Name: FISH voor Pre-implantatie genetische diagnostiek (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-23T18:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: Leer FISH voor pre-implantatie genetische diagnostiek van menselijke embryo's. Deze methode analyseert enkelvoudige cellen om chromosoomafwijkingen te detecteren en embryo-selectie te verbeteren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Lyseren en verspreiden van een kern van een biopsie blastomeer <ol><li> Cellysis buffer voor de verspreiding van cellen (0,2% Tween20 in 0,01 M HCl, pH 2,0) moeten worden voorbereid 24 uur van tevoren en opgeslagen bij -20 ° C. Bereiding van 100 ml en filter 20 ml in een 30 ml steriele universele container met behulp van een steriele 20 ml spuit en spuit filter. Verdeel 1 ml monsters in 10 tot 15 1,7 ml steriele microcentrifuge buizen, sluiten en het etiket de buizen voor het invriezen. Het wordt aanbevolen om twee verschillende partijen is het gebruik, de nieuwe partij en de vorige partij, die is getest en kan worden gebruikt als de nieuwe partij is onbevredigend zijn. </li><li> Ontdooi de lysis buffer op kamertemperatuur 30 minuten voor de biopsie procedure. Voor praktische doeleinden de werktemperatuur zal worden tussen kamertemperatuur en de hand temperatuur. </li><li> Scoren een kleine cirkel (ca. 5 mm diameter) aan de onderzijde van een amine-gecoate slide (bijv. Genetix) met behulp van een diamant pen en pre-label van de dia met het zaaknummer, unieke dianummer, en biopsie datum. Gebruik een aparte glijbaan voor elke blastomeer in numerieke volgorde, en label met de embryo-nummer. Dia's moeten worden geëtiketteerd met een hard potlood, zoals 4H, en "uitgedelgd" met een latex handschoen aan een grafiet stof te verwijderen. </li><li> Plaats een klein volume van lysis buffer binnen de cirkel. </li><li> Breng de biopsie blastomeer in de lysis buffer. Indien nodig lysis buffer toe te voegen in de cirkel totdat de cel begint te lyseren om, moet in de cel volledig lyseren en het cytoplasma verspreiden voordat de buffer droogt. </li><li> Let op de kern te zorgen dat het blijft binnen de cirkel en is niet verloren, als de cel niet beschikt over een kern of meerdere kernen, biopsie een andere cel. </li><li> Laat de schuif aan de lucht drogen bij kamertemperatuur. </li></ol> 2. In Situ Hybridisatie van een Single blastomeer Nucleus <ol><li> Bereid een ethanol-serie (70, 90 en 100%) uit in steriel gedistilleerd water. </li><li> Schakel en zet de hete blok (bv. Hybaid Omnislide of Vysis Hybrite) tot 75 ° C. </li><li> Ontdooi probes, vortex, en centrifuge. De reagentia moeten worden gezien en gecontroleerd om juist te zijn voordat de sonde mengsel. Pipette volumes zoals gespecificeerd door de fabrikant om de sonde mengsel in een 0,65 ml steriel microcentrifugebuis en vortex en centrifugeer voor gebruik. Het totale volume van de sonde mengsel moet voldoende zijn om 2 pl per kern worden getest en afgerond op de dichtstbijzijnde 10 pi tot een veiligheidsmarge mogelijk te maken. </li><li> Voorwas de dia's in Coplin potten met behulp van fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) (pH 7,0: 0,14 M NaCl, 3 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 2 mM KH 2 PO 4) gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Twee keer Spoel de dia's in steriel gedistilleerd water. </li><li> Uitdrogen van de dia's met de ethanol-serie (70, 90, en 100%) voor 2 min elk op kamertemperatuur en lucht drogen. Zorg ervoor dat dia's worden volledig ondergedompeld en eventuele grafiet stof drijft naar de oppervlakte, opzuigen met een schone tissue. </li><li> Noteer de positie van de kern binnen de cirkel door te visualiseren met een fase contrast microscoop. </li><li> Uitdrogen met 100% ethanol gedurende 2 minuten op kamertemperatuur en lucht drogen. </li><li> Breng 2 pi van de probe mengsel en dek af met een 9 x 9 mm dekglaasje (een kwart van een 18 x 18 mm dekglaasje no.1). </li><li> Sluit de randen van het dekglaasje met rubber cement (bijv. Cow Gum, Koe Proofing). </li><li> Codenature de dia's op een hete blok bij 75 ° C gedurende 5 min, en vervolgens hybridiseren de dia's 's nachts (16-20 uur) in een vochtige kamer bij 37 ° C. Sonde mixen die volledig bestaan ​​uit centromeer sondes (dwz voor sex-linked gevallen) geven een bevredigend resultaat na 60 minuten van hybridisatie. </li><li> Bereid een waterbad met voldoende Coplin potten en warmte tot 71 ° C. </li><li> Bereid een 0.4x standaard zoutoplossing citraat (SSC) stringente wassen oplossing (pH 7,0 bij 71 ° C, 0,06 M NaCl, 6 mM C 6 H 5 O 7 Na 3 .2 H 2 O) en warmte in het waterbad. </li><li> Doseer 50 ml stringente wassen per Coplin pot nodig is en controleer of de temperatuur is 71 ° C onmiddellijk voorafgaand aan het gebruik met een schone thermometer. </li><li> Verwijder voorzichtig het rubber cement van elke dia-en afspoelen van de dekglaasje met 4x SSC/0.05% Tween20 (pH 7,0) bij kamertemperatuur. </li><li> Was de dia's in de 0.4x SSC stringente wassen op 71 ° C