Monogene Assay: hechtende cellen

Hallo, mijn naam is Lum en ik ben momenteel bezig met mijn doctoraat aan het BE IDI Heart and Diabetes Institute onder supervisie van Dr. Tom Carianne, die hoofd is van het Epigenomic Medicine Lab. In deze video zal ik de procedure laten zien die bekend staat als Clon Genic Survival Assay. Dit is een techniek van 50 jaar oud, die het mogelijk maakt om de impact van verschillende behandelingen zoals blootstelling aan straling of chemische agentia op de reproductieve levensvatbaarheid van cellen te beoordelen.

Congenic overlevingsassay is een centrale techniek in de stralingsbiologie voor het evalueren van de stralingsgevoeligheid van verschillende cellijnen en het testen van de werkzaamheid van verschillende radiobeschermende of radioversterkende middelen. Bij gebruik van een A-aderente cellijn bestaat het cryogeen overlevingsassay uit drie fasen. Eerst, de behandeling van een monolaag van A-aderente cellen.

Ten tweede, de voorbereiding van een enkele celsuspensie en het plateren van een bekend aantal cellen en geverfde schalen, en ten derde, kleuring, tellen en kolonievorming na een incubatieperiode. In deze video gebruik ik geïmmortaliseerde, humane cino site cellen om te demonstreren hoe polygenische bijbelassay kan worden gebruikt om de radiobeschermende eigenschappen van de natuurlijke antioxidant te bepalen. 1225 M flessen worden van tevoren gezaaid met cellen in vijf milliliter media, zodat er op de dag van het experiment 1 miljoen cellen per fles zijn.

50 microliter van het medicijn wordt toegevoegd in verschillende concentraties aan de vijf milliliter media in elke geschikt gelabelde fles om de vereiste concentratie te bereiken, vijf concentraties worden gebruikt evenals één voertuigcontrole in dit geval, PBS. Na toevoeging van het medicijn worden de cellen gedurende één uur geïncubeerd onder de omstandigheden die geschikt zijn voor de gebruikte cellijn. Na incubatie worden de flux, met uitzondering van de controlegroep, bestraald met de gekozen dosis, die in dit geval vier gray is, geproduceerd door een gammastralingsemitterende cesiumbron.

Na bestraling wordt het media weggegooid en wordt elke fles gedurende vijf minuten gewassen met twee milliliter PBS. Na het weggepompen van het PBS worden twee milliliter 0,05% trypsine toegevoegd aan elke fles om de A-aderente cellen los te maken van de fles. Vervolgens wordt aan elke fles vijf milliliter DMEM met 10% foetaal bovien serum toegevoegd om de trypsine te deactiveren.

De volledige inhoud van de fasc wordt vervolgens overgebracht naar gelabelde 10 milliliter falconbuizen. Zodra dit voltooid is, worden deze buizen gecentrifugeerd gedurende vijf minuten, waarna de supinator voorzichtig wordt weggegooid zonder de palaat te verstoren, en vijf milliliter crecy media wordt toegevoegd aan elke buis. De concentratie van cellen voor elk monster wordt ENC berekend evenals het benodigde volume van elk monster om de uiteindelijke concentratie cellen te bereiken die uit te plateren is in vijf petrischalen per monster met vijf milliliter media elk.

Voor de controlegroep worden bijvoorbeeld 100 cellen per schaal geplateerd, dus het benodigde volume om 500 cellen per 25 milliliter te bereiken wordt berekend. Voor meer geconcentreerde monsters wordt een 10 keer verdunning of een 100 keer seriële verdunning uitgevoerd om de fout te minimaliseren die betrokken is bij het gebruik van volumes minder dan 100 microliter. Nu wordt het eerder berekende volume bereid in een Falconbuis met 25 milliliter media voor elk monster. De monsters kunnen nu worden overgebracht naar eerder gelabelde pre-schalen, waarbij vijf milliliter aan elke schaal wordt toegevoegd voor gemakkelijker hantering en transport.

Bewaar de schalen in een grote, steriele of gedesinfecteerde container. De schalen worden vervolgens in een bevochtigde incubator in de juiste omstandigheden geplaatst en gedurende acht dagen geïncubeerd. Als keratinocyten worden gebruikt na acht dagen, verwijder de schalen voorzichtig uit de incubator en leg ze een voor een op een rookafzuigkap.

Wees voorzichtig om de plaats voorzichtig te behandelen zodat eventuele gevormde kolonies niet worden verstoord. Verwijder de deksels en voeg vijf ml 0,9% saline toe aan elke schaal om ze te wassen. Richt de voorbereidende tip in de hoek van de schaal en vermijd het raken van de bodem van de schaal, zodat eventuele kolonies niet per ongeluk worden afgeschraapt.

Na vijf minuten wordt voorzichtig het saline afgezogen. Nu worden kolonies gefixeerd met drie milliliter 4% formule, en de deksels moeten worden vervangen om verdamping te voorkomen. Na 15 minuten tot een half uur wordt de formule afgezogen en op de juiste manier weggegooid.

De kolonies zijn nu klaar om te worden gekleurd met 0,1% Crystal violet, vijf milliliter wordt aan elke schaal toegevoegd en de deksels worden na een half uur tot een uur vervangen. De kleurstof wordt vervolgens afgewassen met gedistilleerd water en de schalen worden omgekeerd en gedurende een nacht laten drogen. De kolonies zijn nu klaar om te worden geteld.

Koloniën kunnen handmatig worden geteld met behulp van een dissectiemicroscoop. Elke cluster van cellen die 50 of meer cellen bevat, wordt beschouwd als een kolonie. En dat is het einde van onze demonstratie van de Congenic overlevingsassay.

Het belangrijkste voordeel van deze assay ten opzichte van andere technieken is dat het ongelooflijk gevoelig is en overleving kan detecteren over een groot bereik, zelfs na zes logs celdood. Deze gevoeligheid wordt bereikt door grotere aantallen cellen te plateren. Deze essay kan gemakkelijk voor andere doeleinden worden gebruikt, zoals het testen van cytotoxiciteit.

Bedankt voor het bekijken.