Name: Optische beeldvorming van neuronen in de Krab Stomatogastric Ganglion met voltage-gevoelige kleurstoffen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-23T13:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Leer optische beeldvorming van neuronen in de krab stomatogastrische ganglion met voltage-gevoelige kleurstoffen. Deze methode registreert membraanpotentiaalveranderingen en synaptische interacties zonder elektrodebeperkingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij erkennen ondersteunen door de School voor Informatica en Faculteit der Natuurwetenschappen, Landbouw en Engineering van Newcastle University, de Universiteit van Ulm, en door de SciMedia Ltd (Tokyo, Japan).

1. Voorbereiding van de Crab Stomatogastric Zenuwstelsel Volwassen Cancer pagurus L. werden verkregen uit lokale bronnen (Newcastle University, Dove Marine Laboratories) en bewaard in gefilterd, belucht zeewater (10 - 12 ° C). Dieren werden verdoofd door verpakken ze in ijs voor 20 - 40 min. vóór versnijding. We gebruikten geïsoleerde stomatogastric zenuwstelsel (STNS) 1. De STNS werd vastgepind in een silicone-elastomeer beklede (ELASTOSIL RT-601, Wacker, München, Duitsland) petrischaaltje en continu superfused (7 - 12 ml / min) met een gekoelde fysiologische zoutoplossing (10-13 ° C). Fysiologische zoutoplossing bestond uit (mmol * l-1): NaCl, 440, MgCl 2, 26; CaCl 2, 13, KCl, 11; trisma basis, 10; maleïnezuur, 5. Zoutoplossing werd gehouden bij een constante temperatuur van 11 - 13 ° C en bij pH 7,4 tot 7,6. De gedetailleerde stappen van de STNS dissectie en preparaat, met inbegrip van de desheathing van de stomatoastric ganglion (STG), worden gepresenteerd in de Jupiter artikel van Guttierez en Grashow 1. Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de Europese Gemeenschappen richtlijn van de Raad van 24 november 1986 (86/609/EEG). Figuur 1a toont een schematisch diagram van de STNS en Figuur 1B toont een typische desheathed STG heeft zijn neuronen ingericht als een vlakke halve cirkel in het achterste deel van het ganglion. De petrischaal met de STNS is bevestigd aan de operationele platform van de imaging microscoop (BW51 WI, Olympus, Tokyo, Japan) met boetseerklei. Beide, de microscoop podium en de microscoop gemonteerd op een trilling geïsoleerde tafel (scientifica, Uckfield, VK) om bewegingsartefacten te voorkomen tijdens de optische recording. De motor patronen gegenereerd in de stomatogastric ganglion (STG) worden gecontroleerd met behulp van extracellulaire opnames 2-4. Dit gebeurt via de volgende stappen: <ol><li> Een vaseline op basis van cilindrische compartiment is opgebouwd rond een deel van de belangrijkste motorische zenuw (LVN) om de zenuw elektrisch isoleren van het bad (dit gebeurt op de dissectie stadium vóór de petrischaal is geplaatst op de operationele platform van de imaging microscoop ). </li><li> Een van de twee roestvrij stalen draden elektrode wordt geplaatst in dit compartiment, de andere in het bad als een referentie-elektrode. </li><li> Het differentieel signaal wordt opgenomen, gefilterd en versterkt met een AC differentiële versterker (Univ. Kaiserslautern, Duitsland). </li><li> De motorische activiteit van het ganglion wordt gecontroleerd met behulp van een oscilloscoop (DL708E, Yokogawa, Tokyo, Japan) en is bovendien geregistreerd met behulp van een data-acquisitie board (CED Power, 1401, Cambridge Electronic Design, Cambridge, Verenigd Koninkrijk) en de Spike 2 v6.10 software (Electronic Design Cambridge, Cambridge, Verenigd Koninkrijk). Bestanden worden geanalyseerd met behulp van Spike 2 v6.10 (Cambridge Electronic Design, Cambridge, Verenigd Koninkrijk). </li></ol> 2. Voorbereiding van de Dye-oplossing We gebruikten de tl-voltage-gevoelige kleurstof Di-8-ANEPPQ (Cambridge Bioscience) 5, die een dubbele positieve lading dat de belading van de kleurstof door middel van micro-elektroden vergemakkelijkt door gebruik te maken positieve stroom pulsen is. De kleurstof oplossing dient te worden beschermd tegen licht zo veel mogelijk. De kleurstof oplossing is als volgt bereid: <ol><li> 5 mg van de kleurstof wordt gemengd met 1 ml van de F-127 Pluronic zuur in DMSO (Invitrogen) oplossing. </li><li> Het plastic flacon met de opgeloste kleurstof is gecentrifugeerd gedurende 20 minuten bij 12.000 rotatie / minuut in een Sigma Reactievaatjes 1-14 (Sigma, Osterode, Duitsland) om grotere kleurstof deeltjes die de micro-elektrode kunnen verstoppen scheiden. </li><li> Het supernatant (top 200 pi) van de kleurstof oplossing is gescheiden met behulp van een pipet en opgeslagen in een aparte plastic flacon. Beide flacons zijn verpakt in aluminium folie om de blootstelling aan licht te voorkomen. </li><li> De kleurstof oplossing is bevroren bij -20 ° C. </li><li> Voor het gebruik van de kleurstof oplossing is gesmolten door het plaatsen van de gesloten en verpakt flacon in warm (25 ° C) water gedurende 10-15 minuten. </li></ol> 3. Kleurstof wordt geladen door intracellulaire injectie met behulp van micro-elektroden Sharp We gebruikten scherpe micro-elektroden om de neuronen te laden met de kleurstof. Om te controleren of de kleurstof laden gebruiken we de MiCAM02 imaging-systeem (SciMedia, Tokyo, Japan) 6. De imaging-systeem beschikt over twee CCD-camera's: de HR-camera heeft een grotere sensor chip (6,4 mm x 4,8 mm) een betere ruimtelijke resolutie met de beste temporele resolutie wordt 1,4 ms, de HS camera heeft een kleiner (2,9 mm x 2,1 mm), maar sneller sensor chip waardoor een snellere beeldverwerking met 0,7 ms als zijn beste temporele resolutie. De stappen van de kleurstof belasting zijn als volgt: <ol><li> Micro-elektroden worden getrokken met een P-97 Flaming - Brown (Sutter Instruments, Novato, CA, USA) elektrode trekker met 10 cm lang, 1 mm buitendiameter glazen buisjes met een gloeidraad (GB100TF 8P, Science Products, Hofheim, Duitsland). De elektroden zijn getrokken om