Name: NanoDrop microvolume Kwantificering van nucleïnezuren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-22T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Leer nucleïnezuurkwantificering met NanoDrop microvolume-systemen voor moleculaire biologie. Deze methode maakt directe en indirecte metingen mogelijk met minimale samplevolumes en hoge nauwkeurigheid.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Richard W. Beringer en David L. Ash, Applications Wetenschappers, Thermo Scientific NanoDrop producten, voor technische bijstand en filmen.

1. Microvolume Nucleic Acid Kwantificering Met behulp van een NanoDrop 2000c Spectrofotometer <ol><li> Om te beginnen, het reinigen van de bovenste en onderste optische oppervlakken van de microvolume spectrofotometer monster retentie systeem door pipetteren 2-3 ul van schoon gedeïoniseerd water op de onderste optisch oppervlak. </li><li> Sluit de hendel, ervoor te zorgen dat de bovenste voetstuk in contact komt met het gedeïoniseerd water. Til de hendel arm en veeg zowel optische oppervlakken met een schone, droge, pluisvrije lab te vegen. </li><li> Open de NanoDrop software en selecteer de Nucleic Acid toepassing. Gebruik een klein volume, gekalibreerde pipet met een blanco meting uit te voeren door de uitgifte een ul buffer op de lagere optisch oppervlak. Laat de hendel arm en selecteer "Blanco" in het nucleïnezuur toepassing. </li><li> Zodra de blanco meting is voltooid, schoon zowel optische oppervlakken met een schone, droge, pluisvrije lab te vegen. </li><li> Kies de juiste constante voor het monster dat moet worden gemeten. <table border="1"><tbody><tr><td> Sample Type </td><td> Selecteert u Optie </td><td> Constant gebruikt om de concentratie berekenen </td></tr><tr><td> dsDNA </td><td> DNA-50 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> ssDNA </td><td> DNA-33 </td><td> 33 </td></tr><tr><td> RNA </td><td> RNA-40 </td><td> 40 </td></tr><tr><td> Oligo </td><td> Gewoonte </td><td> 15-150 </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Typische nucleïnezuur concentratiebereiken voor directe A280 absorptie metingen met behulp van een NanoDrop microvolume spectrofotometer, een traditionele kuvet-based spectrofotometer gebruikt met een TrayCell microcell kuvet, en een microvolume NanoDrop fluorospectrometer in combinatie met de PicoGreen test. </li><li> Doseer een pi van nucleïnezuurmonster op de lagere optische voetstuk en sluit de hefboom arm. Omdat de meting is het volume onafhankelijk, het monster hoeft alleen maar de kloof tussen de twee optische oppervlakken voor een meting worden gedaan. </li><li> Selecteer "Measure" in de applicatie software. De software berekent automatisch het nucleïnezuur concentratie en zuiverheid ratio's. Volgende voorbeeld van de meting, toetsing van de spectrale output. </li><li> De software berekent automatisch het nucleïnezuur concentratie en zuiverheid ratio's. Volgende voorbeeld van de meting, toetsing de spectrale afbeelding om te proeven kwaliteit te beoordelen. </li><li> Een typische nucleïnezuurmonster zal een zeer karakteristieke profiel. <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Een typisch nucleïnezuurmonster zal een zeer karakteristieke profiel. </li><li> Gemeenschappelijke bronnen van verontreinigingen in verband met specifieke nucleïnezuur isolatie technieken zijn Fenol / TRIzol en kolom extractie. In het geval van Fenol / TRIzol extractie, kan resterende reagens verontreiniging worden aangegeven door abnormale spectra tussen 220-240 nm en door verschuivingen in de 260 tot 280 nm regio. Omgekeerd kan resterende guanidine van kolom extractie bij te dragen tot een piek bij 230 nm en een verschuiving in de trog van 230 nm tot ongeveer 240 nm. <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. De verschuivingen in de pieken en dalen van de monsters B en C ten opzichte van monster A illustreren hoe verontreinigingen kunnen de spectra van nucleïnezuur monsters beïnvloeden. </li><li> Nauwkeurig te kunnen beoordelen monster kwaliteit, moet 260/280 of 260/230 ratio's worden geanalyseerd in combinatie met de algemene spectrale kwaliteit. Pure nucleïnezuren levert doorgaans een 260/280 verhouding van ~ 1,8 en een 260/280 verhouding van ~ 2.0 voor DNA en RNA, respectievelijk. Deze verhouding is afhankelijk van de pH en ionische sterkte van de buffer wordt gebruikt om de blanco en monster metingen te verrichten. Zure oplossingen zullen onder-vertegenwoordigen de verhouding van 0,2-0,3, terwijl een fundamentele oplossing zal de verhouding tussen over-vertegenwoordigen 0,2-0,3. Significant verschillend zuiverheid verhoudingen kunnen wijzen op de aanwezigheid van eiwit, fenol of andere