Name: Gericht Ion Beam Frezen en Scanning Electron Microscopy van hersenweefsel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Leer gerichte ionenbundel-scanningelektronenmicroscopie van hersenweefsel voor driedimensionale structurele analyse. Deze methode biedt hoge resolutie en isotrope voxels voor gedetailleerd neurobiologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Sample fixatie en hars inbedding <ol><li> Monsters van verse weefsels en cellen worden vastgesteld voor ten minste 2 uur in 2% paraformaldehyde, en 2,5% glutaaraldehyde in 0,1 M fosfaatbuffer bij een pH van 7,4. Omvang van de steekproef moet 0.150 mm niet hoger zijn dan in de dikte om voldoende penetratie of fixeermiddel toe te staan, en mag niet worden achtergelaten in de correctie voor langer dan 12 uur. </li><li> Plaats de monsters in 20 ml glazen scintillatieflesjes en spoel ze drie keer, 5 minuten elk, in 0,1 M cacodylate buffer. </li><li> Vlek met 1,5% (w / v) kaliumferrocyanide en 1% (w / v) osmium tetroxide in 0,1 M cacodylate buffer (0,1 M, pH 7,4) gedurende 30 minuten. </li><li> Vlek met 1,0% (w / v) osmium tetroxide in 0,1 M cacodylate buffer gedurende 30 minuten. </li><li> Spoel een keer met dubbel gedestilleerd water gedurende 3 minuten. </li><li> Vlek met 1% (w / v) uranylacetaat in dubbel gedistilleerd water gedurende 30 minuten. </li><li> Spoel secties voor 5 minuten in dubbel gedistilleerd water en vervolgens drogen in gegradeerd alcohol series, op 2 minuten elke verandering (1 x 50%, 1 x 70%, 1 x 90%, 1 x 95%, 2 x 100%). </li><li> Insluiten in toenemende concentraties van Durcupan hars gemengd met ethanol, 30 minuten elke verandering, te beginnen bij 50% Durcupan in ethanol, gevolgd door: 70%, 90%, 95%, en vervolgens 100%. </li><li> Vervangen met verse Durcupan en schud langzaam gedurende 4 uur. </li><li> Plaats delen, met behulp van een houten cocktailprikkers, op glas microscopen dia's bedekt met schimmel scheidingsmiddel, en plaats in 65 ° C oven gedurende 24 uur. </li></ol> 2. De voorbereiding van de steekproef voor de FIB / SEM <ol start="11"><li> Scheiden de harslaag, met de monsters, van tussen de twee glazen microscoopglaasjes en was grondig aan alle schimmels scheidingsmiddel te verwijderen. </li><li> Met behulp van een doorvallend licht microscoop met een laag stroomverbruik doelstellingen, of ontleden microscoop met doorvallend verlichting, in de regio van belang vast te stellen binnen het deel van hars. </li><li> Snijd een klein (3 mm x 3 mm) vierkant rond de regio van belang met behulp van een scheermesje en plak dit aan de bovenkant van blanco hars blok met acryl lijm (figuur 1). 5 minuten wachten voor de lijm uit te harden, en ga dan verder met de volgende stap. </li><li> Klem het blok in de houder van de ulramicrotome en met behulp van de bijgevoegde stereomicroscoop, trim rond de regio van belang met een scheermesje totdat er slechts een kleine piramide van het materiaal blijft. </li><li> Verdere afwerking het blok, met een glazen mes vast in de ultramicrotoom, zodat de regio van belang kan exact worden gelokaliseerd ten opzichte van de afmetingen van het oppervlak van het blok (figuur 1). Snij een rand van het blok, dicht bij de regio van belang zijn, zodat een loodrechte stap wordt gesneden door het monster (zie figuur 1 en 2). Deze stap vormt de beeldvorming gezicht (figuur 2). </li><li> Verwijder het blok van de ultramicrotoom en foto's in de regio van belang binnen het blok, met behulp van een doorvallend licht microscoop. </li><li> Weggesneden de bijgesneden blok van de resterende hars stub. Dit wordt gedaan met behulp van een juwelier zag en zorgt ervoor dat slechts een klein blok is geplaatst in het FIB / SEM. De totale hoogte van dit blok mag niet meer dan 5 mm. </li><li> Lijm het blok aan een aluminium stub met carbon pasta ervoor te zorgen dat de zijde die moet worden afgebeeld is op de buitenste rand (figuur 1). </li><li> Nadat de lijm droog is, de vacht van de blok met een dun laagje goud (&gt; 20 nm; Cressington vacuüm verdamping systeem). </li></ol> 3. Beeldvorming in de FIB / SEM <ol start="20"><li> Bij een lage vergroting, en het gebruik van secundaire elektronen imaging (5 kV, 0,5 NAMP), richten het blok, zodat de gekozen regio van belang en de zijkant van het blok worden afgebeeld wordt geconfronteerd met de operator (figuur 2 c, d). </li><li> Orient het blok zodat het gezicht af te beelden ligt parallel aan het frezen balk. Dit betekent dat elektronenbundel is gericht op 54 ° ten opzichte van dit gezicht (figuur 2 b). </li><li> Met behulp van een ionenbundelstroom van 13 tot 27 Namps bij 30 kV verwijderen van een smalle band van hars van de voorkant van de regio af te beelden. </li><li> Schakel over naar teruggestrooide imaging-modus om de gefreesde gezicht dat de regio van belang ligt over te geven. </li><li> Met behulp van de lichtmicroscopie referentie-afbeelding (genomen op stap 16) en het beeld van de gemalen gezicht vinden van de exacte regio op het blok te worden gefreesd en afgebeeld (figuur 2). </li><li> Stort een beschermende laag (ongeveer 1 micron dik) van koolstof (of metaal), met behulp van de gas-injectie systeem van de microscoop, op het oppervlak van het blok, boven de regio van belang (figuur 2). </li><li> Met behulp van een stroom van 700 picoAmps, fijn molen de regio van het blok waarbinnen de uiteindelijke beelden zullen worden genomen. </li><li> Laat de frezen straal volledig molen dit beeld het gezicht tot er geen frees-artefacten te zien op het gezicht. Een complete molen van het gezicht wordt gecontroleerd door het observeren van veranderingen in elke volgende afbeelding over het hele gezichtsveld. Onvoldoende frezen kan ook gezien worden als witte strepen of 'gordijnen' die verschijnt Vertically in het beeld. </li><li> Laat de microscoop voor een minimaal 2 uur voor een