een ​​weerstand in de hebbenrange van 25 - 40 MOhm in 3M KCl (voor de juiste trekken parameterinstellingen van de pipet kookboek die door de maker van de elektrode trekker te volgen). </li><li> De bevroren kleurstof oplossing is gesmolten en een zeer kleine hoeveelheid van het opgezogen in een microfil naald (MicroFil - 34 g, World precisie-instrumenten, Sarasota, FL, USA) - de opgezogen kleurstof vult ongeveer 2 / 3 e van de microfil naald . </li><li> De kleurstof oplossing in de microfil naald wordt geïnjecteerd in de punt van een micro-elektrode. De micro-elektrode wordt geplaatst in een donkere box voor 15 minuten. </li><li> De micro-elektrode is opgevuld met 3M KCl-oplossing. De elektrode wordt dan terug geplaatst in een donkere elektrode opbergbox voor een 10-20 minuten aan de kleurstof oplossing toe aan de fijne punt van de elektrode te bereiken door de zuiging van de capillaire kracht die in de micro-elektrode. </li><li> De kant micro-elektrode wordt geplaatst in een electrode houder en bevestigd op de headstage van de intracellulaire versterker (IA-251a, Warner Instruments Corporation, Hamden, CT, USA). </li><li> De intracellulaire versterker is verbonden met de data-acquisitie bord dat een puls signaal om de huidige pulsen rijden in de micro-elektrode biedt. </li><li> De micro-elektrode wordt voorzichtig geplaatst in het membraan van een neuron STG met behulp van een micro-elektrode manipulator (PatchStar, scientifica Ltd, Uckfield, Verenigd Koninkrijk). Sinds de werkafstand van het 10x objectief (UMPLFL10XW, NA 0,30, WD 3,3 mm, Olympus Corporation, Tokyo, Japan) van de imaging microscoop is erg klein, moet de micro-elektrode worden geplaatst in een schuine positie (rond de 30 °) en de beweging van de micro-elektrode in de juiste positie vereist een aantal stappen van de heroriëntatie van de microscoop doelstelling en het verplaatsen van de micro-elektrode. Om te beginnen de micro-elektrode wordt bewogen in een positie zodanig dat de tip is boven de STG. De microscoop doel is verlaagd totdat de elektrode punt scherp wordt weergegeven. Dan is het verder verlaagd, maar niet zo veel aan de micro-elektrode te raken. De micro-elektrode wordt verlaagd totdat het weer verschijnt in het brandpunt van de doelstelling. Deze stappen worden herhaald tot de neuronen duidelijk in de focus vlak van de doelstelling. Dan is de micro-elektrode wordt verlaagd tot het in aanraking komt en voorzichtig doorboort de membraan van de geselecteerde STG neuron. Dit wordt gecontroleerd met behulp van de oscilloscoop. </li><li> De intracellulaire elektrode wordt gebruikt om de activiteit van de geselecteerde STG neuron record in om het neuron gezien de activiteit van het profiel en de relatie tussen de activiteit en de STG activiteit opgenomen uit de extracellulaire elektrode 2,3,7 te identificeren. </li><li> De intracellulaire versterker wordt ingeschakeld in de huidige injectie modus en wordt gebruikt voor 30 minuten tot 10 injecteren nA positieve stroom stappen in de micro-elektrode dat laatste voor 1 seconde en worden gescheiden door een seconde gaten terwijl er geen stroom geïnjecteerd in de micro-elektrode. De geïnjecteerde stroom drijft de positief geladen kleurstof moleculen in de opgenomen neuron. Als apparatuur is beschikbaar meerdere neuronen kunnen gelijktijdig worden geïnjecteerd. </li><li> Tien minuten in de injectie-periode en na het einde van de injectie de kleurstof verspreiding in het neuron is gecontroleerd. Om dit te doen gebruiken we de MiCAM02 imaging-systeem (SciMedia Ltd, Tokio, Japan) met het 10x objectief en verlichting door de ultra-lage rimpel halogeen lichtbron (HL-151; Moritex, Tokyo, Japan) door het filter kubus MSWG2 (met 480 tot 550 nm excitatie-filter, Olympus Corporation, Tokyo, Japan). De imaging systeem is ingesteld op de HR-camera met 192 x 128 pixels, 40 ms imaging tijd, de 'hbin' mode, en 10 frames per opnamesessie. Als de kleurstof vulling is succesvol de beeldvorming moeten tonen een geverfd patch in het neuron rond de locatie van de micro-elektrode, en dit geverfd patch moet groeien tussen de foto's genomen na 10 minuten en na 30 minuten. Als men de verspreiding van de kleurstof niet voldoende is na 30 min, is meer injectie tijd verleend. Als alternatief kan een nieuw kleurstof elektrode worden gebruikt. </li><li> De elektrode wordt getrokken uit de neuron en de neuron wordt overgelaten om te ontspannen voor ten minste 20-30 minuten. Binnen deze tijd kan de volgende neuron worden ingespoten met kleurstof. </li></ol> 4. Beeldvorming van Geverfd Neuronen De activiteit van de afzonderlijke neuronen kunnen worden afgebeeld na de kleurstof vullen procedure. Als alternatief twee of meer neuronen kan worden gevuld tot het imago van de gelijktijdige activiteit van verschillende STG neuronen. In principe veel en mogelijk alle STG neuronen kan worden gevuld met kleurstof. De beeldvorming van de neuronen is gedaan met de Micam 02 imaging systeem met behulp van de HR-camera. De procedure van de beeldvorming is als volgt: <ol><li> De microscoop doel is veranderd en een hoge lichttransmissie rendement 20x objectief (XLUMPLFL20XW/0.95, NA 0,95, WD 2,0 mm, Olympus Corporation, Tokyo, Japan) wordt gebruikt voor de beeldvorming het verzamelen van gegevens. Deze doelstelling verzamelt veel meer licht dat het 10x objectief en ook hoger vergroting geeft meer gedetailleerde beeld van de neuronen. Bein g meer licht efficiënt middel dat kleine hoeveelheid kleurstof laden nu al zichtbaar is met dit doel en ook dat we kunnen lagere lichtintensiteit te gebruiken voor de beeldvorming waardoor het potentiële foto schade die mogelijk aan de neuronen worden veroorzaakt door de kleurstof. </li><li> De microscoop de operationele fase is geplaatst zodanig dat de neuronen die zijn bedoeld om te worden afgebeeld zijn op het gebied van licht van het doel en het doel is gericht op hen. </li><li> De extracellulaire gegevens