gedurende 5 minuten. Was niet meer dan 6 dia's per Coplin pot. </li><li> Was de dia's in 4x SSC/0.05% Tween20 bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten. </li><li> Als de probe mix bevat indirect gelabelde probe (s), afvoer van de dia's van overtollige vloeistof en toe te passen 20 pi van fluorescent geconjugeerd antilichaam onder een 20 x 20 mm vierkant van Parafilm. </li><li> Incubeer in een vochtige kamer bij 37 ° C gedurende 15 minuten. </li><li> Verwijder de Parafilm en was een keer in 4x SSC/0.05% Tween20 bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten. </li><li> Was twee keer gedurende 2 minuten in PBS eent kamertemperatuur en afvoer van de dia's. </li><li> Van toepassing zijn 6 pl van DAPI / Vectashield (160 ng van 4 ',6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride in 1 ml Vectashield montage medium, Vector Laboratories) om een ​​22 x 22 mm geen. 0 dekglaasje en keer de glijbaan op het dekglaasje. </li><li> Blot en afdichting van de randen van het dekglaasje met duidelijke nagellak. </li></ol> 3. Analyse met behulp van een fluorescentiemicroscoop Geschikt uitgerust met geschikte filters voor de gebruikte Probes. <ol><li> Score signalen door directe visualisatie met behulp van een fluorescentie microscoop en een band-pass filters voor elke fluorochroom in de test. Elke kern moet worden gescoord door twee analisten. Een algemene richtlijn moet leiden tot scoren van een enkel signaal waar twee dicht bij elkaar gelegen signalen zijn minder dan een domein (signaal-breedte) uit elkaar, maar, oordeel gebaseerd op de ervaring moet worden uitgeoefend om signalen van variërende grootte, intensiteit, en scheiding interpreteren. </li><li> Gebruik imaging software (bijv. Isis, MetaSystems, Altlussheim, Duitsland; CytoVision, Genetix) om een ​​beeld van de kern voor de bevestiging van de visuele diagnose vast te leggen, en voor het imago van archivering als onderdeel van een laboratorium kwaliteitsborging plan. </li></ol> 4. Representatieve resultaten: Metafase en interfase kernen van gekweekte lymfocyten van perifeer bloed moet worden onderzocht om te bevestigen dat de geselecteerde probes specifiek zijn voor de translocatie chromosomen, informatief voor de breekpunten (de subtelomere sondes alleen hybridiseren met de translocatie segmenten en het centromeer probe (s) om de centraal segment (s)) en de signalen in interfase kernen moeten helder en discreet. Scoren is het aantal signalen voor elke probe in 100 interfase kernen van elke partner wordt aanbevolen om de efficiëntie van de test te beoordelen. In dit geval 2 signalen werden gescoord in 95% -99% van de kernen voor elke probe. Figuur 1 toont een metafase en interfase kern van een voorbereiding voor een wederzijdse translocatie tussen de korte armen van chromosomen 5 en 9. Signalen in de interfase kernen van embryo blastomeren moeten helder en discreet en scoorde met behulp van aparte band pass filters voor de gebruikte kleuren. Figuur 2 toont een blastomeer kern met een normaal signaal patroon (2 exemplaren voor alle geteste loci) in overeenstemming is met een normale of gebalanceerde chromosoom aanvulling op chromosoom 5 en 9, en een kern met een afwijkend signaal patroon in overeenstemming met een onevenwichtige product van de translocatie dat is monosomie (een exemplaar) voor de translocatie segment van chromosoom 5 en trisomie (3 exemplaren) voor de translocatie segment van chromosoom 9. <img src="/files/ftp_upload/2570/2570fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1 Een metafase te spreiden en een interfase kern bereid uit gekweekte perifere bloed lymfocyten uit een drager van een reciproke translocatie tussen de korte armen van chromosomen 5 en 9 met breakpoints op 5p14.3 en 9p24.1:. 46, XY, t (5 ; 9) (p14.3;. p24.1) ish t (5, 9) (5ptel48-, 9ptel30 +; 9ptel30-, 5ptel48 +, 9cen +). FISH probes werden geselecteerd voor zowel de translocatie segmenten (5p14.3 → 5pter, rode Cytocell subtelomere5ptel48 TexasRed; 9p24.1 → 9pter, groene Cytocell subtelomere 9ptel30 FITC) en het centraal deel van chromosoom 9 (9p24.1 → 9qter, blauwe Abbott CEP 9 alpha satelliet SpectrumAqua). <img src="/files/ftp_upload/2570/2570fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Signalen in interfase blastomeer kernen van dag 3 embryo's vastgelegd met een andere filter voor elke fluorochroom en samengevoegd tot een samengesteld beeld te vormen. (A) Twee signalen voor elke probe geeft twee kopieën van elk locus, die in overeenstemming is met een normale of uitgebalanceerde aanvulling op de translocatie chromosomen. (B) Een rood sein, drie groene signalen en twee blauwe signalen van een exemplaar van de translocatie segment van chromosoom 5, drie exemplaren van de translocatie segment van chromosoom 9 en twee exemplaren van de centrische segment van chromosoom 9, die consistent is met de aangrenzende -1 segregatie van de translocatie wat resulteert in een onevenwichtige product met monosomie voor 5p14.3 → 5pter en trisomie voor 9p24.1 → 9pter.