thermische veranderingen te verspreiden. Dit vermindert het risico dat het blok gezicht zal drijven tijdens de beeldvorming, wat resulteert in verkeerd uitgelijnde beelden. </li><li> Selecteer de microscoop parameters voor beeldvorming van het gezicht serieel. Zorg ervoor dat de elektronenbundel een spanning die laag genoeg is om alleen het imago van een zeer ondiepe diepte van het materiaal in het blok gezicht. Dit moet ook veel minder diep zijn dan de dikte van het gezicht te worden verwijderd. Typische parameters voor beeldverwerking zijn spanningen tussen de 1,2 tot 2,0 kV met een pixel grootte van tussen 4 - 20 nm. De pixelverblijftijd moet worden gehouden, ongeveer 10 μsecs, zodat de totale tijd te frezen het gezicht en het verwerven van een beeld in stand wordt gehouden onder de 2 minuten (Figuur 3). </li></ol> 4. Geheimen tot succes Stap 1) Zorg ervoor dat de monsters niet dikker zijn dan 150 micron. Dit zal een adequate penetratie van de verschillende vlekken en hars in het materiaal. Dit kan worden bereikt door het snijden van de monsters met een vibratome onmiddellijk na de vastlegging. Deze dikte is geschikt voor hersenweefsel. Andere weefsels moeten worden getest om een adequate fixatie en vlekken zorgen. Stap 3) De monsters moeten vrij verspreid worden door de oplossing, en niet samengeklonterd samen in een deel van de flacon, terwijl deze secundaire fixatief wordt geïntroduceerd. Dit zal zorgen voor een maximale penetratie van het monster en vermindering van het monster te worden vervormd tijdens dit fixatie proces. Dit wordt bereikt door voorzichtig schudden de monsters binnen de flacon direct na de oplossing wordt toegevoegd. Stap 15) Zorg ervoor dat de regio van belang direct ligt onder (&lt;30 micron) het oppervlak van het blok. Dit vermindert de hoeveelheid frezen door de ionenbundel tijdens de beeldacquisitie fase. Stap 22) De scantijd van de ionenbundel moet worden adequte om ervoor te zorgen dat de hele beeldvorming gezicht volledig is gefreesd. Onvoldoende frezen wordt getoond als witte strepen, of 'gordijnen' die verschijnt verticaal naar beneden de beeldvorming gezicht. Stap 26) Het uiteindelijke gefreesd gezicht moet groter zijn dan het gezicht dat is afgebeeld. Dit komt omdat de gemalen hars wordt uitgeworpen uit het blok en redeposits op het blok oppervlakte in de directe omgeving. Dit redeposition kan inbreuk maken op de beeldvorming gezichtsveld, en wordt vermeden door frezen een veel groot gebied dan is afgebeeld. Voor een imaging venster dat is 20 micrometer breed, de gefreesd blok gezicht is groter dan 30 micron breed. Stap 29) Het is cruciaal dat de elektronenbundel parameters zijn zodanig dat het beeld wordt gegenereerd door elektronen die voortkomen uit alleen de eerste paar nanometer van het oppervlak van het blok. Dit is een acheved door het minimaliseren van de spanning tot onder 2 kV en ervoor te zorgen dat er geen elektronen dringen te ver. Dit wordt ook geholpen met behulp van een netspanning op de detector, zodat alleen de elektronen met de hoogste energie dragen bij aan het uiteindelijke beeld. Meestal wordt een raster spanning van 1,3 kV gebruikt voor een beeldvorming spanning van 1,5 kV. 5. Representatieve resultaten: <img src="/files/ftp_upload/2588/2588fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Voorbereiding van de hars te blokkeren. A) Resin embedded coronale deel (80 micron dik) door middel van een volwassen hersenen van de rat gezien in een steromicroscope. Het beeld toont duidelijk de verschillende hersengebieden die kan worden gesneden uit de sectie (b) met behulp van een scalpel. Hier wordt een 1 mm vierkant van de cortex verwijderd en (c) vast aan een blanco hars blok. D) De hars blok wordt vervolgens afgewerkt met een glazen mes gemonteerd in een ultramicrotoom, en zodra het blok is teruggebracht tot slechts verlaten regio van belang (e), is een stap loodrecht gesneden om de voorzijde van de embedded materiaal. f) Dit hele gebied is afgezet knip dan van de rest van de hars en gemonteerd op een aluminium stub klaar voor metaal coating en beeldvorming in de scanning electronen microscoop. <img src="/files/ftp_upload/2588/2588fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Voorbereiden het blok gezicht voor FIB / SEM beeldvorming. A) en b) tonen illustraties van het blok en de rand, dat is gefreesd om de beeldvorming gezicht (aangegeven met de zwarte dubbele pijl) te maken. De positie van de ion beam (wit) is parallel getoond aan de beeldvorming gezicht en de elektronenbundel (grijs) wordt weergegeven raken van het gezicht op 54 ° ten opzichte van de ion-beam. C) een aanzicht van het blok gezet met de elektronenbundel en afgebeeld met de secundaire elektronen. Langs deze kant van het blok een donkerder gebied (aangegeven met een gestippelde witte vak) toont een deel van het gezicht dat is ruwweg is gefreesd (weergegeven met dubbele koped zwarte pijl) om de onderliggende monster te onthullen. d) Als deze regio is afgebeeld met alleen de teruggekaatste elektronen het ingebed weefsel kan worden gezien. Hier is de volledige breedte van de embedded weefselsectie aangegeven met een dubbele leiding witte pijl. Schaalbalk in c) is 100 micron. <img src="/files/ftp_upload/2588/2588fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Imaging het een volume van het hersenweefsel met isotrope voxels. A) Reversed contrast teruggekaatste beeld van het blok gezicht met de ultrastructuur binnen een regio van de hersenen van de rat. Alle membranen zijn zichtbaar als grote macromoleculaire structuren. B) Een totaal van 1600 foto's werden verzameld op 5 nm afstand resulteert in een beeld stack met isotrope voxels. C) Deze stack kan worden afgebeeld in een vliegtuig met dezelfde resolutie. Dit beeld toont enkele synaptische verbinding die is afgebeeld in het xy vlak en de YZ-vlak.

