Name: Single Particle Electron Microscopy Reconstructie van de Exosome Complex Met behulp van de Random conische Tilt Methode (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 10 s
Description: Leer de random conical tilt methode voor 3D-reconstructie van het exosoomcomplex uit Saccharomyces cerevisiae met negatieve kleuring elektronenmicroscopie. Dit protocol helpt onderzoekers bij structurele biologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs willen graag de leden van Nogales lab bedanken UC Berkeley-in het helpen van vaststelling van de eerste protocollen en de leden van Wang lab aan de Yale University in hun hulp om de volledige protocollen vast te stellen. We erkennen ook dat het personeel in de cryo-EM-faciliteit en High-Performance Computation Center aan de Yale School of Medicine voor hun steun. HW is een Smith Family opdrachtnemer.

<ol><li>van Heel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angular+reconstitution%3A+a+posteriori+assignment+of+projection+directions+for+3D+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Angular reconstitution: a posteriori assignment of projection directions for 3D reconstruction.</a> Ultramicroscopy. 21, 111-123 (1987).</li>
<li>Radermacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstruction+of+single+particles+from+random+and+nonrandom+tilt+series%5BTitle%5D)+AND+%22J+Electron+Microsc+Tech%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstruction of single particles from random and nonrandom tilt series.</a> J Electron Microsc Tech. 9, 359-394 (1988).</li>
<li>Penczek, P. A., Grassucci, R. A., Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribosome+at+improved+resolution%3A+new+techniques+for+merging+and+orientation+refinement+in+3D+cryo-electron+microscopy+of+biological+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">The ribosome at improved resolution: new techniques for merging and orientation refinement in 3D cryo-electron microscopy of biological particles.</a> Ultramicroscopy. 53, 251-270 (1994).</li>
<li>Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+staining+and+image+classification+-+powerful+tools+in+modern+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Proced+Online%22%5BJournal%5D)">Negative staining and image classification - powerful tools in modern electron microscopy.</a> Biol Proced Online. 6, 23-34 (2004).</li>
<li>Frank, J., Radermacher, M., Penczek, P., Zhu, J., Li, Y., Ladjadj, M., Leith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPIDER+and+WEB%3A+processing+and+visualization+of+images+in+3D+electron+microscopy+and+related+fields%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">SPIDER and WEB: processing and visualization of images in 3D electron microscopy and related fields.</a> J Struct Biol. 116, 190-199 (1996).</li>
<li>Shaikh, T. R., Gao, H., Baxter, W. T., Asturias, F. J., Boisset, N., Leith, A., Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPIDER+image+processing+for+single+particle+reconstruction+of+biological+macromolecules+from+electron+micrographs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">SPIDER image processing for single particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs.</a> Nat Protoc. 3, 1941-1974 (2008).</li>
<li>Heel, M. van, Harauz, G., Orlova, E. V., Schmidt, R., Schatz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+generation+of+the+IMAGIC+image+processing+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">A new generation of the IMAGIC image processing system.</a> J Struct Biol. 116, 17-24 (1996).</li>
<li>Ludtke, S. J., Baldwin, P. R., Chiu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EMAN%3A+semiautomated+software+for+high-resolution+single-particle+reconstructions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">EMAN: semiautomated software for high-resolution single-particle reconstructions.</a> J Struct Biol. 128, 82-97 (1999).</li>
<li>Pettersen, E. F., Goddard, T. D., Huang, C. C., Couch, G. S., Greenblatt, D. M., Meng, E. C., Ferrin, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UCSF+Chimera--a+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comput+Chem%22%5BJournal%5D)">UCSF Chimera--a visualization system for exploratory research and analysis.</a> J Comput Chem. 25, 1605-1612 (2004).</li>
<li>Wang, H. W., Wang, J., Ding, F., Callahan, K., Bratkowski, M. A., Buttler, J. S., Nogales, E., Ke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+the+yeast+Rrp44+exosome+complex+suggests+routes+of+RNA+recruitment+for+3%27+end+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Architecture of the yeast Rrp44 exosome complex suggests routes of RNA recruitment for 3' end processing.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 16844-16849 (2007).</li>
<li>Scheres, S. H., Nunez-Ramirez, R., Sorzano, C. O., Carazo, J. M., Marabini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+processing+for+electron+microscopy+single-particle+analysis+using+Xmipp%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Image processing for electron microscopy single-particle analysis using Xmipp.</a> Nat Protoc. 3, 977-990 (2008).</li>
<li>Yoshioka, C., Pulokas, J., Fellmann, D., Potter, C. S., Milligan, R. A., Carragher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automation+of+random+conical+tilt+and+orthogonal+tilt+data+collection+using+feature-based+correlation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Automation of random conical tilt and orthogonal tilt data collection using feature-based correlation.</a> J Struct Biol. 159, 335-346 (2007).</li>
</ol>