verontreinigingen die sterk absorberen in of bij 280 nm. De 260/230 zuiverheid ratio is een tweede maatregel van de DNA zuiverheid met waarden voor een "zuivere" nucleïnezuur gewoonlijk in het bereik van 1,8-2,2. Zuiverheid ratio's die zijn aanzienlijk lager dan de verwachte waarden kunnen wijzen op de gebruikte isolatie techniek kan verdere optimalisatie nodig is. </li><li> NanoDrop spectrofotometers kan ook worden gebruikt om de eiwitten met behulp van directe absorptie of door eiwitten colorimetrische assays kwantificeren. Om ervoor te zorgen de juiste kolom vorming en reproduceerbaarheid, zijn 2-ul monsters geadviseerd voor eiwit monsters. Raadpleeg de volgende Jove video: microvolume eiwitconcentratie Bepaling Met behulp van de NanoDrop Spectrophotometer <a href="https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=1610">https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=1610</a> </li></ol><ol><li> Om aan te tonen hoge gevoeligheid microvolume nucleïnezuur kwantificeren met behulp van de NanoDrop 3300, is een PicoGreen fluorescentie-kit gebruikt. Om te beginnen, evenwicht de kit normen en alle nucleïnezuur monsters op kamertemperatuur. TL-monsters zijn lichtgevoelig en dient te worden bewaard in oranje of aluminium omwikkeld buizen. </li><li> Bereid genoeg 1x TE-buffer voor alle normen en monsters zo goed zijn zoals gemeten voor de PicoGreen werkende oplossing die nodig zullen zijn. Bereid 1xTE buffer door verdunning van de verstrekte 20x TE-buffer met nuclease-vrij water per protocol van de fabrikant. Reactie volumes kan variëren van 200 pi tot zo weinig als 10 ul. In dit voorbeeld wordt 10 pi reactie volumes worden voorbereid. </li><li> Bereid serieel verdund dsDNA normen op 2x de uiteindelijke gewenste concentratie in nuclease-vrije flesjes of tubes. Overdracht 5 pi van elk van de verdunde dsDNA normen in een individueel label nuclease-vrij amber of folie bedekte buis. </li><li> Aliquot 5 pi van elk monster dsDNA van belang in het gepaste label nuclease-vrij amber of folie bedekte buizen. </li><li> Bereid PicoGreen werkende oplossing volgens protocol van de fabrikant. Overdracht een gelijk volume van de PicoGreen werkende oplossing voor elk buisje met daarin een standaard of monster van belang (5 pi in dit voorbeeld). </li><li> Combineer gelijke volumes 1x TE-buffer en PicoGreen werkende oplossing voor de negatieve controle, die dient als een referentie-oplossing te bereiden. </li><li> Meng de inhoud van elke reactie buisje door zachte pipetteren en incubeer de reacties bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Alle normen en de monsters moeten worden in evenwicht gebracht om dezelfde temperatuur voor de meting als fluorescentie-signaal wordt beïnvloed door de temperatuur. </li><li> Ter voorbereiding van het instrument en het uitvoeren van metingen, eerst schoon de onderste en bovenste oppervlak van het monster retentie systeem. Pipet 2-3 ul van gedeïoniseerd water op de onderste optisch oppervlak, sluit vervolgens de hendel arm open, en dep de bovenste en onderste sokkels met een schone, niet-pluizende, laboratorium te vegen. Zorg ervoor dat de oppervlakken zijn vrij van pluizen voordat je verder gaat als pluis kan fluorescentie vertonen in de aanwezigheid van een excitatie bron en kunnen interfereren met de meting. </li><li> Open het instrument software, kies de "Nucleic Acids" applicatie, en selecteer de "PicoGreen-dsDNA" optie. </li><li> Om lege het instrument, voeg 2 ul 1x TE naar de lagere sokkel, sluit de arm, en selecteer "Blanco" in het instrument gebied van software. Eenmaal leeg is voltooid, vlek uit de blanco-oplossing van beide oppervlakken van het monster retentie systeem. </li><li> Meng de referentie-oplossing door zachte pipetteren. Met behulp van een lage retentie tips, pipetteer 2 pl op de lagere voetstuk en sluit de arm. </li><li> Selecteer de "Reference" in de meting, selecteer de gewenste eenheden. Klik op "Measure" om de meetcyclus te starten. </li><li> Wanneer de meting cyclus is voltooid, opent u de arm en grondig blot uit de steekproef bevestigingssysteem oppervlakken. Meet tot vijf herhalingen van de referentie, met behulp van een verse hoeveelheid voor elke repliceren. </li><li> Herhaal dit proces voor de extra normen om een ​​standaardcurve te bouwen. Tot zeven normen kunnen worden gebruikt. De software is ontworpen om maximaal vijf replica voor elke standaard. Replicaten van de normen worden gemiddeld op een standaard curve waarvan de gemeten concentraties worden automatisch bepaald genereren. </li><li> Zodra de norm curve is voltooid, selecteert u het "Samples" tab, voert u de desbetreffende monster ID-informatie en meten elk onbekend monster. </li></ol>