<ol><li>Knott, G., Marchman, H., Wall, D., Lich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+section+scanning+electron+microscopy+of+adult+brain+tissue+using+focused+ion+beam+milling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Serial section scanning electron microscopy of adult brain tissue using focused ion beam milling.</a> J Neurosci. 28, 2959-2964 (2008).</li>
<li>Hekking, L. H., Lebbink, M. N., De Winter, D. A., Schneijdenberg, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focused+ion+beam-scanning+electron+microscope%3A+exploring+large+volumes+of+atherosclerotic+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Focused ion beam-scanning electron microscope: exploring large volumes of atherosclerotic tissue.</a> J Microsc. 235, 336-347 (2009).</li>
<li>Armer, H. E., Mariggi, G., Png, K. M., Genoud, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+transient+blood+vessel+fusion+events+in+zebrafish+by+correlative+volume+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Imaging transient blood vessel fusion events in zebrafish by correlative volume electron microscopy.</a> PLoS One. 4, e7716-e7716 (2009).</li>
</ol>

De techniek van FIB / SEM werkt optimaal als de regio van belang is niet te groot is. De bovengrens voor een afgebeeld volume is afhankelijk van de ion beam en het gebied dat het consequent molen herhaaldelijk gedurende vele uren. Tot nu toe dit is gedaan met gebieden van ongeveer 60 x 60 micron, echter, imaging dit hele gebied is niet mogelijk met een geschikte beeldresolutie, voornamelijk als gevolg van de factor tijd in het verzamelen van dergelijke een grote afbeelding. Als een voorbeeld, een 4 kx 4 k beeld met een pixelverblijftijd tot 10 microseconden zou 2 minuten en 40 seconden te verwerven te nemen, en voor een beeldhoek van 60 micron dit zou geven slechts een pixelgrootte van 15 nm. Voor beeldvorming van de ultrastructuur van cellen en weefsels, een kleinere pixelgrootte is meer geschikt is, meestal tussen de 4 en 10 nm / pixel. Voor een oppervlakte van 60 x 60 micron het beeld zou worden overgenomen in 10 uur, ook als de microscoop had deze mogelijkheid. Om deze redenen, de microscoop is een ideaal hulpmiddel voor het imago van volumes in de orde van 10 x 10 x 10 micrometer, of belangrijke regio&#39;s van gehele cellen. Dit kan eenvoudig worden gedaan binnen een periode van 48 uur op monsters die zijn goed in contrast met deze procedure. Tot nu toe het protocol is voornamelijk gebruikt met hersenweefsel, evenals verschillende soorten gekweekte zoogdiercellen vast te houden aan dekglaasjes. Echter, de fixatie en kleuring gebruikt worden met vele andere soorten van biologisch materiaal, met inbegrip van fabrieken materiaal om even goed contrasterende beelden stacks te produceren. Daarom is het belangrijkste voordeel van deze techniek is het vermogen om de afbeelding volumes met isotrope voxels. Afbeelding stapels van dit type zorgen voor analyses van de 3D-volume met behulp van beelden die op elk vlak in de stapel. Het voordeel hiervan is om de toeschouwer te laten beeldkenmerken in het beeld-serie vanuit elke richting en het verstrekken van een grotere afbeelding detail (figuur 3).