<ol><li>Scriven, P. N., Handyside, A. H., Ogilvie, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+translocations%3A+segregation+modes+and+strategies+for+preimplantation+genetic+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Prenat.+Diagn%22%5BJournal%5D)">Chromosome translocations: segregation modes and strategies for preimplantation genetic diagnosis.</a> Prenat. Diagn. 18, 1437-1449 (1998).</li>
<li>Harper, J. C. Preimplantation genetic diagnosis for chromosome rearrangements. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMackie+Ogilvie%2C+C+%22Preimplantation+Genetic+Diagnosis%22">Preimplantation Genetic Diagnosis</a>. , 2nd Ed, Cambridge University Press. 194-201 (2009).</li>
<li>Harper, J. C., Coonen, E., Ramaekers, F. C. S., Delhanty, J. D. A., Handyside, A. H., Winston, R. M. L., Hopman, A. H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+sex+of+human+preimplantation+embryos+in+two+hours+using+an+improved+spreading+method+and+fluorescent+in+situ+hybridisation+using+directly+labelled+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Identification of the sex of human preimplantation embryos in two hours using an improved spreading method and fluorescent in situ hybridisation using directly labelled probes.</a> Hum. Reprod. 9, 721-724 (1994).</li>
<li>Harper, J. C. Preimplantation genetic diagnosis for sex-linked diseases and sex-selection for non-medical reasons. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMackie+Ogilvie%2C+C+%22Preimplantation+Genetic+Diagnosis%22">Preimplantation Genetic Diagnosis</a>. , 2nd Ed, Cambridge University Press. 230-235 (2009).</li>
<li>Munné, S., Lee, A., Rosenwaks, Z., Grifo, J., Cohen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+major+chromosome+aneuploidies+in+human+preimplantation+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of major chromosome aneuploidies in human preimplantation embryos.</a> Hum. Reprod. 8, 2185-2192 (1993).</li>
<li>Harper, J. C. Preimplantation genetic diagnosis for infertility (preimplantation genetic screening). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMackie+Ogilvie%2C+C+%22Preimplantation+Genetic+Diagnosis%22">Preimplantation Genetic Diagnosis</a>. , 2nd Ed, Cambridge University Press. 203-229 (2009).</li>
<li>Scriven, P. N., Bossuyt, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+accuracy%3A+theoretical+models+for+preimplantation+genetic+testing+of+a+single+nucleus+using+the+fluorescence+in+situ+hybridization+technique.+Hum+Reprod%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenetics%22%5BJournal%5D)">Diagnostic accuracy: theoretical models for preimplantation genetic testing of a single nucleus using the fluorescence in situ hybridization technique. Hum Reprod.</a> Cytogenetics. 5, 394-400 (2010).</li>
<li>Coonen, E., Dumoulin, J. C., Ramaekers, F. C., Hopman, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+preparation+of+preimplantation+embryo+interphase+nuclei+for+analysis+by+fluorescence+in-situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Optimal preparation of preimplantation embryo interphase nuclei for analysis by fluorescence in-situ hybridization.</a> Hum. Reprod. 9, 533-537 (1994).</li>
<li>Dozortsev, D. I., McGinnis, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+fixation+technique+for+fluorescence+in+situ+hybridization+for+preimplantation+genetic+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil.+Steril%22%5BJournal%5D)">An improved fixation technique for fluorescence in situ hybridization for preimplantation genetic diagnosis.</a> Fertil. Steril. 76, 186-188 (2001).</li>
<li>Hsu, L. Y., Benn, P. A., Tannenbaum, H. L., Perlis, T., Carlson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+polymorphisms+of+1%2C+9%2C+16%2C+and+Y+in+4+major+ethnic+groups%3A+a+large+prenatal+study%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Med.+Genet%22%5BJournal%5D)">Chromosomal polymorphisms of 1, 9, 16, and Y in 4 major ethnic groups: a large prenatal study.</a> Am. J. Med. Genet. 26, 95-101 (1987).</li>
<li>Shim, S. H., Pan, A., Huang, X. L., Tonk, V. S., Varma, S. K., Milunsky, J. M., Wyandt, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FISH+variants+with+D15Z1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Assoc.+Genet.+Technol%22%5BJournal%5D)">FISH variants with D15Z1.</a> J. Assoc. Genet. Technol. 29, 146-151 (2003).</li>
<li>Knight, S. J., Flint, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfect+endings%3A+a+review+of+subtelomeric+probes+and+their+use+in+clinical+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Genet%22%5BJournal%5D)">Perfect endings: a review of subtelomeric probes and their use in clinical diagnosis.</a> J. Med. Genet. 37, 401-409 (2000).</li>
<li>Thornhill, A. R., de Die-Smulders, C. E., Geraedts, J. P., Harper, J. C., Harton, G. L., Lavery, S. A., Moutou, C., Robinson, M. D., Schmutzler, A. G., Scriven, P. N., Sermon, K. D., Wilton, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ESHRE+PGD+Consortium+%28PGS%29+ESHRE+PGD+Consortium+%27Best+practice+guidelines+for+clinical+preimplantation+genetic+diagnosis+%28PGD%29+and+preimplantation+genetic+screening+%28PGS%29%27%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">ESHRE PGD Consortium (PGS) ESHRE PGD Consortium 'Best practice guidelines for clinical preimplantation genetic diagnosis (PGD) and preimplantation genetic screening (PGS)'.</a> Hum. Reprod. 20, 35-48 (2005).</li>
<li>Munné, S., Wells, D., Cohen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technology+requirements+for+preimplantation+genetic+diagnosis+to+improve+assisted+reproduction+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil.+Steril%22%5BJournal%5D)">Technology requirements for preimplantation genetic diagnosis to improve assisted reproduction outcomes.</a> Fertil. Steril. 94, 408-430 (2010).</li>
<li>Wilton, L., Williamson, R., McBain, J., Edgar, D., Voullaire, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Birth+of+a+healthy+infant+after+preimplantation+confirmation+of+euploidy+by+comparative+genomic+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Birth of a healthy infant after preimplantation confirmation of euploidy by comparative genomic hybridization.</a> N. Engl. J. Med. 345, 1537-1541 (2001).</li>
<li>Wells, D., Alfarawati, S., Fragouli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+comprehensive+chromosomal+screening+for+embryo+assessment%3A+microarrays+and+CGH%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Use of comprehensive chromosomal screening for embryo assessment: microarrays and CGH.</a> Mol. Hum. Reprod. 14, 703-710 (2008).</li>
<li>Handyside, A. H., Harton, G. L., Mariani, B., Thornhill, A. R., Affara, N., Shaw, M. A., Griffin, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Karyomapping%2C+a+universal+method+for+genome+wide+analysis+of+genetic+disease+based+on+mapping+crossovers+between+parental+haplotypes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Genet%22%5BJournal%5D)">Karyomapping, a universal method for genome wide analysis of genetic disease based on mapping crossovers between parental haplotypes.</a> J. Med. Genet. 47, 651-658 (2010).</li>
</ol>

