Gericht Ion Beam Frezen en Scanning Electron Microscopy van hersenweefsel

Het doel van deze procedure is om seriële beelden te verzamelen door een specifiek gebied van hersenweefsel met behulp van een gefocuste ionenbundel en een scanning-elektronenmicroscoop. Dit wordt bereikt door het brein eerst in plakjes te snijden die worden gekleurd en vervolgens in hars worden ingebed. De tweede stap is om het interessegebied uit de ingebedde hersensectie te snijden en dit op een blanco harsblok te monteren.

De derde stap is het trimmen van het harsblok met een ultramicrotoom en het gebruik van de ionenbundel van de microscoop om uitsluitend het gebied te isoleren dat moet worden afgebeeld. De laatste stap is het serieel afbeelden van een zijvlak van het harsblok, waarbij de ionenbundel wordt gebruikt om herhaaldelijk dunne lagen te verwijderen voordat elke opname wordt gemaakt. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die seriële beelden van een specifiek interessegebied tonen.

De beeldreeks wordt automatisch verzameld en de dataset bevat doorgaans isotrope voxels, zodat de beeldstructuren vanuit elke hoek in de stack kunnen worden bekeken. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals seriële sectie transmissie-elektronenmicroscopie, is dat er een veel hogere Z-resolutie kan worden bereikt. En in vergelijking met elektrontomografie is het mogelijk om veel grotere volumes af te beelden met een optimale resolutie voor in hars ingebedde monsters.

De procedure begint met het dissekeren van het gefixeerde brein van een geanestheseerde, geperfuseerde rat. Bed het brein in warm 5% aeros in een plastic vorm, oriënteer het brein in de juiste hoek voordat het aeros stolt, en monteer het aeros-blok met het brein erin op een monsterhouder met behulp van een vibrato slice. Maak coronale coupes van 80 micron; snijd zoveel coupes als nodig zijn om het interessegebied te bevatten.

Plaats de monsters vervolgens in glazen isolatieflesjes van 20 milliliter. Plaats maximaal 10 secties per flesje. Spoel de monsters drie keer gedurende vijf minuten per keer in 0,1 molar K coate buffer.

Kleur de monsters vervolgens gedurende 30 minuten met 1,5% kaliumcyanide en 1% osmiumtetroxide in 0,1 molair K coate buffer. Ga verder met het kleuren van de monsters met 1% osmiumtetroxide in 0,1 molair K coate buffer gedurende 30 minuten. Spoel daarna eenmaal gedurende drie minuten met dubbel gedestilleerd water en kleur vervolgens gedurende 30 minuten met 1% al acetate in dubbel gedestilleerd water.

Spoel vervolgens de coupes gedurende vijf minuten met dubbel gedestilleerd water en dehydrateer ze daarna in een oplopende alcoholserie, waarbij elke stap twee minuten duurt. De volgende stap is het inbedden van de coupes in toenemende concentraties Duran-hars gemengd met alcohol, met intervallen van 30 minuten tussen de stappen. Begin met een verhouding van 50:50 ethanol tot hars, gevolgd door 30:70, vervolgens 10:90, om tenslotte de coupes gedurende 30 minuten in 100% hars te plaatsen.

Vervang vervolgens het medium door 100% verse duran-hars. Agiteer gedurende één uur langzaam op de rolmixer. Plaats na het inbedden de secties met een houten cocktailprikje op glazen microscoopdia's die vooraf zijn behandeld met scheidingsmiddelen voor mallen.

Plaats zoveel mogelijk coupes op de objectglazen, maar zorg ervoor dat de glazen niet te vol worden. Zorg er ook voor dat er een identiteitslabel tussen de objectglazen wordt geplaatst. Plaats de objectglazen gedurende 24 uur in een oven op 65 °C.

Verwijder de volgende dag de monsters uit de oven. Schuif voorzichtig een scheermesje tussen de glazen microscoopglaasjes en verwijder de harslaag met de monsters tussen de glaasjes door de harslaag met de vingers vast te houden. Spoel het monster voorzichtig af onder stromend water.

Om eventuele lossingsmiddelen van de mal te verwijderen, plaatst u het monster onder een dissectiemicroscoop met doorgelaat licht en een objectief met een lage vergroting. Markeer het gebied van interesse met een fijne naald. Gebruik een scheermesje om een klein vierkantje van drie millimeter bij drie millimeter rondom het gebied van interesse uit te snijden.