In dit artikel presenteren we een gedetailleerd protocol van monstervoorbereiding en driedimensionale reconstructie van de exosome complex met behulp van negatieve kleuring elektronenmicroscopie. Met behulp van deze methode, kregen we de 3D-reconstructie met behulp van willekeurige conische kantel methode zonder enige voorkennis van de structuur. Random conische tilt methode vereist niet noodzakelijk een homogeen monster, maar de volgende projectie matching verfijning stap zou een homogeen monster nodig hebben om een ​​...

<table><tbody><tr><td>Polyvinylformaldehydehars</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>63450-15-7</td><td></td></tr><tr><td>Uranylformaat</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>22451</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost microscoopglaasjes</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>4951F-001</td><td></td></tr><tr><td>400 mesh grid regulier</td><td>SPI Supplies</td><td>3040C</td><td></td></tr><tr><td>Koolstofcoater Auto 306</td><td>Edwards Lifesciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tecnai-12 elektronenmicroscoop</td><td>FEI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glow discharger</td><td>BAL-TEC</td><td></td><td>Sputter coater SCD 005</td></tr></tbody></table>

single particle electron microscopy reconstructie van de exosome complex met behulp van de random conische tilt methode

Single Particle Electron Microscopy Reconstruction of the Exosome Complex Using the Random Conical Tilt Method

Enkel deeltje elektronenmicroscopie (EM) reconstructie heeft onlangs uitgegroeid tot een populaire tool om de drie-dimensionale (3D) structuur van grote macromoleculaire complexen te krijgen. Vergeleken met X-ray kristallografie, heeft het een aantal unieke voordelen. Ten eerste, enkel deeltje EM reconstructie niet nodig om het eiwit monster, dat is het knelpunt in de X-ray kristallografie kristalliseren, vooral bij grote macromoleculaire complexen. Ten tweede is het niet nodig grote hoeveelheden eiwit monsters. Vergeleken met milligram van eiwitten die noodzakelijk zijn voor kristallisatie, enkel deeltje EM wederopbouw slechts enkele micro-liters van de eiwit-oplossing bij nano-molaire concentraties, het gebruik van de negatieve kleuring EM-methode. Ondanks een paar macromoleculaire assemblages met een hoge symmetrie, enkel deeltje EM is beperkt tot relatief lage resolutie (lager dan 1 nm resolutie) voor vele exemplaren in het bijzonder diegenen zonder symmetrie. Deze techniek wordt ook beperkt door de grootte van de moleculen onder studie, dat wil zeggen 100 kDa voor negatief gekleurde exemplaren en 300 kDa voor bevroren gehydrateerd exemplaren in het algemeen. Voor een nieuwe steekproef van onbekende structuur, we meestal gebruik van een heavy metal oplossing om de moleculen insluiten door negatieve kleuring. Het monster wordt vervolgens onderzocht in een transmissie-elektronenmicroscoop om tweedimensionale (2D) microfoto van de moleculen te nemen. In het ideale geval de eiwitmoleculen hebben een homogene 3D-structuur, maar vertonen verschillende oriëntaties in de microfoto. Deze microfoto zijn gedigitaliseerd en verwerkt in computers als &quot;single deeltjes&quot;. Met behulp van twee-dimensionale alignment en classificatie technieken, homogeen zijn moleculen in dezelfde standpunten geclusterd in klassen. Hun gemiddelde op verbetering van het signaal van 2D het molecuul vormen. Na wijzen we de deeltjes met de juiste relatieve oriëntatie (Euler hoeken), zullen we in staat zijn om de 2D-deeltje beelden te reconstrueren in een virtuele 3D-volume. In single deeltje 3D-reconstructie, een essentiële stap is het correct toewijzen van de juiste oriëntatie van elk afzonderlijk deeltje. Er zijn verschillende methoden om de weergave van elk deeltje toe te wijzen, waaronder de hoekige reconstitutie 1 en willekeurige conische tilt (RCT) methode 2. In dit protocol beschrijven we onze praktijk in het krijgen van de 3D-reconstructie van gist exosome complex met behulp van negatieve kleuring EM en RCT. Opgemerkt moet worden dat ons protocol van elektronen microscopie en beeldverwerking het basisprincipe van RCT volgt, maar is niet de enige manier om de methode uit te voeren. We beschrijven eerst hoe het eiwit monster in te bedden in een laag van Uranyl-Formate met een dikte vergelijkbaar met de grootte van eiwit, met behulp van een essen carbon rooster bedekt met een laag van continue dunne koolstof film. Dan het monster wordt in een transmissie-elektronenmicroscoop te verzamelen Untilted (0 graden) en gekanteld (55 graden) paren van microfoto die later zullen worden gebruikt voor de verwerking en het verkrijgen van een eerste 3D-model van de gist exosome. Daartoe voeren we RCT en verfijnen van de eerste 3D-model met behulp van de projectie-matching verfijning methode 3.