De toepassing van fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) tot een enkele embryo cel (blastomeer) presenteert speciale uitdagingen, zowel in praktische en in de vertolking van het signaal patroon. De gebiopteerd cel dienen te worden gemaakt binnen een vooraf bepaald gebied op de dia om zijn lokalisatie volgende vissen te vergemakkelijken; uiterste zorg moet worden genomen om ervoor te zorgen dat de cel is gelyseerd, dat het cytoplasma is verspreid, en dat de kern is zichtbaar en intact, en, als de diagnose is afhankelijk van de resultaten van deze enkele cel, strenge scoring en interpretatie richtlijnen moeten worden toegepast. Echter, in ervaren handen, FISH is een robuuste techniek voor pre-implantatie genetische diagnose (PGD) in de klinische praktijk. Het principe van PGD door FISH is die zich richten op specifieke DNA-probes gelabeld met verschillende fluorochromen of haptenen kan worden gebruikt om het aantal kopieën van specifieke loci detecteren, en daarmee op te sporen chromosoom onbalans in verband met de meiose scheiding van chromosoom herschikkingen (1), inclusief Robertsoniaanse translocaties, wederzijdse translocaties, inversies, en complexe herschikkingen (2). FISH kan ook worden gebruikt om de vrouwelijke embryo&#39;s in gezinnen te selecteren met de X-gebonden aandoening, waarvoor er geen mutatie-specifieke test (3, 4). Meer controversieel is FISH ook gebruikt om te screenen op sporadische chromosoom aneuploidie om te proberen en het verbeteren van de efficiëntie van geassisteerde reproductie (5, 6), maar de voorspellende waarde van deze test gebruik van FSIH waarschijnlijk onaanvaardbaar laag in de meeste mensen handen en het wordt niet aanbevolen voor routine klinisch gebruik (7). Dit artikel concentreert zich op de technische aspecten en de beperkingen van de FISH toegepast op klinische eencellige diagnose. Methoden van verspreiding en de vaststelling single blastomeren omvatten methanol / azijnzuur (5, 8), Tween / HCl (9), en een combinatie van Tween / HCl en methanol / azijnzuur (10). Variaties zijn hypotone behandeling van cellen voorafgaand aan de verspreiding en / of pepsine en paraformaldehyde behandeling na fixatie. De methode moet op passende wijze worden gevalideerd voor het laboratorium (14). De Tween / HCl methode wordt in detail beschreven in dit artikel. De Tween / HCl methode is technisch eenvoudig en zeer reproduceerbaar in verschillende laboratoria. Deze methode kan gebruikt worden om enkele kernen voor te bereiden op de FISH diagnose van geslachtsbepaling en chromosoom herschikkingen met aanvaardbare diagnostische nauwkeurigheid (7). Probe mixen kunt combineren direct gelabeld en indirect gelabelde probes, en probes van verschillende fabrikanten. Probes voor bekende polymorfe chromosoom regio&#39;s (11, 12), of die waarvan bekend is dat cross-hybridiseren met andere chromosomen (13) moet worden vermeden, maar kan worden gebruikt als aangetoond dat specifieke en geschikt te zijn voor PGD vooraf testen op zowel de reproductieve partners . Beschikbaar fluorochromen / haptenen en strategieën voor de veeleisende probes omvatten het volgende: Texas Red (TR), fluoresceïne isothiocyanaat (FITC), SpectrumGreen (Vysis), SpectrumOrange (Vysis), SpectrumAqua, gebiotinyleerd sondes gedetecteerd met TR-avidine, FITC-avidine, of Cy-5 streptavidine (gevisualiseerd met behulp van een FarRed filter), een mix van rood en groen sondes naar een geel signaal, een tweede ronde van hybridisatie en een derde kleur gemaakt door opeenvolgende vastleggen van SpectrumOrange met behulp van een TexasRed en een SpectrumGold filter) te produceren. Een sonde set met drie probes, specifiek voor de centromeer regio&#39;s van de X-en Y-chromosomen en een autosoom, wordt aanbevolen voor geslachtsbepaling (14); de autosomaal sonde wordt gebruikt voor het ploïdie en daarmee vast te stellen onderscheid te maken tussen trisomie X (2n, 47 , XXX) en triploïdie (3n, 69, XXX), en tussen tetrasomy X (48, XXXX) en tetraploidy (4n, 92, XXXX). Een typische probe set toegepast bij deze instelling is de Abbott AneuVysion mix die alfa-satelliet X, Y, en 18, dit probe set is aangetoond een zeer laag tarief polymorfisme hebben, en dus voorbehandeling work-up van de reproductieve partners is niet vereist (14). De probe mix voor een specifieke omlegging moet: het ideale geval bevatten probes ten minste voldoende zijn om alle verwachte producten van de omlegging met chromosoom onbalans op te sporen. Indien dit niet mogelijk is, sonde mixen waar het onopgemerkt onevenwichtige producten zijn beoordeeld aan niet-levensvatbaar zijn in een herkenbare zwangerschap en hebben waarschijnlijk een zeer lage prevalentie aanvaardbaar kan zijn (14). Worden getest op gekweekte lymfocyten metafasen van beide reproductieve partners. Minstens tien metafase verspreidt moet worden onderzocht voor de sonde specificiteit, polymorfismen en cross-hybridisatie, en, voor de omlegging chromosoom drager, om ervoor te zorgen dat de sondes zoals verwacht op de verschillende segmenten van de herschikking hybridiseren. Daarnaast moet ten minste 100 interfase kernen van deze voorbereidingen worden gescoord om aan te geven specificiteit, de helderheid en discretie (14) te beoordelen. Commercial PGS probe sets zijn beschikbaar (bijv. Abbott MultiVysion PB of PGT), gericht op de chromosomen meest voorkomende te zijn aneuploïde in producten van de bevruchting, bestaande uit een sonde per chromosoom gericht. Typisch de kern kan een tweede hybridisatie met probes voor extra chromosomen die een test voor chromosomen 13, 15, 16, 18, 21, 22 en XY (14). De voorspellende waarde van deze test met de verspreiding en FISH techniek hier beschreven is het waarschijnlijk onaanvaardbaar laag zijn in de meeste mensen de handen en het wordt niet aanbevolen voor routine klinisch gebruik (7, 15). Technieken zoals vergelijkende genomische hybridisatie (CGH) toegepast op enkele cellen zijn in staat om te testen voor het aantal kopieën van elk chromosoom (Wilton et al.. 2001), en het gebruik van single nucleotide polymorfismen (SNP) arrays en kwantitatieve analyse (Wells et al. . 2008) of &quot;karyomapping&quot; genotypering (Handyside et al.. 2009) zijn veelbelovende alternatieve technieken op chromosoom aneuploidie te detecteren. Echter, de resolutie te beperken en nauwkeurigheid voor het segment onbalans blijft onzeker en het is waarschijnlijk dat FISH zal blijven om de techniek van de keuze voor chromosoom herschikkingen met kleine segmenten.