<ol><li>Wilfinger, W. W., Mackey, K., Chomczynski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+pH+and+Ionic+Strength+on+the+Spectrophotometric+Assessment+of+Nucleic+Acid+Purity%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Effect of pH and Ionic Strength on the Spectrophotometric Assessment of Nucleic Acid Purity.</a> BioTechniques. 22, 474-481 (1997).</li>
<li>Voolstra, C., Jungnickel, A., Borrmann, L., Kirchner, R., Huber, A. Spectrophotometric Quantification of Nucleic Acids: LabelGuard enables photometric quantification of submicroliter samples using a standard photometer. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVoolstra%2C+C+%22Implen+Applications+Note%22">Implen Applications Note</a>. , Munich, Germany. (2006).</li>
<li>Jr, I. ngle, D, J., Crouch, S. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJr%2C+Ingle+%22Spectrochemical+analysis%22">Spectrochemical analysis</a>. , Prentice Hall. Englewood Cliffs, NJ. XV-590 (1988).</li>
<li>Van Lancker, M., Gheyssens, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+four+frequently+used+assays+for+quantitative+determination+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Lett%22%5BJournal%5D)">A comparison of four frequently used assays for quantitative determination of DNA.</a> Anal. Lett. 19, 615-623 (1986).</li>
</ol>

Philippe Desjardins en Debra Conklin zijn in dienst van Thermo Scientific NanoDrop Products, Inc dat de instrumenten gebruikt in dit artikel oplevert.

