Patroonvorming Cellen op optisch transparant Indium Tin Oxide Elektroden

Hoi, ik ben Isha. Ik ben een tweedejaars promovendus in het lab van Dr. Zen. We zijn hier bij de afdeling Biomedical Engineering aan de University of California Davis.

Vandaag ga ik u laten zien hoe ionen worden beheerst op microgefabriceerde, optisch transparante indiumtineoxide-elektroden. In de weefseltechniek en regeneratie zijn pogingen ondernomen om de micro-omgeving van het orgaan na te bootsen. Om deze micro-omgeving in vitro te creëren, is het essentieel om cellen ruimtelijk en temporeel te isoleren op een substraat. Wij zijn geïnteresseerd in het ontwerpen van oppervlakken waarop we de locatie van verschillende leverceltypen kunnen beheersen.

In het experiment van vandaag maken we gebruik van oppervlaktemodificatie, microfabricage en elektrochemie om een oppervlak te vormen dat kan worden omgeschakeld van cel-niet-adhesief naar cel-adhesief. De eerste stap is fotolithografie. Hier is een stroomdiagram van hoe dat proces zal verlopen.

Het blauw is het glazen substraat, het groen is indiumtinoxide dat op het glazen substraat is aangebracht. Eerst gaan we de hier getoonde photoresist rood spin-coaten op het met indiumtinoxide gecoate glazen substraat. Vervolgens laten we dit via een fotomasker blootstellen aan ultraviolet licht, waarna de belichte gebieden worden ontwikkeld in een ontwikkeloplossing.

De ITO-gebieden die niet door fotolak zijn beschermd, worden tijdens het etsen van het ITO verwijderd. Tot slot wordt alle resterende fotolak in aceton verwijderd om onze ITO-elektroden te vormen. Hier is het stroomdiagram van de resterende drie stappen.

Eerst gaan we het gehele oppervlak modificeren met peg cylin. Dit maakt het oppervlak anti-fouling, waardoor er geen cellen of eiwitten aan zullen binden. Vervolgens gebruiken we elektrochemie om peg cylin specifiek te desorberen van de twee elektroden die we eerder hebben gemaakt.

Ten slotte gaan we fibroblasten op het oppervlak incuberen, waarbij ze selectief alleen aan de stripgebieden zullen binden. We zijn nu klaar om met ons experiment te beginnen. De eerste stap omvat fotolithografie, die in een cleanroom zal worden uitgevoerd.

Laten we nu de cleanroom binnengaan. We zijn nu in de cleanroom. Voordat we met het experiment beginnen, zullen we onze met indiumtinoxide of ITO gecoate monsters bakken bij 200 °C in onze oven.

Op deze manier kunnen we al onze oppervlakken dehydrateren. Nadat we het hebben gebakken bij 200 °C, plaatsen we het op de spincoater om de photoresist aan te brengen. Na het dehydrateren van ons ITO-substraat nemen we dit en plaatsen we het op de houder van de spincoater.

Dit boorklem is precies groot genoeg om een kwart van een glazen lamp vast te houden. Vervolgens gaan we vacuüm aanbrengen. Daarna brengen we een positieve fotoresist aan op het substraat.

Na het aanbrengen van de fotolak kunnen we beginnen. Dit proces bestaat uit twee stappen. De eerste stap is het verspreiden, en de tweede is het spin-coaten tijdens de verspreidingsstap.

De houder roteert met 800 RPM, waardoor de fotoresist gelijkmatig over het gehele oppervlak wordt verspreid. Vervolgens volgt de spin-stap bij 4.000 RPM, waarbij een zeer dunne laag wordt gevormd. Met dun bedoel ik ongeveer one micron.

Als we het woord fotolak (photoresist) ontleden, krijgen we 'foto' en 'resist'. Het wordt geactiveerd door licht. Daarom werken we in een cleanroom en gebruiken we gefilterd licht, zodat onze fotolak niet door het licht wordt geactiveerd. Daarnaast is het bestand tegen etsmiddelen, een eigenschap die we later zullen benutten tijdens het etsen.

Nu het spin-coaten is voltooid en de fotolak op het oppervlak is aangebracht, halen we het monster eruit en gaan we over naar de volgende stap. Nadat het monster gedurende 1 minuut en 45 seconden is gebakken, halen we het van de warmteplaat en plaatsen we het in onze Cannon mask aligner. Hier nemen we het benodigde masker en plaatsen we dit bovenop ons substraat; om contactdruk te creëren tussen het substraat met fotolak en het masker, plaatsen we er een glazen wafer van 4 inch bovenop om extra gewicht toe te voegen.

Zodra we hiermee klaar zijn, plaatsen we de sluiter terug en stellen we het monster bloot aan UV-licht. Wanneer de belichting voltooid is, verwijderen we het deksel in omgekeerde volgorde. We halen de glazen wafer en het masker eruit, waarna we het substraat verwijderen en meenemen voor de ontwikkeling.

Nadat het monster is belicht, plaatsen we het in een ontwikkelaarshoplossing. Wanneer het monster aan UV-licht is blootgesteld, zijn er waterstofionen gevormd, die zijn geneutraliseerd door de base en de ontwikkelaarshoplossing en daadwerkelijk van het oppervlak zijn verwijderd. Zorg er daarom voor dat u het substraat constant beweegt terwijl u het monster bewerkt.