<table><tbody><tr><td>Zoutzuur, 2,5 L</td><td>VWR international</td><td>101254H</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchloride, 5 kg</td><td>VWR international</td><td>443827W</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchloride, 250 g</td><td>VWR international</td><td>26764.232</td><td></td></tr><tr><td>watervrij dinatriumwaterstoffosfaat, 500g</td><td>VWR International</td><td>102494C</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumdihydrogenorthofosfaat, 500 g</td><td>VWR international</td><td>10203 4B</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxidepellets, 500 g</td><td>VWR international</td><td>28245.265</td><td></td></tr><tr><td>Tween20, 500 mL</td><td>VWR international</td><td>663684B</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, 2,5 L</td><td>VWR international</td><td>8.18760.2500</td><td>Rechten betaald</td></tr><tr><td>Trinatriumcitraat, 5 kg</td><td>VWR international</td><td>27833.363</td><td></td></tr><tr><td>Cow Gum, 250 mL</td><td>Cow Proofings Ltd.</td><td>Niet langer beschikbaar</td><td>Oude voorraden kunnen nog steeds worden gevonden in kunstenaarsbenodigdhedenwinkels</td></tr><tr><td>DAPI/Antifade ES, 0,125&amp;mu;g/mL, 500 µl</td><td>Cytocell Ltd.</td><td>DES500L</td><td>150&amp;#x03BC;flacon rec.&amp;rsquo;meegeleverd bij elke Cytocell TEL-probe</td></tr><tr><td>Nagellak, 12 mL</td><td>Schoenen (laarzen)</td><td>10088316001</td><td></td></tr><tr><td>Amine-gecoate objectglazen, 25</td><td>Genetix</td><td>K2615</td><td></td></tr><tr><td>DAPI, 0,1 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-9542</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield, 10 mL</td><td>Vector Laboratories</td><td>H1000</td><td></td></tr><tr><td>Texas-Red-avidine, 0,001 mL</td><td>Vector Laboratories</td><td>A-2016</td><td></td></tr><tr><td>FITC-avidine, 0,001 mL</td><td>Vector Laboratories</td><td>A-2011</td><td></td></tr><tr><td>Cy-5 Streptavidine, 0,001 ml</td><td>GE Healthcare</td><td>PA45001</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifugebuisjes, 1,75 ml, doos van 500</td><td>Thistle Scientific</td><td>AX-MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifugebuisjes, 0,6 ml, doos van 1000 stuks</td><td>Thistle Scientific</td><td>AX-MCT-060-C-CS</td><td></td></tr><tr><td>30 ml universele containers, doos van 400 stuks</td><td>Steriline</td><td>128B</td><td>Beschikbaar via NHS Supply Chain, cat. nr. KCP053</td></tr><tr><td>Verwarmingsblok</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spiritusbrander Spiritusbranderhouder Spiritusbranderpit</td><td>VWR international</td><td>451-0107 451-3112 451-3111</td><td></td></tr><tr><td>Glazen pipetten met stop</td><td>Fisher Scientific</td><td>PMK-300-052R</td><td></td></tr><tr><td>Dissectiemicroscoop</td><td>Wild Heerbrugg</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Papierzakdoekjes, 100 dozen</td><td>NHS SUPPLY CHAIN</td><td>MJT058</td><td></td></tr><tr><td>Metalen kweekschalen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastic melamine dienbladen</td><td>VWR international</td><td>682-009</td><td></td></tr><tr><td>Oven</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mondstuk voor mondpipetteren</td><td>Scientific Laboratory Supplies LTD</td><td>HAE3700</td><td></td></tr><tr><td>Slangen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spuitfilter, 0,2 µm&amp;mu;m poriegrootte, 25 mm diameter</td><td>Fisher Scientific</td><td>FDM-340-010U</td><td></td></tr><tr><td>Diamantpen</td><td>VWR International</td><td>818-0021</td><td></td></tr><tr><td>Hitteblok voor objectglazen</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>HBOSBB</td><td></td></tr><tr><td>Hybridisatiekamer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Weefselrol</td><td>NHS SUPPLY CHAIN</td><td>MJT004</td><td></td></tr><tr><td>Schieferdecker-pot</td><td>VWR International</td><td>631-9313</td><td></td></tr><tr><td>Coplin-pot</td><td>VWR international</td><td>631-9331</td><td></td></tr><tr><td>Pincet, fijn</td><td>VWR international</td><td>232-2123</td><td></td></tr><tr><td>Stompe pincet</td><td>VWR international</td><td>232-2113</td><td></td></tr><tr><td>Beaker van 1000 mL</td><td>VWR international</td><td>213-1642</td><td></td></tr><tr><td>Fasecontrastmicroscoop</td><td>Nikon Instruments</td><td>E200</td><td></td></tr><tr><td>Vezelvrije blotkaarten, doos van 100 stuks</td><td>Fisher Scientific</td><td>SDE1</td><td></td></tr><tr><td>Blauw gematteerde microscopische objectglazen, doos van 100 stuks</td><td>Scientific Laboratory Supplies LTD</td><td>MIC3022</td><td></td></tr><tr><td>Dekglasjes, 18x18 mm, nr. 1, doos van 200 stuks</td><td>Scientific Laboratory Supplies LTD</td><td>MIC3110</td><td></td></tr><tr><td> Dekglasjes, 22x22 mm, nr. 0, doos van 200</td><td>Scientific Laboratory Supplies LTD</td><td>MIC3104</td><td></td></tr><tr><td>Dekglasjes, 22x50 mm, nr. 0, doos van 100 stuks</td><td>Scientific Laboratory Supplies LTD</td><td>MIC3206</td><td></td></tr><tr><td>1 mL spuit, doos van 100</td><td>NHS Supply Chain</td><td>FWC045</td><td></td></tr><tr><td>1 mL pipetpunt, 10 rekken van 1000</td><td>Thistle Scientific</td><td>AX-T-1000-C-L-R</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>LEEC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Waterbad</td><td>Grant-apparatuur</td><td>W22</td><td></td></tr><tr><td>Alcoholthermometer</td><td></td><td></td><td>Verschillende beschikbare bronnen</td></tr><tr><td>pH-meter</td><td>Jenway</td><td>3305</td><td></td></tr><tr><td>pH-elektrode</td><td>VWR international</td><td>662-1759</td><td>BNC-stekker passend voor Jenway pH-meter 3305</td></tr><tr><td>Verwarmde magneetroerder</td><td>Bibby</td><td>HC502</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Pasteur-pipetten, doos van 500 stuks</td><td>Scientific Laboratory Supplies LTD</td><td>PIP4202</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm, 50 mm x 75 m</td><td>VWR international</td><td>291-1214</td><td></td></tr></tbody></table>