worden ook ingevoerd in de Micam 02 imaging-systeem via de analoge ingang kanaal. Dit maakt het relatief eenvoudig over van optische signalen en de bijbehorende motorische patronen of extracellulair opgenomen pieken in de analyse fase. </li><li> Het Micam 02 systeem is ingesteld op 96 x 64 pixel resolutie te gebruiken met 2,2 ms imaging tijd of 48 x 32 pixel resolutie met 1,5 ms beeldvorming tijd. In beide gevallen is de 'hbin' instelling kan worden gebruikt als het verven van de neuronen is niet erg sterk. </li><li> Het licht wordt ingesteld zo laag mogelijk (dat wil zeggen de kleurstof in de neuronen moet nog steeds het genereren van voldoende fluorescentie voor de beeldvorming) om foto modulatie en foto beschadiging van de opgenomen neuronen te voorkomen. </li><li> De kamer verlichting en alle overige lichtbronnen zijn uitgeschakeld. Daarnaast kan een zwart gordijn worden gesloten rond de opname rig om blootstelling aan het licht van externe bronnen te voorkomen. </li><li> De beeldvorming sessies zijn ingesteld om te worden tussen de 4 - 16 seconden lang zijn. </li><li> De spontane activiteit van de geverfde neuronen wordt opgenomen over meerdere beeldvorming sessies. </li></ol> 5. Analyse van de Optical Imaging gegevens Voor het analyseren van de beeldgegevens gebruikten we de BVAna software (versie 10.08, SciMedia Ltd, Tokio, Japan) in verband met de Micam 02 imaging systeem. De software ondersteunt de visualisatie van de beeldgegevens en biedt een scala aan analyse-instrumenten ook. De stappen van de data-analyse en interpretatie zijn als volgt: <ol><li> Een geschikte cirkelvormig gebied van belang is geselecteerd op elke geregistreerde neuronen. Typisch gebruiken we 2 tot 3 pixels straal regio's van belang voor het onderzoek van neuronen in de 48 x 32 pixel resolutie, en 6 - 8 pixel radius regio's van belang voor het onderzoek van neuronen in 96 x 64 resolutie. </li><li> De temporele afvlakking van de gegevens die nodig kan zijn, vooral als de kleurstof relatief lage hoeveelheid fluorescentie (lage achtergrond waarde van de gegevens genereert, geeft aan dat dit, het kan te wijten zijn aan het lage lichtniveau dat wordt gebruikt of laag niveau kleurstof belasting, bijvoorbeeld in een neurieten van de opgenomen neuron). Meestal in zulke gevallen gebruiken we tijdelijk glad met 3 - 5 keer units. </li><li> In aanvulling op de optische opnames hebben we ook weer de extracellulaire door het selecteren van de analoge ingang van de imaging-systeem weer te geven. </li><li> De parameters voor de visualisatie van de optische gegevens en de analoge ingang moet correct zijn ingesteld om alle opnamen op de computer scherm te zien. </li><li> Gezien de optische opnames van de neuronen, de extracellulaire opname van de LVN, en de indeling van het neuron op basis van de eerdere intracellulaire opname, is het mogelijk om de identiteit van het neuron te bepalen en om haar activiteiten hebben betrekking op de neurale activiteiten opgenomen van de zenuw. </li><li> De verwachting is dat de optische opnamen laten duidelijk zien, en zonder de noodzaak van middeling over meerdere soortgelijke gebeurtenissen, de neurale activiteiten die overeenkomt met extracellulair opgenomen pieken en ook subthreshold evenementen zoals remmende postsynaptische potentialen veroorzaakt door de activiteit van andere neuronen. </li><li> De gegevens te exporteren functies van de BVAna software kan worden gebruikt om de optische opnames berekend voor de geselecteerde regio's van belang, maar ook de analoge input die de opname van de lvn bevat export. De geëxporteerde gegevens kunnen worden verwerkt en verder geanalyseerd met behulp van andere data-analyse software en (bijvoorbeeld in het eenvoudigste geval Microsoft Excel (Microsoft, Redmond, WA, Verenigde Staten) kan worden gebruikt voor extra visualisering en data-verwerking). </li></ol> 6. Representatieve resultaten Figuur 2 toont de gelijktijdige opname van twee neuronen (LP, laterale pylorus neuron, PD, pylorus dilatator neuron) in de pyloris centrale patroon generator van een krab STG samen met de opname van de LVN. De optische opnamen van de LP en de PD neuronen geïdentificeerd op basis van hun intracellulaire opnames laten zien dat inderdaad deze passen goed bij de extracellulaire opnames die overeenkomen met LP en PD neuronen. Er is een consistent 12 ms vertraging tussen de optische en lvn opnamen van spike pieken (zie kader van figuur 2) als gevolg van de axonale transmissie vertraging tussen het ganglion en de extracellulaire site. De gepresenteerde gegevens blijkt ook dat de neurale activiteit in het soma die overeenkomt met pieken van de opgenomen neuronen duidelijk opspoorbaar is. s/ftp_upload/2567/2567fig1.jpg "alt =" Afbeelding 1 "/&gt; Figuur 1. A) Schematische weergave van de stomatogastric zenuwstelsel (STNS). Cog, commissural ganglion, OG, slokdarm-ganglion, STG, stomatogastric ganglion, STN, stomatogastric zenuw, lvn, laterale ventrikel zenuw. B) De krab stomatogastric ganglion (STG) - de afbeelding ziet u de halfronde achterste plaatsing van STG neuronen. <img src="/files/ftp_upload/2567/2567fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Gelijktijdige single-sweep opname van een PD-en een LP neuron, samen met de opname van de LVN. De gegevens blijkt dat dat de optische zenuw en de opnames passen heel goed en dat we kunnen identificeren van de neurale activiteiten die overeenkomt met spikes opgenomen vormen de zenuw. De inzet toont een overlay van verschillende sweeps van LP actiepotentialen - zowel optisch als elektrisch opgenomen - en hun gemiddelde aantonen van de match tussen optisch en elektrisch opgenomen activiteiten. Te wijten aan het feit dat onze optische recording methode niet filteren van de lage frequentie componenten van de gegevens die we ook in staat om langzaam membraanpotentiaal veranderingen die kenmerkend zijn voor PD en LP neuronen 14 op te nemen.