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het reagens </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th></tr><tr><td> Cyanoacrylaat lijm </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dissectiemicroscoop: Leica MZ8 </td><td> Leica Microsystems, Duitsland </td><td></td></tr><tr><td> Durcupan hars </td><td> Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Zwitserland </td><td></td></tr><tr><td> FIB / SEM microscoop (Zeiss, nVision 40) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Glas histologie dia&#39;s </td><td> Menzel-Glaser, Duitsland </td><td> AA00008032E </td></tr><tr><td> Glas messenmaker: Leica EM KMR2 </td><td> Leica Microsystems, Duitsland </td><td></td></tr><tr><td> Glazen scintillatieflesjes (20ml) </td><td> EMS, USA </td><td> 72634 </td></tr><tr><td> Glutaraldehyde </td><td> EMS, USA </td><td> 16222 </td></tr><tr><td> Juwelier zag </td><td> EMS, USA </td><td> 72010 </td></tr><tr><td> Mould scheidingsmiddel </td><td> Glorex, Zwitserland </td><td> 62407445 </td></tr><tr><td> Osmium tetroxide </td><td> EMS, USA </td><td> 19110 </td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> EMS, USA </td><td> RT 19208 </td></tr><tr><td> Fosfaat zouten voor fosfaatbuffer </td><td> Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Zwitserland </td><td> 71642 en 71496 </td></tr><tr><td> Natrium cacodylate </td><td> Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Zwitserland </td><td> 20840 </td></tr><tr><td> Sputter coater met goud doelgroep </td><td> Cressington, USA </td><td></td></tr><tr><td> Tris base (TBS) </td><td> Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Zwitserland </td><td> T1378 </td></tr><tr><td> Ultramicrotoom: Leica UCT </td><td> Leica Microsystems, Duitsland </td><td></td></tr><tr><td> Uranylacetaat </td><td> EMS, USA </td><td> RT 22451 </td></tr></tbody></table>