De kwantificatie protocollen hier zijn gebaseerd op de meest geaccepteerde microvolume systemen. Dergelijke systemen bieden praktische alternatieven voor de traditionele nucleïnezuur kwantificatie methode, die afhankelijk zijn van een grotere steekproef volumes en het gebruik van containment apparatuur. NanoDrop microvolume technologie maakt gebruik van een sample retentie systeem dat is gebaseerd op de oppervlaktespanning eigenschappen van het monster wordt gemeten tot een vloeistofkolom vorm. Het is essentieel dat de steekproef contact maakt met de bovenste en onderste optische meting oppervlakken voor een goede column vorming. Als op enig moment van de meetresultaten lijken onjuiste of niet reproduceerbaar, het is waarschijnlijk het resultaat van de steekproef heterogeniteit of vloeibare kolom breuk. Wasmiddelen en isopropyl alcohol worden niet aanbevolen schoonmaakmiddelen want deze kunnen deconditioneren het voetstuk meting oppervlakken. Een onvoorwaardelijke voetstuk treedt op wanneer de hydrofobe oppervlakte-eigenschappen van de sokkel zijn aangetast, wat resulteert in een afvlakking van het monster druppel. Ongeconditioneerde voetstukken kan leiden tot breuk van de vloeistof kolom tijdens de meting. <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Ongeconditioneerd oppervlak wordt gekenmerkt door een afvlakking van een waterdruppel. Uncondtioned voetstuk oppervlakken kunnen worden gereconditioneerd met behulp van NanoDrop Pedestal Reconditionering Compound (PR-1, Thermo Scientific NanoDrop Products). Een dunne laag van reconditionering verbinding wordt toegepast op de bovenste en onderste voetstuk oppervlakken, laten drogen voor ~ 30 seconden, daarna wreef uitschakelen met behulp van een schone, droge, pluisvrije lab te vegen. Een succesvol gereviseerde toestand wordt gekenmerkt door een waterdruppel parelen wanneer toegepast op de bodem voetstuk oppervlak. <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig4.jpg" alt="Figuur 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4. Een gereviseerde oppervlak wordt gekenmerkt door een kralen van een waterdruppel. Microvolume kwantificatie systemen sterk verminderen monster verbruik en drastisch verhogen de concentratie range in vergelijking met meer traditionele kwantificering systemen. Hoewel microvolume kwantificatie vaak uitgegroeid tot een enabling technology voor omstandigheden met betrekking tot beperkte celmassa, zoals de naald biopsieën en laser-capture microdissectie, de efficiëntie en gemak van het gebruik van deze methodologie heeft ervoor gezorgd dat een algemeen aanvaarde alternatief voor de traditionele nucleïnezuur kwantificatie methode zelfs wanneer monster is er in overvloed.

<table><tbody><tr><td>NanoDrop 2000c</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>ND-2000C</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 3300</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>ND-3300</td><td></td></tr></tbody></table>

nanodrop microvolume kwantificering van nucleïnezuren

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Biomoleculaire tests worden voortdurend ontwikkeld, die gebruik maken van steeds kleinere hoeveelheden materiaal, vaak zich verzet tegen het gebruik van conventionele kuvet-gebaseerde instrumenten voor nucleïnezuur kwantificering voor degenen die microvolume kwantificatie kan uitvoeren. De NanoDrop microvolume monster retentie systeem (Thermo Scientific NanoDrop Products) functies door de combinatie van glasvezel technologie en natuurlijke oppervlaktespanning eigenschappen vast te leggen en te behouden minieme hoeveelheden van het monster los van de traditionele containment apparaten zoals cuvettes of haarvaten. Bovendien is het systeem maakt gebruik van kortere weglengte, die resulteren in een breed scala aan nucleïnezuur concentratiemetingen in wezen waardoor de noodzaak om verdunningen uit te voeren. Vermindering van het volume van het monster nodig voor spectroscopische analyse ook vergemakkelijkt de opname van extra kwaliteitscontrole stappen heel veel moleculaire workflows, het verhogen van de efficiëntie en uiteindelijk leidt tot meer vertrouwen in downstream resultaten. De noodzaak voor hoge gevoeligheid fluorescerende analyse van de beperkte massa is ook naar voren gekomen met de recente experimentele ontwikkelingen. Met dezelfde microvolume monster retentie-technologie, kan TL-metingen worden uitgevoerd met 2 pl van materiaal, waardoor tl-assays volume eisen aanzienlijk worden verminderd. Dergelijke microreactions van 10 pi of minder zijn nu mogelijk met behulp van een speciale microvolume fluorospectrometer. Twee microvolume nucleïnezuur kwantificatie protocollen zal worden aangetoond dat het gebruik geïntegreerde monster retentie systemen als praktische alternatieven voor de traditionele kuvet-gebaseerde protocollen. Eerst wordt een directe A260 absorptie methode met behulp van een spectrofotometer microvolume beschreven. Dit wordt gevolgd door een demonstratie van een fluorescentie-gebaseerde methode die minder volume fluorescentie reacties mogelijk maakt met een microvolume fluorospectrometer. Deze nieuwe technieken kunnen worden beoordeeld van nucleïnezuur concentraties variërend van 1 pg / ul tot 15.000 ng / ul met een minimaal verbruik van het monster.