<ol><li>Gutierrez, G. J., Grashow, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+borealis+stomatogastric+nervous+system+dissection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Cancer borealis stomatogastric nervous system dissection.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Bartos, M., Nusbaum, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intercircuit+control+of+motor+pattern+modulation+by+presynaptic+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Intercircuit control of motor pattern modulation by presynaptic inhibition.</a> J. Neurosci. 17, 2247-2256 (1997).</li>
<li>Blitz, D. M., Nusbaum, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+pattern+selection+via+inhibition+of+parallel+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Motor pattern selection via inhibition of parallel pathways.</a> J Neurosci. 17, 4965-4975 (1997).</li>
<li>Stein, W., Smarandache, C. R., Nickmann, M., Hedrich, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+consequences+of+activity-dependent+synaptic+enhancement+at+a+crustacean+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional consequences of activity-dependent synaptic enhancement at a crustacean neuromuscular junction.</a> J Exp Biol. 209, 1285-12300 (2006).</li>
<li>Loew, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potentiometric+dyes%3A+Imaging+electrical+activity+of+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Pure+%26+Appl+Chem%22%5BJournal%5D)">Potentiometric dyes: Imaging electrical activity of cell membranes.</a> Pure & Appl Chem. 68, 1405-1409 (1996).</li>
<li>Tominaga, T., Tominaga, Y., Yamada, H., Matsumoto, G., Ichikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+optical+signals+with+electrophysiological+signals+in+neural+activities+of+Di-4-ANEPPS+stained+rat+hippocampal+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Meth%22%5BJournal%5D)">Quantification of optical signals with electrophysiological signals in neural activities of Di-4-ANEPPS stained rat hippocampal slices.</a> J Neurosci Meth. 102, 11-23 (2000).</li>
<li>Heinzel, H. G., Weimann, J. M., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+behavioral+repertoire+of+the+gastric+mill+in+the+crab%2C+Cancer+pagurus%3A+an+in+situ+endoscopic+and+electrophysiological+examination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The behavioral repertoire of the gastric mill in the crab, Cancer pagurus: an in situ endoscopic and electrophysiological examination.</a> J Neurosci. 13, 1793-1803 (1993).</li>
<li>Zecevic, D., Wu, J. -Y., Cohen, L. B., London, J. A., Höpp, H. P., Falk, C. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hundreds+of+neurons+in+the+Aplysia+abdominal+ganglion+are+active+during+the+gill-withdrawal+reflex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Hundreds of neurons in the Aplysia abdominal ganglion are active during the gill-withdrawal reflex.</a> J Neurosci. 9, 3681-3689 (1989).</li>
<li>Briggman, K. L., Kristan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+dedicated+and+multifunctional+neural+circuits+generating+distinct+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Imaging dedicated and multifunctional neural circuits generating distinct behaviors.</a> J Neurosci. 26, 10925-10933 (2006).</li>
<li>Nusbaum, M. P., Beenhakker, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small-systems+approach+to+motor+pattern+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A small-systems approach to motor pattern generation.</a> Nature. 417, 343-350 (2002).</li>
<li>Marder, E., Bucher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+circuit+dynamics+using+the+stomatogastric+nervous+system+of+lobsters+and+crabs%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Understanding circuit dynamics using the stomatogastric nervous system of lobsters and crabs.</a> Ann Rev Physiol. 69, 291-316 (2007).</li>
<li>Grillner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+pattern+generation%3A+the+cellular+and+computational+logic+of+networks+in+motion%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Biological pattern generation: the cellular and computational logic of networks in motion.</a> Neuron. 52, 751-766 (2006).</li>
<li>Yuste, R., MacLean, J. N., Smith, J., Lansner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cortex+as+a+central+pattern+generator%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The cortex as a central pattern generator.</a> Nat Rev Neurosci. 6, 477-483 (2005).</li>
<li>Stein, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+stomatogastric+rhythms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Physiol+A%22%5BJournal%5D)">Modulation of stomatogastric rhythms.</a> J Comp Physiol A. 195, 989-1009 (2009).</li>
</ol>