fish voor pre-implantatie genetische diagnostiek

FISH for Pre-implantation Genetic Diagnosis 

Pre-implantatie genetische diagnostiek (PGD) is een gevestigde alternatief voor prenatale diagnose, en het gaat om het selecteren van pre-implantatie embryo&#39;s van een cohort gegenereerd door geassisteerde reproductie technologie (ART). Deze selectie kan nodig zijn omdat de familiale monogene ziekte (bijvoorbeeld cystic fibrosis), of omdat een partner draagt ​​een chromosoom herschikking (bijvoorbeeld een twee-weg wederzijdse translocatie). PGD ​​is beschikbaar voor koppels die hebben gehad vorige getroffen kinderen, en / of in het geval van chromosoom herschikkingen, terugkerende miskramen of onvruchtbaarheid. Eicellen geaspireerd na ovariële stimulatie worden bevrucht door in vitro onderdompeling in sperma (IVF) of intracytoplasmatische injectie van door een individuele zaadcel (ICSI). Pre-implantatie decollete-stadium embryo&#39;s worden gebiopteerd, meestal door het verwijderen van een enkele cel op dag 3 na de bevruchting, en de biopsie cel is getest op de genetische status van het embryo vast te stellen. Fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) op het vaste kernen van biopsie cellen met target-specifieke DNA-probes is de techniek bij uitstek om chromosoom onbalans geassocieerd met chromosoom herschikkingen te sporen, en aan vrouwelijke embryo&#39;s in gezinnen te selecteren met de X-gebonden aandoening waarvoor geen mutatie-specifieke test. FISH is ook gebruikt om te screenen van embryo&#39;s voor spontane chromosoom aneuploïdie (ook bekend als PGS of PGD-AS) om te proberen en het verbeteren van de efficiëntie van de geassisteerde voortplanting, maar de voorspellende waarde van deze test met de verspreiding en FISH techniek hier beschreven waarschijnlijk onaanvaardbaar laag zijn in de meeste mensen de handen en het wordt niet aanbevolen voor routine klinisch gebruik. We beschrijven de selectie van geschikte probes voor single-cell FISH, het verspreiden van technieken voor blastomeer kernen, en in situ hybridisatie en signaal scoren, toegepast op PGD in een klinische setting.

Dit artikel beschrijft de selectie van geschikte probes voor single-cell FISH, het verspreiden van technieken voor blastomeer kernen, en in situ hybridisatie en signaal scoren, toegepast op de pre-implantatie genetische diagnose (PGD) in een klinische setting.

FISH voor Pre-implantatie genetische diagnostiek

Pre-implantatie genetische diagnostiek (PGD) is een gevestigd alternatief voor prenatale diagnostiek en houdt in dat pre-implantatie embryo's worden geselecteerd uit een ...