Dit artikel beschrijft een standaard methode om een ​​drie-dimensionale (3D) reconstructie van biologische macromoleculen met behulp van negatieve kleuring van elektronenmicroscopie (EM) te krijgen. In dit protocol leggen we uit hoe u de 3D-structuur van de Saccharomyces cerevisiae exosome complex krijgen op medium resolutie met behulp van de random conische kantel reconstructie methode (RCT).

Single Particle Electron Microscopy Reconstructie van de Exosome Complex Met behulp van de Random conische Tilt Methode

Reconstructie via single-particle elektronenmicroscopie (EM) is onlangs een populair instrument geworden om de driedimensionale (3D) structuur van grote ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om de driedimensionale structuur van het exosoomcomplex te verkrijgen met behulp van de random conical tilt-methode. Dit wordt bereikt door in eerste instantie een dunne laag koolstoffilm op het holy carbon grid aan te brengen om het dragersubstraat voor het proteïncomplex te vormen, gevolgd door de kleuring als tweede stap. Het preparaat en de kleuring worden op het grid aangebracht, waardoor het preparaat wordt ingebed in zware metaalzouten.Vervolgens wordt elektronenmicroscopie uitgevoerd om tilt-paren van micrografieën van het preparaat te verkrijgen. Ten slotte worden resultaten verkregen die de driedimensionale structuur van het exosoomcomplex tonen op basis van beeldanalyse met de random conical tilt-methode. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode er moeite mee hebben, omdat een goede preparatie van het monster voor de random conical tilt-methode soms lastig is, evenzo als de daaropvolgende procedure voor de beeldbewerking View.Een demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien de stappen voor kwaliteitsbeoordeling en monstervoorbereiding moeilijk aan te leren zijn zonder een illustratie van de

single-particle-electron-microscopy-reconstruction-exosome-complex

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

This video describes the technique for preparing a thin section of embedded exosomes. These sections can further be stained and imaged using transmission electron microscopy, or TEM, to study the structural features of exosomes.

Sectioning, Staining and TEM Imaging of Embedded Exosomes: A Protocol To Visualize the Structural Features of Exosomes Using TEM

Galvocht is een waardevolle bron van extracellulaire vesiclen/exosomen die potentieel belangrijke biomarkers bevatten. Dit protocol vertegenwoordigt een robuuste methode om exosomen uit menselijk gal te isoleren voor verdere analyses, inclusief miRNA-profilering.