De spanning gevoelige kleurstof beeldvorming 8,9 van de STG neuronen in combinatie met traditionele methodes elektrofysiologie (intra-en extracellulaire elektrode-opnames) kan een beter begrip van hoe dit kleine, bekende en nog steeds complexe neurale systeem werkt. De STG is een prototype van centrale patroon generator (CPG) neuronale netwerken (het omvat de pylorus en de maag molen ritme netwerken) 10,, 11, dus een beter begrip van de opkomende functionele eigenschappen van de STG zal ook helpen om te begrijpen hoe in het algemeen CPG netwerken genereren hun netwerkniveau functionaliteit. CPG netwerken spelen een cruciale rol in de motorische controle 12 en ook in de hogere cognitieve functies 13, dus ook de beter begrip van hun emergente eigenschappen kunnen een grote impact hebben op veel gebieden van de neurowetenschappen.

<table><tbody><tr><td>MiCAM02</td><td>SciMedia</td><td></td><td>Beeldvormingssysteem</td></tr><tr><td>BVAna v.10.08</td><td>SciMedia</td><td></td><td>Data-analyse software voor het MiCAM 02 beeldvormingssysteem</td></tr><tr><td>HL-151</td><td>Moritex, Tokyo, Japan</td><td></td><td>Halogeenlichtbron met ultralage rimpel</td></tr><tr><td>BX51 WI</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td>Rechte microscoop voor epifluorescentie-beeldvorming</td></tr><tr><td>20x beeldvormingsobjectief </td><td>Olympus Corporation</td><td>XLUMPLFL20XW/0.95</td><td>NA 0.95, WD 2.0mm</td></tr><tr><td>10x beeldvormingsobjectief </td><td>Olympus Corporation</td><td>UMPLFL10XW</td><td>NA 0.30, WD 3.3mm</td></tr><tr><td>Filterkubus met 480-550 nm excitatiefilter en 590nm emissiefilter </td><td>Olympus Corporation</td><td>MSWG2</td><td></td></tr><tr><td>Antivibratietafel</td><td>Scientifica Ltd</td><td>63-534</td><td></td></tr><tr><td>PatchStar elektrode-manipulator</td><td>Scientifica Ltd</td><td>PS-7000C</td><td>Micro-elektrode-manipulator</td></tr><tr><td>CED Power 1401</td><td>Cambridge Electronic Design</td><td></td><td>Data-acquisitiekaart</td></tr><tr><td>DL708E Oscilloscoop</td><td>Yokogawa</td><td></td><td>Intracellulaire versterker</td></tr><tr><td>AC differentiële versterker</td><td>University of Kaiserslautern, Germany</td><td></td><td>Extracellulaire versterker</td></tr><tr><td>P-97 Flaming &amp;#8211; Brown type elektrodetrekker</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td>Elektrodetrekker</td></tr><tr><td>Sigma Microcentrifuge 1-14</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Centrifuge</td></tr><tr><td>Genex Pipetteerders Mline</td><td>Scientific Laboratory Supplies LTD</td><td>PIP7774</td><td>PIP7774</td></tr><tr><td>Glazen micropipet met filament</td><td>Science Products</td><td>GB100TF 8P</td><td>Glas voor micro&amp;#8211;lektrodes</td></tr><tr><td>MicroFil &amp;#8211; 34G</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td></td><td>Microfil-naald</td></tr><tr><td>Spike 2 v6.10</td><td>Cambridge Electronic Design</td><td></td><td>Elektrofysiologie software</td></tr><tr><td>Di-8-ANEPPQ</td><td>Cambridge BioScience</td><td>BT61014</td><td>Fluorescente spanningsgevoelige kleurstof</td></tr><tr><td>F-127 Pluronic Acid, DMSO</td><td>Invitrogen</td><td>P-3000MP</td><td>Oplosmiddel</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td>Component voor krabsaline</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; . 2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3881</td><td>Component voor krabsaline</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td>Component voor krabsaline, elektrolytoplossing</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; . 6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td>Component voor krabsaline</td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>Component voor krabsaline</td></tr><tr><td>Maleïnezuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0375</td><td>Component voor krabsaline</td></tr><tr><td>Elastosil RT-601</td><td>Wacker, Munich, Germany</td><td></td><td>Voering van petrischalen</td></tr></tbody></table>

optische beeldvorming van neuronen in de krab stomatogastric ganglion met voltage-gevoelige kleurstoffen