Het gebruik van NanoDrop microvolume systemen als praktische en efficiënte alternatieven voor de traditionele nucleïnezuur kwantificatie methode wordt beschreven door de demonstratie van twee microvolume nucleïnezuur kwantificatie protocollen.

NanoDrop microvolume Kwantificering van nucleïnezuren

Biomoleculaire assays worden voortdurend ontwikkeld die gebruikmaken van steeds kleinere hoeveelheden materiaal, waardoor het gebruik van conventionele ...

Het NanoDrop-monsterretentiesysteem is een innovatieve technologie die gebruikmaakt van de inherente oppervlaktespanning van vloeistoffen om microvolumemonsters vast te houden en te meten tussen twee optische voetstukken, zonder gebruik van kwartskuvetten of capillairen. Er wordt slechts één microliter monster direct op het onderste optische oppervlak gepipetteerd. Bij het sluiten van de spectrometerarm wordt een vloeistofkolom gevormd tussen de bovenste en onderste optische voetstukken.Door de vorming van een verticaal optisch pad via oppervlaktespanning kan de verticale padlengte tijdens de meting in realtime automatisch veranderen. Door de padlengte te verkorten kunnen hogere concentraties worden gemeten, waardoor verdunningen voor de meeste nucleïnezuurmonsters effectief overbodig worden. Bovendien versnelt het monsterretentiesysteem het experimentele proces met een snelle reiniging, die enkel bestaat uit het afnemen van de optische oppervlakken met een laboratoriumdoekje.Vandaag demonstreren we twee procedures voor het bepalen van de concentratie van nucleïnezuren met behulp van microvolume-instrumentatie van Thermo Scientific. Het eerste protocol is een directe meting van nucleïnezuren met de NanoDrop 2000 C spectrophotometer. Het tweede protocol is een indirecte fluorescentiemeting van nucleïnezuren met de NanoDrop 3, 300 fluoro spectrometer.Om te beginnen: maak de bovenste en onderste optische oppervlakken van het monster-retentiesysteem van de microvolumespectrofotometer schoon door twee tot drie µL schoon gedeïoniseerd water op het onderste optische oppervlak te pipetteren. Sluit de hefboomarm zodat het bovenste voetstuk in contact komt met het gedeïoniseerde water. Til de hefboomarm op en veeg beide optische oppervlakken af met een schone, droge pluisvrije laboratoriumdoek.Open vervolgens de NanoDrop-software en selecteer de applicatie voor nucleïnezuren. Gebruik een gekalibreerde micropipet met een klein volume om een nulmeting uit te voeren door één µL buffer op het onderste optische oppervlak aan te brengen. Laat de hendel zakken en selecteer 'blank' in de applicatie voor nucleïnezuren.Zodra de nulmeting is voltooid, reinigt u beide optische oppervlakken met een laboratoriumdoekje. Kies, zoals eerder gedaan, de juiste constante voor het monster dat gemeten moet worden. Breng vervolgens één µL van het nucleïnezuurmonster aan op de onderste optische voet en sluit de hendelarm.Omdat de meting onafhankelijk is van het volume, hoeft het monster enkel de opening tussen de twee optische oppervlakken te overbruggen. Selecteer voor het uitvoeren van een meting 'measure' in de applicatiesoftware; de software zal automatisch de nucleic acid-concentratie en de zuiverheidsratio's berekenen. Beoordeel na de monstermeting de spectrale output. Een typisch nucleic acid-monster vertoont een zeer kenmerkend profiel.Spectrale indicatoren van een monster van slechte kwaliteit zijn onder meer golflengte-inkepingen in het dal en in de 260 nanometer piek. Veelvoorkomende bronnen van contaminanten die geassocieerd worden met specifieke nucleic acid-isolatietechnieken zijn fenol, triol en kolomextractie. In het geval van fenol-triol-extractie kan residuele reagenscontaminatie worden aangetoond door abnormale spectra tussen 220 en 240 nanometer, evenals door verschuivingen in de regio van 260 tot 280 nanometer.Omgekeerd kunnen guaninestresten uit de kolomextractie bijdragen aan een piek nabij 230 nanometer en een verschuiving van het dal van 230 nanometer naar ongeveer 240 nanometer. Om de zuiverheid van het monster nauwkeurig te beoordelen, moeten de 2 62 80 en 2 62 30 ratio's worden geanalyseerd in combinatie met de algemene spectrale kwaliteit. Zuivere nucleïnezuren leveren doorgaans een 2 62 80 ratio op van ongeveer 1,8 voor DNA en ongeveer 2,0 voor RNA.Deze ratio is afhankelijk van de pH en de ionsterkte van de buffer die wordt gebruikt voor de blanco- en monstermetingen. De Banana drop 3, 300 fluorescentiespectrometer maakt gebruik van hetzelfde gepatenteerde systeem voor het vasthouden van microvolume-monsters als de NanoDrop 2000 C spectrofotometer. Aangezien fluorescentiemetingen worden uitgevoerd met slechts