Single Particle Electron Microscopy Reconstructie van de Exosome Complex Met behulp van de Random conische Tilt Methode

Het algemene doel van het volgende experiment is om de driedimensionale structuur van het exosoomcomplex te verkrijgen met behulp van de random conical tilt-methode. Dit wordt bereikt door in eerste instantie een dunne laag koolstoffilm op het holy carbon grid aan te brengen om het dragersubstraat voor het proteïncomplex te vormen, gevolgd door de kleuring als tweede stap. Het preparaat en de kleuring worden op het grid aangebracht, waardoor het preparaat wordt ingebed in zware metaalzouten.

Vervolgens wordt elektronenmicroscopie uitgevoerd om tilt-paren van micrografieën van het preparaat te verkrijgen. Ten slotte worden resultaten verkregen die de driedimensionale structuur van het exosoomcomplex tonen op basis van beeldanalyse met de random conical tilt-methode. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode er moeite mee hebben, omdat een goede preparatie van het monster voor de random conical tilt-methode soms lastig is, evenzo als de daaropvolgende procedure voor de beeldbewerking View.

Een demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien de stappen voor kwaliteitsbeoordeling en monstervoorbereiding moeilijk aan te leren zijn zonder een illustratie van de monsterbeoordeling. Het principe van de random conical tilt-methode vereist het maken van een paar micrografieën van hetzelfde gebied van een monster in de elektronenmicroscoop. Eén foto wordt gemaakt van het monster in een niet-gekantelde positie, en de andere foto wordt gemaakt van het monster gekanteld onder een hoek tussen 50 en 70 graden. Met behulp van de computer wordt het gedigitaliseerde paar micrografieën naast elkaar geplaatst en worden in deze illustratie beelden van dezelfde deeltjes geselecteerd.

Deze afbeeldingen zijn gemarkeerd met nummers in driedimensionale coördinaten. De afbeeldingen van niet-gekantelde deeltjes en hun gekantelde partners zijn aan elkaar gecorreleerd via de richting van de kantelas en de kantelhoek. De uitlijning van de afbeeldingen van de niet-gekantelde deeltjes brengt de afbeeldingen van gekantelde deeltjes naar hun corresponderende asMule-locaties; door gebruik te maken van meerdere afbeeldingen van gekantelde deeltjes die de azimuthale ruimte vullen, kan de driedimensionale structuur van het molecuul worden gereconstrueerd met behulp van een backprojection-algoritme. Om de grids te vervaardigen, bereid eerst een 0,5% form VAR-oplossing door 0,45 gram polyvinylformalhars en 90 milliliter chloroform toe te voegen aan een glazen bekerglas van 100 milliliter.

Bedek het bekerglas in een zuurkast met aluminiumfolie en los de formvar-hars op. Met behulp van een kleine roerstaf en een magnetische roerder duurt het ongeveer 15 minuten voordat de hars is opgelost. Reinig ondertussen reeds voorgereinigde microscopische glasplaatjes met methanol en Kim-wipes.

Nadat de formvar-hars volledig is opgelost in chloroform, wordt één milliliter 50% glycerol op het oppervlak van de oplossing toegevoegd. Door het volume van de toegevoegde glycerol aan te passen, kan de dichtheid van de gaatjes in het poreuze koolstof worden beïnvloed.

Plaats de tip van een ultrasone probe in de oplossing. Sonicate gedurende één minuut op maximale kracht op een diepte van ongeveer één inch, waardoor een emulsie van glyceroldruppels in onze oplossing ontstaat. Langere sonicatie zal resulteren in kleinere gaten in de holy carbon.

De oplossing wordt na deze stap melkachtig. Direct na het dompelen in de ultrasoonreiniger worden de schone glazen objectglazen verticaal in de emulsie geplaatst. Haal ze na één seconde eruit en dep de onderkant van de objectglazen droog met filterpapier om een dunne plastic film op het oppervlak van de objectglazen te vormen.

Nadat het chloroform is verdampt, wordt de dichtheid en de grootte van de gaatjes in de film gecontroleerd onder een lichtmicroscoop. De hier beschreven bereidingscondities zouden 10 tot 20 gaatjes moeten opleveren in elk vierkant van een 400 mesh rooster, met diameters tussen de drie en vier micrometers. Zodra de glazen objectglazen droog zijn, wordt de rand van de plastic film op het oppervlak van het objectglas afgesneden.