Optical Imaging of Neurons in the Crab Stomatogastric Ganglion with Voltage-sensitive Dyes

Voltage-gevoelige kleurstof beeldvorming van neuronen is een belangrijke methode voor het begrijpen van hoe de neuronale netwerken zijn georganiseerd en hoe de gelijktijdige activiteit van de deelnemende neuronen leidt tot het ontstaan ​​van de integrale functionaliteit van het netwerk. Hier presenteren we de methodiek van toepassing van deze techniek om vastgestelde patronen genereren van neuronen in de krab stomatogastric ganglion. Tonen we het laden van deze neuronen met de tl-voltage-gevoelige kleurstof Di-8-ANEPPQ en laten we zien hoe het imago van de activiteit van neuronen kleurstof geladen met behulp van de MiCAM02 hoge snelheid en een hoge resolutie CCD-camera imaging-systeem. Tonen we de analyse van de geregistreerde beeldgegevens met behulp van de BVAna beeldbewerkingssoftware worden geassocieerd met het MiCAM02 imaging systeem. De gelijktijdige voltage-gevoelige kleurstof beeldvorming van de gedetailleerde activiteit van meerdere neuronen in de krab stomatogastric ganglion toegepast tezamen met de traditionele technieken elektrofysiologie (intracellulaire en extracellulaire registraties) opent totaal nieuwe mogelijkheden voor het begrijpen van hoe de centrale patroon generator neurale netwerken werken.

Hier presenteren we de methodologie voor een snelle en hoge resolutie tl-voltage-gevoelige kleurstof in beeld brengen van gedetailleerde activiteit van neuronen in de krab stomatogastric ganglion.

Optische beeldvorming van neuronen in de Krab Stomatogastric Ganglion met voltage-gevoelige kleurstoffen

Voltage-gevoelige kleurstofbeeldvorming van neuronen is een cruciale methodologie voor het begrijpen van hoe neurale netwerken zijn georganiseerd en hoe de gelijktijdige ...