één microliter monster, kiest de gebruiker een van de drie LED's als excitatiebron, die horizontaal op het monster schijnt.De daaropvolgende fluorescentie van het monster wordt vervolgens in een hoek van 90 graden verticaal opgevangen in een interne spectrometer. Om de hoge gevoeligheid voor nucleic acid-kwantificering in microvolumes met de NanoDrop 3, 300 aan te tonen, wordt een PicoGreen fluorescentiekit gebruikt; begin met het equilibreren van de kitstandaarden en alle nucleic acid-monsters tot kamertemperatuur. Fluorescerende monsters zijn lichtgevoelig en moeten in amberkleurige of met aluminium omwikkelde buisjes worden bewaard.Bereid voldoende 1X TE-buffer voor alle standaarden en monsters die gemeten moeten worden, evenals voor de benodigde pico green-werkoplossing. Bereid de 1X TE-buffer door de meegeleverde 20X TE-buffer te verdunnen met nucleasedestillatiewater volgens het protocol van de fabrikant. De reactievolumes kunnen variëren van 200 µL tot minimaal 10 µL.In dit voorbeeld bereiden we reactievolumes van 10 µL voor. Bereid vervolgens seriële verdunningen van dubbelstrengs DNA-standaarden en nucleasevrije vials of buisjes. Hiermee wordt het verwachte concentratiebereik van de onbekende DNA-monsters gedekt.Breng vijf µL van elke verdunde dubbelstrengs DNA-standaard over in een individueel gelabelde, nucleasevrije amberkleurige of met folie bedekte buis. Verdeel vervolgens vijf µL van elk dubbelstrengs DNA-monster van belang over de bijbehorende lichtbeschermde buis. Nadat de Pico Green-werkoplossing volgens het protocol van de fabrikant is bereid, wordt een gelijk volume van de oplossing overgebracht naar elke buis met een dubbelstrengs DNA-standaard of een dubbelstrengs DNA-monster, in dit geval vijf µL.Meng gelijke volumes van één XTE-buffer en Pico Green-werkoplossing. Bereid de negatieve controle, die dient als referentieoplossing. Meng de inhoud van elke buis grondig door voorzichtig te pipetteren en laat dit vijf minuten incuberen bij kamertemperatuur.Alle standaarden en monsters moeten voor de meting op dezelfde temperatuur worden geëquilibreerd, aangezien het fluorescentiesignaal wordt beïnvloed door de temperatuur. Om het instrument voor te bereiden en de eerste metingen uit te voeren, worden eerst de onderste en bovenste oppervlakken van het monsterretentiesysteem gereinigd, waarna twee tot drie µL gedeïoniseerd water op het onderste optische oppervlak wordt gepipetteerd. Open vervolgens de hefboom en dep de bovenste en onderste voetstukken droog met een schoon, pluisvrij laboratoriumdoekje.Zorg ervoor dat de oppervlakken pluisvrij zijn voordat u verdergaat. Pluis kan namelijk fluorescentie vertonen in de aanwezigheid van een excitatiebron en de meting kunnen verstoren. Open de software van het instrument.Selecteer de applicatie voor nucleïnezuren en kies de optie voor pico green dubbelstrengs DNA. Pipetteer 2 µL van 1X TE naar het onderste platform. Sluit de hefboom en selecteer 'blank' in het veld van de instrumentsoftware. Zodra de blanco-meting is voltooid, dep je de blanco-oplossing van beide oppervlakken van het monsterretentiesysteem.Meng vervolgens de referentieoplossing door voorzichtig te pipetteren met low-retention tips. Pipetteer 2 µL van de referentieoplossing op het onderste platform en sluit de hendel. Selecteer 'reference' onder het tabblad 'standards' en kies de gewenste eenheden.Klik op meten om de meetcyclus te starten. Wanneer de meetcyclus is voltooid, opent u de hefboomarm en dept u de oppervlakken van het monsterretentiesysteem grondig droog. Meet tot vijf herhalingen van de referentie, waarbij voor elke herhaling een nieuwe Eloqua wordt gebruikt.Herhaal het proces voor de overige standaarden om een standaardcurve op te stellen. Er kunnen tot zeven standaarden worden gebruikt. De software is ontworpen om tot vijf replica's per standaard op te slaan.Replica's van de standaarden worden gemiddeld om een standaardcurve te genereren, waarmee de monsterconcentraties automatisch worden bepaald. Zodra de standaardcurve voltooid is, selecteert u het tabblad monsters, voert u de respectievelijke ID-informatie van de monsters in en meet u elk onbekend monster. Een geldige curve geeft aan dat het minimumaantal standaarden is bereikt.De DNA-concentratie wordt automatisch bepaald op basis van de standaardcurve. NanoDrop Micro volume-instrumentatie kan de concentratie van nucleïnezuren bepalen via directe A260-metingen of indirecte fluorimetrische methoden. NanoDrop-spectrofotometers kunnen ook worden gebruikt om eiwitten te kwantificeren met behulp van directe A280-absorbentie of via eiwit-colorimetrische assays.