Het doel van deze procedure is om de fluorescentie in situ hybridisatietechniek te gebruiken om de status van de geslachtschromosomen of translocaties te bepalen bij in vitro menselijke embryo's met een risico op genetische abnormaliteiten. Dit wordt bereikt door een enkele cel, gebiopsieerd uit een embryo van drie dagen, op een glazen objectglas te lyseren en de kern aan de lucht te laten drogen. De tweede stap is om het DNA van de doelkern te denatureren en te hybridiseren met DNA-probes die zijn gelabeld met fluorochromen van verschillende kleuren.Vervolgens wordt het overschot aan probe verwijderd met een stringente wasbeurt en wordt de nucleus gekleurd met een DNA-specifieke fluorescente kleurstof. De laatste stap is het bekijken van de nucleus met een fluorescentiemicroscoop en het vastleggen van digitale beelden. Uiteindelijk kunnen er resultaten worden verkregen die het kopieaantal van de targeted chromosoomregio's laten zien via fluorescentiemicroscopie.Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze techniek moeite hebben, omdat deze zich op de uiterste grens van de fluorescentie in situ hybridisatietechniek bevindt. Bereid 24 uur van tevoren de cellysebuffer voor het uitspreiden van cellen voor. Filtreer de oplossing en verdeel aliquots van 1 milliliter over 10 tot 15 steriele microcentrifugebuisjes van 1,7 milliliter; sluit de buisjes en label deze voordat ze vlak voor de biopsieprocedure worden ingevroren bij -20 °C.Ontdooi de lysisbuffer bij kamertemperatuur. Kras met een diamantpen een kleine cirkel van ongeveer vijf millimeter in diameter aan de onderzijde van een amine-gecoate slide, en label de slide vervolgens met een hard 4H-potlood als BLO terwijl u een latex handschoen draagt. Gebruik om eventueel grafietstof te verwijderen een aparte slide voor elke blasterspiegel in numerieke volgorde.Plaats nu een klein volume lysisbuffer binnen de cirkel. Verplaats de biopsy blaster naar de lysisbuffer. Voeg indien nodig meer lysisbuffer toe om de cel te lyseren.Observeer de kern om er zeker van te zijn dat deze binnen de cirkel blijft en niet verloren gaat. Als de cel geen kern heeft of meerdere kernen heeft, neem dan een biopsie van een andere cel. Laat het preparaat aan de lucht drogen bij kamertemperatuur.Was de monsters eerst voor in coplan-potjes met fosfaatgebufferde zoutoplossing gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Spoel ze vervolgens twee keer met steriel gedestilleerd water, dehydrateer ze met een ethanolserie gedurende telkens twee minuten bij kamertemperatuur en laat ze aan de lucht drogen. Zorg dat de plaatjes volledig ondergedompeld zijn en absorbeer eventueel grafietstof dat naar het oppervlak drijft met een schoon papieren tissuesdoekje.Leg de positie van de nucleus binnen de cirkel vast door middel van visualisatie met een fasecontrastmicroscoop. Dehydrateer vervolgens de monsters met 100% ethanol gedurende twee minuten bij kamertemperatuur en laat ze aan de lucht drogen. Breng nu twee µL van het probemengsel aan en dek dit af met een dekglas van negen bij negen millimeter.Zegel de randen van het dekglas met rubbercement. Voer de codering van de naturisatie uit. Plaats elke koppelingspot vijf minuten op een warmteblok bij 75 °C en hybridiseer vervolgens gedurende de nacht in een bevochtigde kamer bij 37 °C.Equilibreer 50 milliliter van een 0,4× SSC stringente wasoplossing in een waterbad van 71 °C. Plaats de fles met stringente wasoplossing en de lege koppelpot in het waterbad op kamertemperatuur, verwarm deze tot 71 °C, stel de pH van de stringente wasoplossing in en giet deze over in Cochin-potten. Verwijder vervolgens voorzichtig de rubbercement van elke slide en spoel het dekglas af met 4× SSC 0,05% Tween 20 bij pH 7 op kamertemperatuur.Was de monsters in de 0,4 keer SSC stringente wasstap bij 71 °C gedurende vijf minuten, gevolgd door vier keer SSC met 0,05% Tween 20 bij kamertemperatuur gedurende twee minuten. Voor indirect gelabelde probes wordt het overtollige vocht van de slides afgegoten, waarna 20 µL fluorescent geconjugeerd antilichaam wordt aangebracht onder een paraformvierkant van 20 bij 20 mm. Incubeer in een bevochtigde kamer bij 37 °C gedurende 15 minuten.Verwijder de parafilm en voer de volgende wasstappen uit bij kamertemperatuur gedurende twee minuten. Eén keer in 4× SSC met 0,05% Tween 20 en twee keer gedurende twee minuten in PBS. Nadat de slides zijn leeggelopen, brengt u zes µL Vector Shield monteermedium met DPI aan op een 22 bij 22 millimeter.Gebruik een dekglas van nummer nul en keer de slide om over het dekglas. Blot het dekglas en verzegel de randen van het dekglas met transparante nagellak. Analyseer tot slot de monsters via fluorescentiemicroscopie.Laat elke kern scoren door twee onafhankelijke analisten. Gebruik daarnaast imaging-software om een afbeelding van de kern vast te leggen ter bevestiging van de visuele diagnose en voor archivering van afbeeldingen als onderdeel van de kwaliteitsborging van het laboratorium. Hier tonen een metafaseplaatje en een interfasekern, geprepareerd uit perifere bloedlymfocyten, een drager van een reciproque translocatie tussen de korte armen van chromosoom vijf en negen, met breekpunten op 5p14.3 en 9p24.1.FISH-probes lichten zowel de getransloceerde segmenten als het centrische segment van chromosoom 9-signalen op. In interfase blastomeerkernen van dag drie kunnen embryo's worden vastgelegd en vervolgens worden samengevoegd tot een compositiebeeld. Twee signalen voor elke probe duiden op twee kopieën van elke locus, wat consistent is met een normaal of gebalanceerd complement.Voor de translocatiechromosomen geven de gekleurde signalen één kopie van het getransloceerde segment van chromosoom 5 aan, drie kopieën van het getransloceerde segment van chromosoom 9 en twee kopieën van het centrische segment van chromosoom 9. Deze gegevens zijn consistent met een ongebalanceerd product van monosomie voor 5p14.3 tot 5pt en trisomie voor 9p24.1 tot 9pt. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe een enkele cel, gebiopsieerd uit een menselijk embryo, geanalyseerd kan worden en hoe een enkele nucleus kan worden geprepareerd met behulp van de fluorescentie in situ hybridisatietechniek.Dit is belangrijk om reproduceerbare en optimale testresultaten te verkrijgen voor het bepalen van de geslachtschromosoomcomplementering of de translocatiestatus van een embryo.

fish-for-pre-implantation-genetic-diagnosis

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Gen functie kan worden verduisterd in de verlies-van-functie experimenten als er sprake is compensatie door een ander gen. De zebravis model biedt een relatief high-throughput middel om dergelijke functionele redundantie onthullen in levende embryo's.