gericht ion beam frezen en scanning electron microscopy van hersenweefsel

Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

Dit protocol beschrijft hoe biologische monsters, zoals hersenweefsel, kunnen worden afgebeeld in drie dimensies met behulp van de gerichte ionenbundel / scanning electronen microscoop (FIB / SEM). De monsters worden bevestigd met aldehyden, heavy metal gekleurd met osmium tetroxide en uranylacetaat. Ze worden vervolgens gedehydrateerd met alcohol en geïnfiltreerd met hars, die vervolgens is verhard. Met behulp van een lichtmicroscoop en ultramicrotoom met glas messen, is een klein blok met de regio rente dicht bij het oppervlak. Het blok wordt dan geplaatst in het FIB / SEM, en de ion beam gebruikt om ongeveer molen een verticale gezicht langs een kant van het blok, niet ver van deze streek. Met behulp van teruggekaatste elektronen aan het imago van de onderliggende structuren, is een kleiner gezicht vervolgens vermalen met een fijnere ionenbundel en het oppervlak onderzocht beter om de exacte oppervlakte van het gezicht af te beelden en gefreesd te bepalen. De parameters van de microscoop wordt dan zo ingesteld dat het gezicht herhaaldelijk is gefreesd en gescand, zodat seriële beelden worden verzameld via een volume van het blok. Het beeld stack bevat doorgaans isotrope voxels met afmetingen zo klein een 4 nm in elke richting. Dit beeldkwaliteit in elke imaging vlak stelt de gebruiker in cel ultrastructuur te analyseren op elke kijkhoek in het beeld stack.

Dit protocol beschrijft hoe hars ingebed hersenweefsel kan worden voorbereid en afgebeeld in de drie dimensies in de gerichte ion beam, scanning electronen microscoop.

Gericht Ion Beam Frezen en Scanning Electron Microscopy van hersenweefsel

Dit protocol beschrijft hoe biologische monsters, zoals hersenweefsel, in drie dimensies kunnen worden afgebeeld met behulp van de gefocuste ionenbundel/scanningelektronen...