nanodrop-microvolume-quantitation-of-nucleic-acids

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Deze video toont het protocol voor gemethyleerd DNA immunoprecipitatie (MeDIP). MeDIP is een twee dagen procedure die selectief gemethyleerd DNA-fragmenten extracten van een genomische DNA-monster met behulp van antilichamen met specificiteit voor 5-methylcytosine (anti-5 mC).

Gemethyleerd DNA Immunoprecipitatie

Microvolume monsters worden gekwantificeerd door een spectrofotometer systeem dat natuurlijke oppervlaktespanning gebruikt om monsters te behouden zonder het gebruik van cuvetten of haarvaten. Het dynamisch bereik van eiwitconcentraties en de snelheid waarmee ze kunnen worden gemeten zijn sterk verhoogd met deze methode.

Microvolume Eiwitconcentratie Bepaling met behulp van de NanoDrop 2000C Spectrophotometer

Deze mededeling bevat gegevens over de nauwkeurigheid en de reproduceerbaarheid van de BioSpec-nano UV-VIS spectrofotometer voor dsDNA en eiwit kwantificatie. Zelfs met ultra-kleine volumes (1 tot 2 L), reproduceerbaarheid is uitstekend, terwijl de automatische vegen functie verbetert de doorvoer en resulteert in een minimale overdracht voor betere resultaten.