Gebruik acrylijlijm om het kleine harsblokje op de bovenkant van een blanco harsblok te bevestigen. Klem het blok vervolgens vast in de houder van de ultramicrotoom. Gebruik een scheermesje, terwijl u door de bevestigde stereomicroscoop kijkt, om rondom het interessegebied weg te snijden totdat er slechts een kleine piramide van materiaal overblijft.

Snijd de rand van het blok dicht bij het interessegebied onder een hoek ten opzichte van het bovenoppervlak van het blok, met behulp van een glazen mes dat in de ultramicrotoom is bevestigd. Trim het blok verder, zodat het interessegebied nauwkeurig kan worden gelokaliseerd ten opzichte van de afmetingen van het blokoppervlak. Verwijder het blok uit de ultramicrotoom en plaats het onder een doorstrijklichtmicroscoop.

Fotografeer het gebied van interesse. Gebruik een juwelierszaag om het getrimde blok met koolstofverf weg te snijden van de resterende harsstomp. Bevestig het losgekoppelde blok op een SEM-monsterhouder en oriënteer deze zodanig dat de zijde die moet worden afgebeeld naar de buitenste rand is gericht.

Nadat de lijm is gedroogd, wordt de preparatie overgebracht naar een systeem voor sputtercoating en vacuümevaporatie, waarbij het blok wordt voorzien van een dunne gouden laag van meer dan 20 nanometers. Het in hars ingebedde weefselblok is nu klaar om te worden afgebeeld in de focused ion beam scanning elektronenmicroscoop. Plaats de sample in de houder in de microscoop bij een lage vergroting en oriënteer het blok met behulp van secundaire elektronenbeeldvorming, zodat het interessegebied en de zijde van het blok die moet worden afgebeeld naar voren wijzen.

De operator oriënteert het blok zodanig dat het te beelden oppervlak parallel aan de freesstraal ligt. Dit resulteert in een elektronenstraal die onder een hoek van 54 graden ten opzichte van dit oppervlak staat, met gebruik van een ionenbundelstroom van 13 tot 27 nano amps bij 30 kilovolts.

Verwijder een smalle band hars aan de voorzijde van het gebied dat moet worden afgebeeld. Schakel vervolgens over naar de backscatter-beeldvormingsmodus om het gefreesde oppervlak te bekijken dat boven het interessegebied ligt. Bepaal aan de hand van de eerder gemaakte referentieafbeelding uit de lichtmicroscopie en de afbeelding van het gefreesde oppervlak de exacte regio op het blok die moet worden gefreesd en afgebeeld met behulp van het gasinjectiesysteem van de microscoop.

Breng een beschermende laag van ongeveer één micron dikte van koolstof of metaal aan op het oppervlak van het blok boven het gebied van interesse met een stroom van 700 picoamps. Frees vervolgens het gebied van het blok waarin de uiteindelijke beelden worden genomen. Laat de freesstraal dit beeldvlak volledig uitfrezen totdat er geen freesartefacten meer op het vlak zichtbaar zijn.

Selecteer de microscoopinstellingen voor seriële beeldvorming van het oppervlak. Typische parameters zijn spanningen tussen 1,2 en 2 kV met pixelgroottes tussen 4 en 20 nm. De pixelverblijftijd moet rond de 10 µs liggen, zodat de totale tijd om het oppervlak te etsen en één afbeelding te verkrijgen minder dan twee minuten bedraagt.

Laat de microscoop ten minste twee uur rusten om eventuele thermische veranderingen te laten stabiliseren. Start vervolgens het frees- en beeldvormingsproces om seriële beelden van het interessegebied te verkrijgen. Deze figuur toont het reverse contrast backscattered image van het blokoppervlak, waarop de ultrastructuur binnen een gebied van de wrap brain te zien is.

Alle membranen zijn zichtbaar, evenals grote macromoleculaire structuren. Deze figuur is samengesteld uit in totaal 1.600 beelden, verzameld met een tussenruimte van vijf nanometer, wat resulteert in een beeldstack met isotrope voxels. Deze stack kan in elk vlak worden afgebeeld met dezelfde resolutie.

Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe u hersenweefsel voorbereidt voor seriële beeldvorming met de focused ion beam scanning electron microscope.