Een omgekeerde genetische benadering van functionele redundantie Test tijdens de embryogenese

Dit protocol beschrijft de methode van de genetische val insertiemutagenese behulp Gal4-VP16 als primaire verslaggever en GFP / RFP als secundaire verslaggevers in zebravis. Ongeveer een op de tien high-uitdrukken F0 vis opbrengst gene trap nageslacht co-GFP en RFP. De screeningsprocedure kan gemakkelijk worden opgeschaald te passen aan de grootte van het laboratorium dat de insertie mutagenese scherm.

Gene Trapping behulp Gal4 in zebravis

De zebravis is een krachtig modelsysteem voor ontwikkelingsbiologie en onderzoek naar menselijke ziekten vanwege hun genetische overeenkomsten met hogere gewervelde dieren. Dit protocol beschrijft een methodologie om haploïde zebravis-embryo's te creëren die kunnen worden gebruikt voor forward screen-strategieën om recessieve mutaties in genen die essentieel zijn voor vroege embryogenese te identificeren.

Productie van Haploid zebravis embryo&#39;s door<em&gt; In Vitro</em&gt; Bemesting

Transgene manipulaties en genoom editing zijn van cruciaal belang voor het functioneel testen van de rol van genen en cis van regelgevende elementen. Hier kunt u een gedetailleerde micro-injectie protocol voor het genereren van genomische modificaties (inclusief Tol2-gemedieerde fluorescerende reporter transgene constructen, Talens en CRISPRs) wordt gepresenteerd voor de opkomende model vis, de driedoornige stekelbaars.

Micro-injectie voor Transgenese en Genome Bewerken in Threespine Stekelbaarzen

Een eenvoudige en efficiënte microinjection protocol voor het bewerken van het gen in channel catfish embryo's met behulp van de CRISPR/Cas9-systeem wordt gepresenteerd. In dit protocol, begeleiden RNAs en Cas9 eiwit in de dooier van één-cel embryo's waren microinjected. Dit protocol is gevalideerd door kloppen uit twee channel catfish immuun-gerelateerde genen.

Microinjection van CRISPR/Cas9 eiwit in Channel Catfish, Ictalurus punctatus, embryo's voor Gene Editing

Gerichte genoom bewerken in het modelsysteem Danio rerio (zebravis) is sterk bevorderd door de opkomst van de CRISPR gebaseerde benaderingen. Hierin beschrijven we een gestroomlijnde, robuust protocol voor generatie en van onzin CRISPR afkomstige allelen waarin de heteroduplex mobility assay en identificatie van mutaties met behulp van de volgende generatie sequencing.

Efficiënte productie en identificatie van CRISPR/Cas9-gegenereerd Gene uitsparingen in de modelsysteem Danio rerio

Zebravis als betrouwbare genetische modelorganismen in biomedisch onderzoek, vooral met de komst van gen-bewerken technologieën zijn gebruikt. Wanneer larvale fenotypen verwachting, kan DNA-extractie en genotype identificatie worden uitdagende. Hier beschrijven we een efficiënte genotypering procedure voor zebrafish larven, door de staart knippen, zo spoedig 72 uur na bevruchting.

High-throughput DNA-extractie en de genotypering van 3dpf Zebrafish larven door Fin knippen

Hier introduceren we een methode van halfgeleider sequencing voor pre-implantatie genetische testen voor aneuploïdie (PGT-a) met de voordelen van korte doorlooptijd, lage kosten en hoge doorvoer.

Halfgeleider sequencing voor pre-implantatie genetische tests voor aneuploïdie

Vroege ontwikkeling is afhankelijk van moederlijk overgeërfde producten en de rol van veel van deze producten is momenteel onbekend. Hierin beschreven we een protocol dat CRISPR-Cas9 gebruikt om fenotypen met maternale effecten in een enkele generatie te identificeren.

Het bepalen van de rol van maternale tot expressie gebrachte genen in de vroege ontwikkeling met maternale crispants

Het protocol presenteert de algemene procedures in het laboratorium die vereist zijn bij pre-implantatie genetische tests voor aneuploïdie op een op halfgeleiders gebaseerd sequencingplatform van de volgende generatie. Hier presenteren we de gedetailleerde stappen van volledige genoomversterking, DNA-fragmentselectie, bibliotheekconstructie, sjabloonvoorbereiding en sequencing-werkstroom met representatieve resultaten.

Pre-implantatie genetische testen voor aneuploïdie op een halfgeleidergebaseerd next-generation sequencingplatform

CRISPR-Cas-technologieën hebben een revolutie teweeggebracht op het gebied van genoombewerking. Het vinden en isoleren van de gewenste kiembaanbewerking blijft echter een groot knelpunt. Daarom beschrijft dit protocol een robuuste methode voor het snel screenen van F0 CRISPR-geïnjecteerd zebravissperma op kiembaanbewerkingen met behulp van standaard PCR-, restrictieverterings- en gelelektroforesetechnieken.

Screening van sperma op de snelle isolatie van kiembaanbewerkingen bij zebravissen

Leer FISH voor pre-implantatie genetische diagnostiek van menselijke embryo's. Deze methode analyseert enkelvoudige cellen om chromosoomafwijkingen te detecteren en embryo-selectie te verbeteren.

FISH voor Pre-implantatie genetische diagnostiek

Meer video's verkennen