Concentratie Bepaling van nucleïnezuren en eiwitten Met behulp van de Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

This video demonstrates the utility of digital PCR in a chip-in-a-tube format for the detection of single nucleotide variations in DNA samples. A single PCR reaction is partitioned into chambers that act as independent PCR reactions, and the detection of fluorescence signals from the amplified targets in the chambers is used to compute the frequency of the variant allele in the sample.

Chip-in-a-Tube-Based Digital PCR for Quantification of Single Nucleotide Variants

MicroRNA's (miRNA's) zijn een wijdverspreid geconserveerde klasse van regulerende moleculen. Hier beschrijven we een miRNA-kloonmethode die afhankelijk is van twee krachtige ligatiefasen gevolgd door high-throughput sequencing. Onze methode maakt nauwkeurige genoom-wide kwantificering van miRNA's mogelijk.

Zeer efficiënte Ligatie van Kleine RNA-moleculen voor MicroRNA Kwantificering van High-throughput sequencing

We beschrijven een digitale eindpuntassay voor het kwantificeren van nucleïnezuren met een vereenvoudigde (analoge) uitlezing. We meten bulkfluorescentie van druppelgebaseerde digitale assays met behulp van een standaard qPCR-machine in plaats van gespecialiseerde instrumenten en bevestigen onze resultaten door middel van microscopie.

Eenvoudige Bulk uitlezing van Digital nucleïnezuur kwantificering Testen

Er wordt een gevoelige en nauwkeurige methode beschreven voor de kwantificering van celvrije microRNA's met behulp van een kleurstof-gebaseerde chemie en druppel digitale PCR-technologie.

Circulerende MicroRNA Kwantificering Met behulp van DNA-bindende Dye Chemistry and Droplet Digital PCR

Semiflexible polymeren weer unieke mechanische eigenschappen die uitgebreid door levende systemen worden toegepast. Systematische studies over biopolymeren zijn echter beperkt omdat eigenschappen zoals polymeer rigiditeit niet toegankelijk zijn. Dit manuscript wordt beschreven hoe is deze beperking omzeild door programmeerbare DNA nanobuisjes, waardoor experimentele studies over de gevolgen van de stijfheid van de gloeidraad.

DNA Nanotubes als een veelzijdig instrument om te studeren van Semiflexible polymeren

Hier presenteren we een protocol voor het meten van absolute mitochondriale (mt) DNA-kopienummer en mtDNA-deletie heteroplasmieniveaus in enkele cellen.

Het meten van eencellig mitochondriaal DNA-kopienummer en heteroplasmie met behulp van digitale druppelpolymerasekettingreactie

De op DNAzyme gebaseerde nanomachines kunnen worden gebruikt voor zeer selectieve en gevoelige detectie van nucleïnezuren. Dit artikel beschrijft een gedetailleerd protocol voor het ontwerp van op DNA gebaseerde nanomachines met een 10-23-kern met behulp van gratis software en hun toepassing bij de detectie van een Epstein-Barr-virusfragment als voorbeeld.

DNAzyme 10-23 - Op basis van nanomachines voor nucleïnezuurherkenning

Dit protocol beschrijft de scheiding van het epitheel van de ooglens van de muis en de bulkmassa van de vezelcel, gevolgd door RNA-isolatie en qPCR-analyse. Deze methode maakt het mogelijk om lenscelcompartimenten te scheiden voor een meer gedetailleerde analyse van het transcriptoom en biologische processen in epitheelcellen versus gedifferentieerde vezelcellen.

RNA-isolatie van oculair lensepitheel van muizen en bulkmassa's van vezelcellen

Leer nucleïnezuurkwantificering met NanoDrop microvolume-systemen voor moleculaire biologie. Deze methode maakt directe en indirecte metingen mogelijk met minimale samplevolumes en hoge nauwkeurigheid.

NanoDrop microvolume Kwantificering van nucleïnezuren

Meer video's verkennen