Het doel van deze procedure is om seriële beelden te verzamelen van een specifiek gebied van hersenweefsel met behulp van een gefocuste ionenbundel en een scanningelektronenmicroscoop. Dit wordt bereikt door het brein eerst in plakjes te snijden, die vervolgens worden gekleurd en in hars worden ingebed. De tweede stap is om het interessegebied uit de ingebedde hersensectie te snijden en dit te monteren op een blanco harsblok.De derde stap is het trimmen van het harsblok met een ultramicrotoom en het gebruik van de ionenbundel van de microscoop om uitsluitend het gebied te isoleren dat moet worden afgebeeld. De laatste stap is het serieel afbeelden van een zijvlak van het harsblok door de ionenbundel te gebruiken om herhaaldelijk dunne lagen te verwijderen voordat elke afbeelding wordt gemaakt. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die seriële beelden tonen door een gebied van interesse.De beeldserie wordt automatisch verzameld en de dataset bevat doorgaans isotrope voxels, zodat de beeldstructuren vanuit elke hoek in de stack kunnen worden bekeken. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals seriële sectie transmissie-elektronenmicroscopie, is dat er een veel hogere Z-resolutie kan worden bereikt. En vergeleken met elektronentomografie is het mogelijk om veel grotere volumes af te beelden met een optimale resolutie voor in hars ingebedde monsters.De procedure begint met het disseceren van het gefixeerde brein van een geanestheseerde, geperfuseerde rat. Bed het brein in warm 5% aeros in een plastic vorm en oriënteer het brein onder de juiste hoek voordat het aeros stolt. Monteer het aerosblok met het brein erin op een monsterhouder met behulp van een vibrato-slice. Maak coronale coupes van 80 micron en snijd zoveel coupes als nodig is om het interessegebied op te nemen.Plaats de monsters vervolgens in glazen isolatiebuisjes van 20 milliliter. Plaats maximaal 10 secties per buisje. Spoel de monsters drie keer gedurende vijf minuten in 0,1 molair K coate buffer.Kleur de monsters vervolgens gedurende 30 minuten met 1,5% kaliumcyanide en 1% osmiumtetroxide in 0,1 molar K coate buffer. Vervolg de kleuring van de monsters met 1% osmiumtetroxide in 0,1 molar K coate buffer gedurende 30 minuten. Spoel daarna eenmaal gedurende drie minuten met dubbel gedestilleerd water en kleur vervolgens gedurende 30 minuten met 1% al-acetaat in dubbel gedestilleerd water.Spoel de coupes vervolgens vijf minuten in dubbel gedestilleerd water en dehydrateer ze daarna in een graduele alcoholserie, waarbij elke stap twee minuten duurt. De volgende stap is het inbedden van de coupes in toenemende concentraties Duran-hars gemengd met alcohol, met intervallen van 30 minuten tussen de wissels. Begin met een verhouding van 50:50 ethanol-hars, gevolgd door 30:70, vervolgens 10:90 en plaats de coupes tot slot 30 minuten in 100% hars.Vervang vervolgens het medium door 100% verse duran-hars. Agiteer gedurende één uur langzaam op de rolmixer. Plaats na het inbedden de secties met een houten cocktailstokje op glazen microscopielaampjes die vooraf zijn gecoat met mallenscheidingsmiddelen.Plaats zoveel mogelijk secties op de objectglazen, maar zorg ervoor dat de glazen niet te vol worden. Zorg er ook voor dat er een identiteitslabel tussen de objectglazen wordt geplaatst. Plaats de objectglazen gedurende 24 uur in een oven bij 65 °C.Verwijder de volgende dag de monsters uit de oven. Duw voorzichtig een scheermesje tussen de glazen microscopische objectglazen en verwijder de harslaag met de monsters tussen de glaasjes door de harslaag met uw vingers vast te houden. Was het monster voorzichtig onder stromend water.Om eventuele lossingsmiddelen van de mal te verwijderen, plaatst u het monster onder een dissectiemicroscoop met doorstrijkingsverlichting en een objectief met lage vergroting. Markeer het interessegebied met een fijne naald. Gebruik een scheermesje om een klein vierkant van drie millimeter bij drie millimeter rondom het interessegebied uit te snijden.Gebruik acryllieme om het kleine harsblokje aan de bovenzijde van een blanco harsblok te bevestigen. Klem het blok vervolgens in de houder van de ultramicrotoom. Gebruik een scheermesje, terwijl u door de gekoppelde stereomicroscoop kijkt, om rond het interessegebied weg te snijden totdat er slechts een kleine piramide van materiaal overblijft.Snijd de rand van het blok dicht bij het interessegebied onder een hoek ten opzichte van het bovenoppervlak van het blok, met behulp van een glazen mes vastgezet op de ultramicrotoom. Trim het blok verder zodat het interessegebied nauwkeurig kan worden gelokaliseerd ten opzichte van de afmetingen van het blokoppervlak. Verwijder het blok uit de ultramicrotoom en plaats het onder een transmissielichtmicroscoop.Fotografeer het gebied van interesse. Gebruik een juwelierszaag om het getrimde blok met koolstofverf weg te snijden van de resterende harsstomp. Bevestig het losgekoppelde SA-blok op een SEM-monsterhouder en oriënteer het zodanig dat de zijde die gefotografeerd moet worden naar de buitenste rand is gericht.Nadat de lijm is gedroogd, brengt u de preparatie over naar een sputter- en vacuümevaporatiesysteem en coatet u het blok met een dunne gouden laag van meer dan 20 nanometers. Het in hars ingebedde weefselblok is nu klaar om gefotografeerd te worden in de gefocuste ionenbundel-scanningelektronenmicroscoop. Plaats het monster in de houder in de microscoop bij een lage vergroting en oriënteer het blok met behulp van secundaire elektronenbeeldvorming zodanig dat het interessegebied en de zijde van het blok die gefotografeerd moet worden, naar voren zijn gericht.De operator oriënteert het blok zodanig dat het vlak dat moet worden afgebeeld parallel aan de freesstraal ligt. Dit resulteert erin dat de elektronenstraal onder een hoek van 54 graden ten opzichte van dit vlak wordt georiënteerd, met gebruik van een ionenbundelstroom van 13 tot 27 nano amps bij 30 kilovolts.Verwijder een smalle band hars van de voorzijde van het gebied dat moet worden afgebeeld. Schakel vervolgens over naar de modus voor terugverstrooiingsbeeldvorming om het gefreesde vlak te bekijken dat boven het interessegebied ligt. Lokaliseer, aan de hand van de eerder gemaakte referentieafbeelding uit de lichtmicroscopie en de afbeelding van het gefreesde vlak, het exacte gebied op het blok dat moet worden gefreesd en afgebeeld met behulp van het gasinjectiesysteem van de microscoop.Breng een beschermende laag koolstof of metaal van ongeveer één micron dik aan op het oppervlak van het blok boven het gebied van interesse met een stroomsterkte van 700 picoamps. Frees tot slot het gebied van het blok uit waarin de uiteindelijke beelden zullen worden opgenomen. Laat de freesstraal dit beeldvlak volledig frezen totdat er geen freesartefacten meer op het vlak zichtbaar zijn.Selecteer de microscoopinstellingen voor seriële beeldvorming van het oppervlak. Typische parameters zijn voltages tussen 1,2 en 2 kV met pixelgroottes tussen 4 en 20 nm. De verblijftijd per pixel moet ongeveer 10 µs zijn, zodat de totale tijd om het oppervlak te frezen en één beeld te verkrijgen minder dan twee minuten bedraagt.Laat de microscoop minimaal twee uur rusten om eventuele thermische veranderingen op te vangen. Om deze te dissiperen, start u het frees- en beeldvormingsproces om seriële beelden van het interessegebied te verkrijgen. Deze figuur toont de reverse-contrast backscattered image van het blokoppervlak, waarop de ultrastructuur binnen een regio van de wrap-brain te zien is.Alle membranen zijn zichtbaar, evenals grote macromoleculaire structuren. Deze figuur is samengesteld uit in totaal 1.600 beelden, verzameld met een tussenruimte van vijf nanometer, wat resulteert in een beeldstack met isotrope voxels. Deze stack kan in elk vlak worden afgebeeld met dezelfde resolutie.Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u hersenweefsel moet prepareren voor seriële beeldvorming met de focused ion beam scanning elektronenmicroscoop.