Het doel van het volgende experiment is om spanningsgevoelige kleurstoffen te gebruiken om membraanpotentiaalveranderingen en synaptische interacties tussen neuronen in de centrale patroongeneratoren van het somatische asterisk-ganglion van de kreeft optisch vast te leggen. Dit wordt bereikt door geïdentificeerde neuronen te laden met DD 8 en APQ via ionoretische injectie met behulp van scherpe micro-elektroden en gelijktijdige extracellulaire registratie van de motorische zenuwactiviteit. Als tweede stap wordt de fluorescentie van de spanningsgevoelige kleurstof geëxciteerd door groen licht, wat de beeldvorming van fluorescentieveranderingen mogelijk maakt die overeenkomen met de veranderingen in de celmembraanpotentiaal. Vervolgens worden de beeldgegevens geanalyseerd door een regio van interesse in het membraan van het neuron te selecteren en het optische signaal te vergelijken met de geregistreerde extracellulaire spike-activiteit om actiepotentialen en synaptische potentialen te identificeren.In de resultaten van de image-neuronen blijkt dat de optische registratie van synaptisch interagerende patroongenererende neuronen traditionele registratietechnieken kan aanvullen en nieuwe mogelijkheden biedt voor het begrijpen van de werking van neurale netwerken van centrale patroongeneratoren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals extra- en intracellulaire registraties, is dat na dye-filling optische registraties van veranderingen in het membraanpotentiaal en synaptische interacties kunnen worden gerealiseerd zonder de sterische beperkingen die gepaard gaan met de plaatsing van elektroden en zonder verdere beschadiging van de neuronen tijdens langetermijnregistraties. Deze methode kan derhalve aanvullend inzicht bieden in patroongeneratie in het gastrische ganglion van de maag van kreeftachtigen.Het kan ook worden toegepast op andere systemen, zoals voortbeweging en ademhaling bij gewervelden. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, omdat de injectie en preparatie van de D-selectie moeilijk zijn en de parameters voor de analyse van de beeldgegevens adequaat moeten worden ingesteld om veranderingen in het membraanpotentiaal te detecteren. Begin de preparaties door de fluorescerende kleurstofoplossing in een plastic flacon te maken: meng vijf milligram van de fluorescerende spanningsgevoelige kleurstof D eight en FPQ met één milliliter F1 27 onic acid in DMSO-oplossing.Centrifuge vervolgens de opgeloste kleurstof 20 minuten bij 12.000 toeren per minuut. Om grotere D-deeltjes te scheiden die de micro-elektrode na centrifugatie kunnen verstoppen, is de gebruiker voorbereid om de bovenste 200 µL van het supernatant op te zuigen en het supernatant in een apart plastic vial over te brengen. Wikkel het vial in aluminiumfolie om blootstelling aan licht te voorkomen.Bewaar oplossing D op de dag van het experiment in een vriezer bij -20 °C. Ontdooi de kleurstofoplossing door het omwikkelde vials 10 tot 15 minuten in water van 25 °C te plaatsen. Ter voorbereiding op de opnames begint u met het isoleren van het somatische gastrische zenuwstelsel van de STS van een krab en het verwijderen van de schede van het somatische gastrische ganglion.Breng vaseline aan rond een gedeelte van de laterale ventriculaire zenuw of LVN om een elektrisch geïsoleerd compartiment te creëren. Gebruik boetseerklei om de Petrischaal aan het operationele platform van de beeldvormingsmicroscoop te bevestigen. Plaats een roestvrijstalen elektrodedraad in het vaselinecompartiment om opnames te maken van de LVN en plaats een andere roestvrijstalen elektrode in het bad als referentie-elektrode.Zodra de D-oplossing is ontdooid, wordt er voldoende van de D-oplossing opgezogen om ongeveer twee derde van een microfill-naald te vullen. Injecteer de D-oplossing vanuit de microfill-naald in de punt van een glazen micro-elektrode. Dek de met kleurstof gevulde elektrode af met een doos en wacht 15 minuten.Vul de micro-elektrode vervolgens aan met een drie molair kaliumchloride-oplossing. Plaats de micro-elektrode gedurende 10 tot 20 minuten terug in een donkere bewaardoos voor elektroden, zodat de capillaire werking de oplossing in de fijne punt van de elektrode kan trekken. Plaats de micro-elektrode na 10 tot 20 minuten in een elektrodehouder en bevestig deze aan de headstage van de intracellulaire versterker.De intracellulaire versterker is verbonden met de data-acquisitiekaart, die een pulssignaal levert om stroompulsen via de micro-elektrode aan te sturen. Stel vervolgens de micro-elektrode in onder een schuine hoek en positioneer de punt ervan boven het somatische gastrische ganglion. Laat het objectief van de microscoop zakken tot de punt van de elektrode in focus is.Laat vervolgens het objectief zakken, waarbij u er goed op let dat u stopt voordat u de micro-elektrode raakt. Laat daarna de micro-elektrode zakken tot deze opnieuw in beeld verschijnt. Door de voortgang op de oscilloscoop te monitoren in het brandpunt van het objectief, doorboort u voorzichtig het membraan van het geselecteerde neuron in de somatische gastrische ganglia.Vergelijk op dit punt de intracellulaire en extracellulaire geregistreerde actiepotentialen. Om het gepenetreerde neuron te identificeren, start u de injectie van kleurstof door de intracellulaire versterker in de stroominjectiemodus te schakelen en 10 nano positieve stroomstappen in de microelektrode te injecteren. De stroomstappen moeten één seconde duren, gescheiden door intervallen van één seconde zonder stroom.Zet deze injectie nog 30 minuten voort. Na 10 minuten kleurstofinjectie gebruikt u het MYCA zero two-beeldvormingssysteem om de verspreiding van de kleurstof binnen het neuron te controleren. Herhaal dit en controleer opnieuw na 30 minuten.Als de kleuring succesvol is, moet het gekleurde gebied rond de micro-elektrode groeien tussen de beelden van 10 minuten en 30 minuten. Trek de elektrode uit het neuron en laat het neuron ten minste 20 tot 30 minuten rusten, zodat de kleurstof zich verder in de cel kan verspreiden. Tijdens deze tijd kan een ander neuron met kleurstof worden geïnjecteerd.Schakel op het MYAM zero two beeldsysteem over naar het objectief met een transmissie-efficiëntie van 20 keer. Positioneer de objecttafel van de microscoop naar behoefte en stel scherp op het D-veld neuron. Voer de extracellulaire registratiedata via het analoge ingangskanaal in het beeldsysteem in.Schakel de kamerverlichting en alle overige lichtbronnen uit. Sluit daarnaast een zwart gordijn rondom de opstelling om lichtinval van externe bronnen te voorkomen. Stel het beeldvormingssysteem in op de juiste pixelresolutie en beeldvormingstijd zoals weergegeven in de tabel.Als de kleuring in de neuronen niet erg sterk is, gebruik dan de H-bin-instelling. Stel het lichtniveau van de microscoop zo laag mogelijk in om fotomodulatie en fotobeschadiging van de geregistreerde neuronen te voorkomen. Stel de beeldsessies in op een duur van vier tot 16 seconden.Registreer vervolgens de spontane activiteit van de DY-neuronen over meerdere imagingsessies. Om de analyse van de optische responsen met de BV A NA imaging-software te starten, selecteert u een geschikte cirkelvormige regio op elk geregistreerd neuron als temporele smoothing van de gegevens noodzakelijk is. Gebruik bijvoorbeeld de software om temporele smoothing met drie tot vijf tijdseenheden toe te passen als de D een relatief lage hoeveelheid fluorescentie genereert.De twee met kleurstof geïnjecteerde neuronen linksboven in deze figuur zijn geïdentificeerd als een PD-neuron en een LP-neuron op basis van hun intracellulaire opnames. De spanningssporen rechts daarvan tonen de spontane optische responsen van elk neuron. De extracellulaire opname van de LVN wordt onderaan de figuur weergegeven.De LP- en PD-neuronen maken deel uit van de pylorische centrale patroongenerator van een somatisch gastrisch ganglion van een krab en zijn wederzijds inhiberend. Hun optische registraties kunnen goed worden afgestemd op de extracellulaire registraties van de LVN. De inzet onderaan toont een overlay van verschillende sweeps van LP-actiepotentialen en hun gemiddelde, wat de overeenkomst tussen de optisch en elektrisch geregistreerde activiteiten aantoont.Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in anderhalf uur worden uitgevoerd mits deze correct wordt toegepast. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals immunokleuring, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals welk type synaps betrokken was bij het opwekken van de waargenomen veranderingen in het membraanpotentiaal. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u optisch metingen kunt verrichten van meerdere geïdentificeerde en met elkaar interagerende neuronen in de maagganglia.

optical-imaging-neurons-crab-stomatogastric-ganglion-with-voltage

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Dit protocol laat zien hoe voltage-gevoelige kleurstoffen optische registratie van de elektrische activiteit in staat stellen uit intacte neurale netwerken, zoals de plexuses van de cavia enterische zenuwstelsel, met een instelbare resolutie die varieert van enkele cellen om multi-ganglion circuit.