Laat de film op het oppervlak van gedestilleerd water drijven door het objectglas verticaal in het water te dompelen. De dunne film op het wateroppervlak kan onder een flauwe hoek tegen de lichtreflectie worden waargenomen. Plaats 400 mesh koperen grids één voor één op de film, met het gladde oppervlak van het grid naar beneden gericht.

Pak de plastic folie met de rasters erop op met een stukje papier. Keer het papier om en laat het drogen. Week het papier in een petrischaal in methanol om het resterende glycerol uit de gaatjes te verwijderen en laat het papier aan de lucht drogen.

Gebruik een koolstofverdampingsapparaat om de grids te coaten met een koolstoflaag van ongeveer 20 nanometers dik. Gebruik de verdampingstijd om de gewenste dikte te controleren. De dikte kan worden bepaald aan de hand van de grijze kleur van de koolstof in vergelijking met de grijze kleur van een koolstoflaag met een bekende dikte.

Week de koolstoflaag-grids een half uur in chloroform in een glazen petrischaal om de formvar te verwijderen; het daaropvolgend drogen van de grids resulteert in zelfgemaakte "holy carbon grids". Verdamp vervolgens een dunne laag koolstof met een dikte van ongeveer 5 nm op een vers gespleten mica-oppervlak. Plaats daarna de holy carbon grids voorzichtig op een stuk filterpapier onder gedestilleerd water.

Laat in een zelfgebouwd apparaat de dunne koolstoflaag vanaf het mica-oppervlak op het wateroppervlak drijven en breng deze langzaam over op de holy carbon grids. Neem het filterpapier met de grids op en laat het drogen. Start in een zuurkast met de negatieve kleuring van het exosoomcomplex door een verse 2%urilformaatoplossing te maken.

Zoals beschreven in de schriftelijke procedure, bedek de buis met de oplossing met een stuk aluminiumfolie. Om blootstelling aan licht te voorkomen, moet de oplossing op dezelfde dag worden gebruikt. Voer een glow discharge uit over een dunne koolstofgrid met behulp van een glow discharge-apparaat. Plaats vervolgens een stuk schoon Parafilm op de werkbank en pipetteer drie druppels van 50 µL uranylformaat-kleuringsoplossing op de Parafilm. Verdun het exosoomcomplex tot een concentratie van ongeveer 50 nM met behulp van verdunningsbuffer. Pipetteer 4 µL van het verdunde eiwit op de glow discharge-behandelde grid.

Laat het monster één minuut op het raster rusten en dep vervolgens de resterende oplossing weg met een stuk filterpapier met behulp van een pincet. Keer het raster onmiddellijk om op de eerste druppel kleurstof en spoel het raster door het ongeveer 10 seconden meerdere keren heen en weer te bewegen. Herhaal dit proces voor elk van de drie druppels kleurstof; laat na de laatste spoelbeurt de kleurstof nog één minuut op het raster rusten.

Dep vervolgens de kleurstof weg met een stuk filterpapier. Laat een dunne laag kleuringsoplossing op het grid-oppervlak achter en laat het grid drogen in een zuurkast. Plaats het monstergrid in de monsterhouder en plaats de houder vervolgens in een FEI TE nine 12 elektronenmicroscoop.

Controleer het monsterrooster bij een lage vergroting om de best gekleurde vakken te vinden. Een goed vak lijkt ongeveer een dozijn gaatjes te hebben met afmetingen van ongeveer één tot twee micrometer en donkergekleurde gebieden daarin. Schakel de low dose-modus van de FEI-gebruikersinterface in en stel de zoekfocus en de belichtingspositie in de low dose-modus af.

Stel de zoekmodus in op fractiemodus met een cameralengte van 1,5 meter. Stel de focus in op een vergroting van 150 K en stel de belichting in op een vergroting van 50 K met een gemeten belichtingstijd van één seconde. Normaal gesproken wordt een herkenbaar kenmerk op het rooster in zowel de zoek- als de belichtingsmodus gebruikt om de uitlijning uit te voeren.

Zoek in de zoekmodus naar de gaatjes met een goede kleuring en sla de locaties op. Maak een CCD-foto van het vierkant. Kantel het preparaat naar 55 graden en maak een tweede foto.

Vergelijk de twee afbeeldingen en identificeer de gepaarde gaatjes in de twee micrografieën. Kantel de tafel terug naar nul graden. Gebruik de low dose kit om foto's te maken van elk in de zoekmodus geïdentificeerd gaatje bij hoge vergroting met een defocus van ongeveer -0,7 µm.