Isolatie en profilering van MicroRNA-bevattende exosomes van Human Bile

In dit artikel wordt een protocol voor het verwerken van cryo-EM-beelden gepresenteerd met behulp van de software suite SPHIRE. Het onderhavige protocol kan toegepast worden op bijna alle enkel-deeltjes-EM-projecten die zich richten op bijna atomaire resolutie.

Hoge resolutie single particle analyse van elektroncryo-microscopie beelden met behulp van SPHIRE

Dit protocol beschrijft de verschillende technieken die nodig zijn voor de transmissie-elektronenmicroscopie, met inbegrip van negatieve kleuring, uiterst dunne segmenteren voor gedetailleerde structuur en immuno-goud etikettering om te bepalen van de standpunten van bepaalde eiwitten in exosomes.

Bereiding van de monsters en de beeldvorming van de Exosomes door transmissie-elektronenmicroscopie

Analyse van één deeltje in cryo-elektronenmicroscopie is een van de belangrijkste technieken die worden gebruikt om de structuur van biologische ensembles met hoge resolutie te bepalen. Scipion biedt de tools om de hele pijplijn te creëren om de informatie die door de microscoop wordt verkregen te verwerken en een 3D-reconstructie van het biologische specimen te bereiken.

Cryo-EM en single-particle analyse met Scipion

Structuurbepaling van macromoleculaire complexen met behulp van cryoEM is routine geworden voor bepaalde klassen van eiwitten en complexen. Hier wordt deze pijplijn samengevat (monstervoorbereiding, screening, gegevensverzameling en -verwerking) en worden lezers gericht op verdere gedetailleerde bronnen en variabelen die kunnen worden gewijzigd in het geval van meer uitdagende exemplaren.

Cryo-elektronenmicroscopie met enkele deeltjes: van monster tot structuur

Directe stochastische optische reconstructiemicroscopie (dSTORM) wordt gebruikt om de typische diffractielimiet van lichtmicroscopie te omzeilen en exosomen op nanometerschaal te bekijken. Het kan worden gebruikt in zowel twee als drie dimensies om exosomen te karakteriseren.

Directe stochastische optische reconstructiemicroscopie van extracellulaire blaasjes in drie dimensies

In dit artikel wordt beschreven hoe u effectief gebruik kunt maken van drie cryo-EM-verwerkingsplatforms, d.w.z. cryoSPARC v3, RELION-3 en Scipion 3, om een enkele en robuuste workflow te creëren die van toepassing is op een verscheidenheid aan datasets met één deeltje voor structuurbepaling met hoge resolutie.

Een robuuste cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) verwerkingsworkflow met één deeltje met cryoSPARC, RELION en Scipion

Septines zijn cytoskeletale eiwitten. Ze interageren met lipidembranen en kunnen membraankromming op micronschaal waarnemen maar ook genereren. We beschrijven in dit protocol bottom-up in vitro methodologieën voor het analyseren van membraanvervormingen, krommingsgevoelige septinebinding en septinefilament ultrastructuur.

Bottom-up in vitro methoden om de ultrastructurele organisatie, membraanhervorming en krommingsgevoeligheidsgedrag van septines te testen

Het huidige protocol beschrijft een gegeneraliseerd en eenvoudig te implementeren schema voor het verzamelen van gekantelde gegevens met één deeltje in cryo-EM-experimenten. Een dergelijke procedure is vooral nuttig voor het verkrijgen van een hoogwaardige EM-kaart voor monsters die lijden aan preferentiële oriëntatiebias als gevolg van de naleving van de lucht-waterinterface.

Single-Particle Cryo-EM Data Collection met Stage Tilt met Leginon

Leer de random conical tilt methode voor 3D-reconstructie van het exosoomcomplex uit Saccharomyces cerevisiae met negatieve kleuring elektronenmicroscopie. Dit protocol helpt onderzoekers bij structurele biologie.

Single Particle Electron Microscopy Reconstructie van de Exosome Complex Met behulp van de Random conische Tilt Methode

Meer video's verkennen