Single Particle Electron Microscopy Reconstructie van de Exosome Complex Met behulp van de Random conische Tilt Methode

Het algemene doel van het volgende experiment is om de driedimensionale structuur van het exosome-complex te verkrijgen met behulp van de willekeurige conische kantelingsmethode. Dit wordt bereikt door eerst een dunne laag koolstoffilm op de heilige koolstofraster af te zetten om de ondersteunende substraat voor het eiwitcomplex te maken en de kleurstof als tweede stap aan te brengen. Het monster en de kleurstof worden op het raster aangebracht, waardoor het monster in zware metaalzouten wordt begraven.

Vervolgens wordt elektronenmicroscopie uitgevoerd om kantelingparen van micrografieën van het monster te verkrijgen. Ten slotte worden resultaten verkregen die de driedimensionale structuur van het exosome-complex laten zien op basis van beeldafbeeldanalyse met behulp van de willekeurige conische kantelingsmethode. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode worstelen omdat soms een goede voorbereiding van het monster voor de willekeurige conische kantelingsmethode moeilijk is, evenals de procedure voor de beeldverwerking die volgt.

Demonstratie van deze methode is cruciaal omdat de graad en de voorbereidingsstappen van het monster moeilijk te leren zijn zonder een illustratie van monsterbeoordeling. Het principe van de willekeurige conische kantelingsmethode vereist het nemen van een paar micrografieën van dezelfde regio van een monster in de elektronenmicroscoop. Een foto wordt genomen van het monster in een ongekantelingde positie en de andere foto wordt genomen van het monster gekanteld op een hoek tussen 50 en 70 graden. Met behulp van de computer wordt het gedigitaliseerde micrografieënpaar naast elkaar geplaatst en worden beelden van dezelfde deeltjes geselecteerd in deze illustratie.

Deze beelden zijn gemarkeerd met nummers in driedimensionale coördinaten. De beelden van ongekanteerde deeltjes en hun gekantelde partners worden met elkaar gecorreleerd door de richting van de kantelingsas en de kantelingshoek. De uitlijning van de ongekanteerde deeltjesbeelden brengt de beelden van gekanteelde deeltjes naar hun overeenkomstige als aMule-locaties. Met behulp van meerdere beelden van gekanteelde deeltjes die de azimutale ruimte vullen, kan de driedimensionale structuur van het molecuul worden gereconstrueerd met behulp van een backprojectiealgoritme om de rasters te fabriceren. Eerst een 0,5%form VAR-oplossing voorbereiden door 0,45 gram polyvinylformaalhars en 90 milliliter chloroform toe te voegen aan een 100 milliliter glazen beker.

In een afzuigkap de beker bedekken met aluminiumfolie en het formaalvarhars oplossen. Met een achtste van een kleine roerbaar en een magnetische roerder neemt de hars ongeveer 15 minuten om op te lossen. Ondertussen schone vooraf gereinigde microscoopglazen in methanol en met Kim-doekjes.

Nadat het formaalvarhars volledig is opgelost. Voeg in chloroform een milliliter 50% glycerol toe aan het oppervlak van de oplossing. Het aanpassen van het volume van de toegevoegde glycerol beïnvloedt de dichtheid van de gaten in de heilige koolstof.

De tip van een ultrasoon in de oplossing duwen. Bij ongeveer een inch diepte, gebruik maximaal vermogen om gedurende één minuut te sonificeren, wat een emulsie van glyceroldruppeltjes zal maken in de vorm van onze oplossing. Langere sonificatie zal een kleinere grootte van gaten in de heilige koolstof veroorzaken.

De oplossing wordt melkachtig na deze stap. Direct na de sonificatiedip de schone glazen plaatjes verticaal in de emulsie. Trek ze voor één seconde eruit en dep de onderkant van de plaatjes met filterpapier om een dunne plastic film over het oppervlak van de plaatjes te vormen.

Nadat het chloroform is verdampt, controleer de dichtheid en grootte van de gaten in de film onder een lichtmicroscoop. De hier beschreven voorbereidingsconditie zou 10 tot 20 gaten moeten produceren in elk vierkant van een 400-mazig raster met diameters tussen drie en vier micrometer. Zodra de glazen plaatjes droog zijn, snij de rand van de plastic film op het oppervlak van de plaatjes.

Drijf de film uit op het oppervlak van gedestilleerd water door de plaat verticaal in water te duiken. De dunne film op het wateroppervlak kan worden waargenomen onder een schuine hoek tegen de lichtreflectie. Plaats 400-mazig koperrasters op de film, één voor één met de gladde rasteroppervlakte naar beneden gericht.

Neem de plastic film met rasters erop op met behulp van een stuk papier. Draai het papier om en laat het drogen. In een petrischaal het papier weken in methanol om de resterende glycerol in de gaten te verwijderen en laat het papier aan de lucht drogen.

Gebruik een koolstofverdamper om de rasters te bedekken met een laag koolstof met een dikte van ongeveer 20 nanometer. Gebruik de verdampingstijd om de gewenste dikte te bepalen. De dikte kan worden bepaald door de grijze kleur van het koolstof vergeleken met de grijze kleur van een bekende dikte koolstoflaag.

Week de koolstof-gelaagde rasters met chloroform in een glazen petrischaal gedurende een half uur om de formaalvar formaalvarverwijdering te verwijderen, gevolgd door het drogen van de rasters resulteert in zelfgemaakte heilige koolstofrasters. Vervolgens verdampt een dunne laag koolstof met een dikte van ongeveer vijf nanometer op een vers gekloven mica-oppervlak. Leg vervolgens zorgvuldig de heilige koolstofrasters op een stuk filterpapier onder gedestilleerd water.

In een zelfgemaakte inrichting drijf het dunne koolstof van het mica-oppervlak naar het wateroppervlak en depositeer het langzaam op de heilige koolstofrasters. Neem het filterpapier met rasters erop op en laat het drogen. Begin in een afzuigkap met negatieve kleuring van het exosome-complex door een vers 2% urinalformaat-oplossing te maken.

Zoals beschreven in de schriftelijke procedure, bedek de oplossingsbuis met een stuk aluminiumfolie. Om lichtblootstelling te voorkomen, moet de oplossing hetzelfde worden gebruikt. Dag glow discharge een dunne koolstof over de volledig koolstofraster met behulp van een glow discharge-apparaat. Plaats vervolgens een stuk schoon parfum op de bank pipet drie