Nadat er foto's van alle gaatjes zijn gemaakt, kantelt u de houder naar 55 graden bij gebruik van dezelfde vergroting. Maak micrografieën van het gekantelde preparaat met een defocus van ongeveer -1,2 µm. Identificeer het corresponderende gekantelde paar micrografieën op basis van de patronen in de micrografieën bij lage vergroting, gebruikmakend van het onregelmatige patroon van de zelfgemaakte holy carbon grids.

Om de correlatie te ondersteunen, kiest u micrographie-tiltparen met een gelijkmatige distributie van deeltjes en zonder halo's rond de deeltjes. Micrographieën met duidelijke kleurhalo's eromheen moeten worden verworpen bij het verwerken van de gegevens. Begin met de programma-instelling in de procedure.

Beeldverwerking wordt gedemonstreerd met behulp van process 2D in het Eman-pakket. Om het beeldformaat te wijzigen, worden het iMagic five-pakket voor de 2D-uitlijning en het spider-pakket gebruikt. Om de 3D-reconstructie en verfijning uit te voeren, wordt het DM drie Gatan-digitale beeld geconverteerd naar het spider-beeldformaat.

Select de partikelparen met het commando process 2D. Met behulp van het webprogramma dat is meegeleverd in het spider-programmapakket, slaat het programma automatisch de coördinaten van de partikels op en bokst alle geselecteerde partikels uit met het spider-script. Het script slaat zowel de gekantelde als de niet-gekantelde partikelstacks op.

Converteer de niet-gekantelde deeltjes van UN naar het IMAG five-formaat. Gebruik de bandpass-functie van het EM two EM-programma om de niet-gekantelde deeltjes te filteren en te maskeren met het InCorp prep-commando in IMAG five, en centreer de bandpass-gemaskerde deeltjes met het center-commando. Lijn de deeltjes in IMAG five iteratief uit en classificeer ze in homogene klassen met behulp van een batchscript dat de IMAG five-programma's automatisch uitvoert.

Gebruik vervolgens het commando msa names in class in IMAG five om een opzoektabel van de klassen van de partikels te genereren, en genereer met het commando header een plotbestand voor de translatie- en rotatiewaarden van de uitlijning voor elk partikel. Converteer in iMagic five de uitgelijnde partikels naar het spider-formaat met behulp van het EM two EM-programma. Zet daarna de opzoektabel van de klassen om in spider-documentbestanden.

De translatie- en rotatiewaarden van de uitlijning voor elk deeltje worden ook omgezet in een spider document-bestand. Pas een banddoorlaatfilter en een masker toe en centreer de gekantelde deeltjes op dezelfde wijze als voor de niet-gekantelde deeltjes in IMAG five; genereer vervolgens een nieuwe dataset voor de gecentreerde gekantelde deeltjes. Maak angulaire documentbestanden op basis van de multi-reference alignment documenten die zijn gegenereerd door IMAG five en de DCB-bestanden die door het webprogramma zijn gegenereerd. Gebruik het back projection script in spider om één initieel model voor elk klasse-gemiddelde te verkrijgen.

Voer tot slot projectieverfijning uit van het initiële volume met behulp van het spider-script tegen alle niet-gekantelde particles om het uiteindelijke volume via RCT te verkrijgen. Er zijn ongeveer 50 reconstructies van het exosoom verkregen. De volumes zijn gegenereerd uit gekantelde particles die corresponderen met elke particle in de 50 klassen van niet-gekantelde particles.

Met behulp van back projection, geïmplementeerd in het spider-pakket, werd vervolgens de projection matching-verfijning uitgevoerd. Met deze volumes als initiële modellen werd het getoonde 3D-volume van het exosoom gegenereerd met een resolutie van ongeveer 18 Å; we kunnen vervolgens de atomaire modellen van verschillende delen van het complex in de 3D-kaart plaatsen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe RCT wordt gebruikt om driedimensionale reconstructies te verkrijgen, vanaf het genereren van een goed contrasterend grid van het preparaat tot aan de peer-to-peer micrografieën, en uiteindelijk tot het verkrijgen van de reconstructie middels beeldanalysetechnieken. Naast het hier beschreven protocol zijn er verschillende methoden om de uiteindelijke reconstructies in de beeldanalyse te verkrijgen.

De meest kritische stap voor het verkrijgen van een betrouwbare en correcte reconstructie is het werken met een goed geprepareerd specimen.