Optische opnemen van elektrische activiteit in Guinee-pig Enteric Netwerken met behulp van voltage-gevoelige kleurstoffen

This video demonstrates a procedure for observing changes in neuronal activity in a brain slice stained with a voltage-sensitive dye. The dye reflects changes in the neuron's membrane potential by altering its fluorescence intensity. Through the application of electrical stimuli and advanced imaging techniques, this process enables visual tracking of real-time changes in neuronal membrane potential based on VSD fluorescence.

Optical Recording of Neuronal Activity in Brain Slices Stained with a Voltage-Sensitive Dye

Source: Shannonhouse, J., et al.In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in Networks of Primary Sensory Neurons in Intact Dorsal Root Ganglia. J. Vis. Exp. (2023).The video demonstrates an in vivo calcium imaging technique to monitor neuronal activity in the dorsal root ganglia (DRG) of a transgenic mouse. DRG neurons express a calcium indicator that increases fluorescence intensity upon binding to calcium. Mechanical or thermal stimuli applied to a hind paw generate action potentials that...

In Vivo Calcium Imaging of Neuronal Ensembles in the Intact Dorsal Root Ganglia of a Mouse

Hier beschrijven we de dissectie van de abdominale zenuwstreng van rivierkreeft. We demonstreren ook een elektrofysiologische techniek om fictieve voortbeweging op te nemen vanuit zwembeenmotorneuronen.

De Swimmeret Systeem van rivierkreeftjes: Een praktische gids voor de dissectie van de Nerve Koord en extracellulaire Opnamen van de Motor van het Patroon

Het enterische zenuwstelsel (EZS) is een netwerk van neuronen en gliacellen in de darmwand dat intestinale reflexen controleert. Dit protocol beschrijft methoden voor het opnemen van de activiteit van enterische neuronen en gliacellen in levende bereidingen van EZS met behulp van Ca2+ beeldvorming.

In Situ Ca 2+ Beeldvorming van het enterische zenuwstelsel

Hier beschrijven we een methode voor het laden van een calciumgevoelige kleurstof door de kikker zenuwstomp in de zenuwuitgangen. We presenteren ook een protocol voor de opname en analyse van snelle calcium transiënten in de perifere zenuw eind.

Een calciumkleurstofverf in de zenuwlengte van de kikker laden door de zenuwstomp: Calcium Transient Registratie in de Kikker Neuromusculaire Junction

Dit protocol presenteert een methode voor het weergeven van neuronale populatieactiviteit met eencellige resolutie bij niet-transgene ongewervelde soorten met behulp van absorptiespanningsgevoelige kleurstoffen en een fotodiode array. Deze aanpak maakt een snelle workflow mogelijk, waarbij beeldvorming en analyse in één dag kunnen worden nagestreefd.

Op fotodiode gebaseerde optische beeldvorming voor het opnemen van netwerkdynamica met single-neuronresolutie in niet-transgene ongewervelde dieren

Hier presenteren we hoe we het geniculate ganglion van een levende, verdoofde laboratoriummuis kunnen blootleggen en hoe calciumbeeldvorming kan worden gebruikt om de reacties van ensembles van deze neuronen op smaakprikkels te meten, waardoor meerdere proeven met verschillende stimulerende middelen mogelijk zijn. Dit maakt diepgaande vergelijkingen mogelijk van welke neuronen op welke smaakstoffen reageren.

In vivo calciumbeeldvorming van muis geniculate ganglion neuron reacties op smaakprikkels

Dit protocol beschrijft de chirurgische blootstelling van het dorsale wortelganglion (DRG) gevolgd door GCaMP3 (genetisch gecodeerde Ca2 + indicator; Green Fluorescent Protein-Calmodulin-M13 Protein 3) Ca2+ beeldvorming van de neuronale ensembles met behulp van Pirt-GCaMP3-muizen tijdens het toepassen van een verscheidenheid aan stimuli op de ipsilaterale achterpoot.

In Vivo Calciumbeeldvorming van neuronale ensembles in netwerken van primaire sensorische neuronen in intacte dorsale wortelganglia

Genetisch gecodeerde calciumindicatoren (GECI) maken een robuuste analyse op populatieniveau van sensorische neuronsignalering mogelijk. Hier hebben we een nieuwe benadering ontwikkeld die in vivo GECI-visualisatie van de activiteit van trigeminusganglia-neuronen bij ratten mogelijk maakt.

In-vivo Calciumbeeldvorming van sensorische neuronen in het trigeminusganglion van de rat

Dit protocol beschrijft in vivo GCaMP-calciumbeeldvorming van intacte trigeminusganglion (TG)-neuronen. Deze beschrijving omvat TG-blootstellingschirurgie, in vivo confocale microscopiebeeldvorming van TG-neuronen, toepassing van somatische stimuli tijdens microscopische beeldvorming van TG-neuronen en analyse van in vivo GCaMP-calciumbeeldvormingsgegevens.

In vivo Calciumbeeldvorming van neuronale ensembles in netwerken van primaire sensorische neuronen in intacte trigeminusganglia

Leer optische beeldvorming van neuronen in de krab stomatogastrische ganglion met voltage-gevoelige kleurstoffen. Deze methode registreert membraanpotentiaalveranderingen en synaptische interacties zonder elektrodebeperkingen.

Optische beeldvorming van neuronen in de Krab Stomatogastric Ganglion met voltage-gevoelige kleurstoffen

Meer video's verkennen