focussed-ion-beam-milling-scanning-electron-microscopy-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Take a fixed section of mouse cortical brain tissue exhibiting neuronal axons and dendrites. The dendrites possess protrusions, known as dendritic spines, which form synapses with axons.Incubate the tissue with osmium-ferrocyanide, which binds to lipids, followed by another osmium application, which enhances structural contrast for imaging.Stain with a heavy metal compound that binds to macromolecules and enhances contrast.Dehydrate using increasing alcohol concentrations for resin...

Focused Ion Beam Scanning Electron Microscopy for 3D Reconstruction of Synaptically Linked Neurons

This video demonstrates a method to investigate zebrafish larval brain injury using large-scale scanning transmission electron microscopy (STEM), a technique that combines elements of both scanning electron microscopy (SEM) and transmission electron microscopy (TEM) to produce high-resolution images. It outlines the steps involved in preparing samples and the acquisition of high-resolution STEM images to identify brain injury.

Investigating a Zebrafish Larval Brain Injury Using Large-Scale Scanning Transmission Electron Microscopy

Grootschalige 2D elektronenmicroscopie (EM), of nanotomy, is de toepassing van EM met nanoschaalresolutie op weefselbreed niveau. Hier beschrijven we een universele methode voor nanotomy toegepast om de larvale hersenen van de zebravis te onderzoeken in gezondheid en bij niet-invasieve hersenletsels.

