meng gelijke volumes van één XTE-buffer en Pico Green-werkoplossing. Bereid de negatieve controle, die dient als referentieoplossing. Meng de inhoud van elke buis grondig door voorzichtig te pipetteren en laat dit vijf minuten incuberen bij kamertemperatuur.

Alle standaarden en monsters moeten voor de meting op dezelfde temperatuur worden geëquilibreerd, aangezien het fluorescentiesignaal wordt beïnvloed door de temperatuur. Om het instrument voor te bereiden en de eerste metingen uit te voeren, worden eerst de onderste en bovenste oppervlakken van het monsterretentiesysteem gereinigd, waarna twee tot drie µL gedeïoniseerd water op het onderste optische oppervlak wordt gepipetteerd. Open vervolgens de hefboom en dep de bovenste en onderste voetstukken droog met een schoon, pluisvrij laboratoriumdoekje.

Zorg ervoor dat de oppervlakken pluisvrij zijn voordat u verdergaat. Pluis kan namelijk fluorescentie vertonen in de aanwezigheid van een excitatiebron en de meting kunnen verstoren. Open de software van het instrument.

Selecteer de applicatie voor nucleïnezuren en kies de optie voor pico green dubbelstrengs DNA. Pipetteer 2 µL van 1X TE naar het onderste platform. Sluit de hefboom en selecteer 'blank' in het veld van de instrumentsoftware. Zodra de blanco-meting is voltooid, dep je de blanco-oplossing van beide oppervlakken van het monsterretentiesysteem.

Meng vervolgens de referentieoplossing door voorzichtig te pipetteren met low-retention tips. Pipetteer 2 µL van de referentieoplossing op het onderste platform en sluit de hendel. Selecteer 'reference' onder het tabblad 'standards' en kies de gewenste eenheden.

Klik op meten om de meetcyclus te starten. Wanneer de meetcyclus is voltooid, opent u de hefboomarm en dept u de oppervlakken van het monsterretentiesysteem grondig droog. Meet tot vijf herhalingen van de referentie, waarbij voor elke herhaling een nieuwe Eloqua wordt gebruikt.

Herhaal het proces voor de overige standaarden om een standaardcurve op te stellen. Er kunnen tot zeven standaarden worden gebruikt. De software is ontworpen om tot vijf replica's per standaard op te slaan.

Replica's van de standaarden worden gemiddeld om een standaardcurve te genereren, waarmee de monsterconcentraties automatisch worden bepaald. Zodra de standaardcurve voltooid is, selecteert u het tabblad monsters, voert u de respectievelijke ID-informatie van de monsters in en meet u elk onbekend monster. Een geldige curve geeft aan dat het minimumaantal standaarden is bereikt.

De DNA-concentratie wordt automatisch bepaald op basis van de standaardcurve. NanoDrop Micro volume-instrumentatie kan de concentratie van nucleïnezuren bepalen via directe A260-metingen of indirecte fluorimetrische methoden. NanoDrop-spectrofotometers kunnen ook worden gebruikt om eiwitten te kwantificeren met behulp van directe A280-absorbentie of via eiwit-colorimetrische assays.