Grootschalige Scanning Transmission Electron Microscopy (Nanotomy) van gezonde en beschadigde hersenen zebravis

Het visualiseren en analyseren van mitochondriën uit hersenweefsel van zoogdieren is een uitdagende taak. Hier beschrijven we hoe driedimensionale (3D) reconstructie-analyse van de seriële blok-face scanning elektronenmicroscopie (SBFSEM) kan worden gebruikt om inzicht te krijgen in de morfologische en volumetrische analyse van dit cruciale energieproducerende orgaantje.

Analyse van de Brain Mitochondriën gebruik van Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy

Dit artikel beschrijft een eenvoudige methode ter voorbereiding van kleine dierlijke hersenen van micro-CT beeldvorming, in welke letsels kunnen worden gekwantificeerd en elektroden gelegen met hoge precisie in de context van de hele hersenen.

Een Micro-CT-gebaseerde methode voor het karakteriseren van laesies en vinden van elektroden in kleine dierlijke hersenen

Hier presenteren we een protocol voor het efficiënt combineren van seriële Block face en gerichte Ion Beam Scanning elektronenmicroscopie om een interessegebied te targeten. Dit maakt efficiënt zoeken mogelijk, in drie dimensies, en het lokaliseren van zeldzame gebeurtenissen in een groot gezichtsveld.

Gerichte studies met behulp van seriële blokkering en gerichte ionen straal scan elektronenmicroscopie

We hebben aangetoond dat het etsen van nano-architectuur in intracorticale micro-elektrode-apparaten de ontstekingsreactie kan verminderen en de potentie heeft om elektrofysiologische opnames te verbeteren. De hierin beschreven methoden schetsen een benadering van etch nano-architecturen in het oppervlak van niet-functionele en functionele enkelvoudige schacht silicium intracorticale micro elektroden.

Gerichte ionen straal-lithografie voor etch nano-architecturen in micro elektroden

Hier presenteren we een pijplijn voor 3D-correlatieve gerichte ionenbundelfrezen op het begeleiden van de voorbereiding van cellulaire monsters voor cryo-elektronentomografie. De 3D-positie van fluorescerend gelabelde eiwitten van belang wordt eerst bepaald door cryo-fluorescentiemicroscopie en vervolgens gericht op frezen. Het protocol is geschikt voor zoogdieren, gisten en bacteriële cellen.

Monstervoorbereiding door 3D-correlatieve gefocuste ionenbundelfrezen voor cryo-elektronentomografie met hoge resolutie

Deze workflow maakt lamellenproductie mogelijk die gericht is op fluorescerend gelabelde biologische structuren die klein (&lt;1 μm in axiale omvang) en zeldzaam (1 kopie per cel) zijn met behulp van een cryogeen tri-samenvallend beeldvormingsplatform. Dit platform integreert fluorescentiemicroscopie, gefocusseerd ionenbundelfrezen en scanning-elektronenmicroscopie op een enkele brandpuntspositie en maakt gelijktijdige fluorescentiemicroscopie tijdens het malen mogelijk.

Workflow met behulp van een cryogene samenvallende fluorescentie-, elektronen- en ionenbundelmicroscoop voor het gericht frezen van cellen

We introduceerden een nieuwe beeldvormingstechniek genaamd Optical Multilayer Interference Tomography (OMLIT), die onbevooroordeelde beeldvorming van alle cellen in hersenmonsters op mesoschaal mogelijk maakt en naadloos kan worden geïntegreerd in de beeldvormingsworkflow van tape-gebaseerde seriële scanning-elektronenmicroscopie op hetzelfde monster.

Een scanning elektronenmicroscopie-compatibele optische beeldvormingsmethode voor mesoscopische all-cel hersenmapping

Leer gerichte ionenbundel-scanningelektronenmicroscopie van hersenweefsel voor driedimensionale structurele analyse. Deze methode biedt hoge resolutie en isotrope voxels voor gedetailleerd neurobiologisch onderzoek.

Gericht Ion Beam Frezen en Scanning Electron Microscopy van hersenweefsel

Meer video's verkennen