En wanneer u dat doet, kunt u in de eerste minuut of anderhalve minuut zien dat de blootgestelde gebieden daadwerkelijk worden geëtst en van het oppervlak worden verwijderd. Om een volledige ontwikkeling te bewerkstelligen, laten we het ongeveer vijf minuten in de ontwikkelaarsoplossing zitten. Nadat de ontwikkeling is voltooid, halen we het eruit, wassen we het met DI-water en drogen we het vervolgens met een stikstofpistool.

Zodra we ons monster hebben gedroogd, gaan we het overbrengen en visualiseren onder onze microscoop. Hier bekijken we het monster onder een microscoop. We hebben het zojuist uitgenomen na een ontwikkeltijd van vijf minuten.

Er zijn hier twee gebieden te zien: een donkerder gebied dat bedekt is met fotolak en een lichter gebied waar de fotolak is verwijderd. In relatie tot het masker dat we eerder hebben gebruikt, waren de donkere gebieden op het masker de donkere gebieden die we nu onder de microscoop zien, terwijl de heldere gebieden die we hier zien, transparant waren op het masker. Een van de ontwerpen die hier getoond worden, bestaat uit arrays van verschillende maten variërend van 500 tot 50 µm, terwijl het andere ontwerp bestaat uit 1000 µm cirkels die met elkaar verbonden zijn.

Hier hebben we een ander ontwerp dat met dezelfde procedure is gemaakt. Hier beschikken we over individueel adresseerbare elektroden. Wat ik daarmee bedoel, is dat verschillende ITO-gebieden met elkaar verbonden zijn en verschillend geactiveerd kunnen worden.

Hier zijn bijvoorbeeld de centrale cirkelvormige gebieden verbonden met één elektrische pad, terwijl de buitenste rechthoekige gebieden verbonden zijn met een andere elektrische pad. Op deze manier kunnen we deze twee verschillende oppervlakken op verschillende tijdstippen stimuleren. Nadat we onze monsters hebben bekeken, is de volgende stap het etsen van het monster.

Alle regio's die niet door de foto's zijn beschermd, zullen tijdens een ITO-etsing worden weggeëtst. Voordat we hiermee beginnen, moeten we ervoor zorgen dat we geschikte kleding dragen, aangezien ITO-etsvloeistof zuren bevat. Nu ik mijn zuurbestendige jas aan heb en mijn gelaatsscherm heb opgezet, ga ik wat ITO-etsvloeistof in een glazen bekerglas gieten.

Het etsmiddel voor ITO bestaat uit 20% waterstofchloride, 5% salpeterzuur en de rest is gedestilleerd water. Breng vervolgens het monster over en plaats het in het etsmiddel. Eerder hebben we onder de microscoop gezien dat er enkele regio's waren die niet beschermd waren door fotoreziest.

De zuren in het ITO-etsmiddel tasten deze gebieden aan, waardoor het ITO uit die gebieden wordt weggeëtst. Terwijl het ITO langzaam van het oppervlak degradeert, verandert het van kleur. Hier is te zien dat de oorspronkelijke blauwachtige kleur is veranderd in deze paarsachtige kleur, en dat deze nu overgaat naar een gele kleur.

De kleurverandering geeft aan dat het ITO wordt weggeëtst. We zijn nu bij 15 minuten. Al het ITO is volledig weggeëtst.

Wat u nu ziet zijn foto's van de beschermde ITO-regio's. Nadat het etsen is voltooid, blijven er nog enkele zuren op het oppervlak achter. Om deze zuren te verwijderen, plaatsen we het in een natriumcarbonaatoplossing, die al het zuur zal neutraliseren.

Na het neutraliseren van de zuren halen we het uit de oplossing, reinigen we het met DI-water en drogen we het vervolgens met stikstof. Hiermee is het zuuretsen voltooid. Er is geen zuur meer aanwezig, dus ik kan mijn beschermende jas uittrekken.

We halen het eruit, brengen het over en visualiseren het onder onze microscoop. We observeren nu het monster onder de microscoop. Dit is nadat we het ITO-etsen hebben uitgevoerd.

In dit geval zijn de donkere gebieden glasgebieden waarvan het ITO is weggeëtst. En de lichtere gebieden zijn ITO dat in dit geval is beschermd door fotolak. Opnieuw zijn dit de arrays van 500 tot 50 micron en in het andere geval hebben we onze onderling verbonden cirkels van elk duizend micron.

We hebben zojuist onder de microscoop gezien dat er glasgebieden en ITO-gebieden waren, waarbij de ITO-gebieden waren beschermd door fotolak. Nu moeten we deze fotolak verwijderen. Hiervoor plaatsen we het substraat in aceton en zetten we dit vervolgens in de ultrasoonreiniger om het gedurende 10 minuten te soniceren.

Dit zorgt ervoor dat alle fotolak wordt verwijderd; u zou dit alleen met oplosmiddelen kunnen doen, maar door middel van sonificatie, waarbij geluidsgolven worden gebruikt, wordt gewaarborgd dat de fotolak correct wordt verwijderd. Na het uitnemen uit het sonische bad wordt het gewassen in DI-water, opnieuw gedroogd met stikstof, en nu zijn de patronen duidelijk zichtbaar op het glazen substraat. Dit waren de patronen die aanvankelijk door de fotolak waren beschermd.

Nu we onze monsters hebben bekeken en onze ITO-patronen hebben gevonden of gemaakt, gaan we beginnen met de tweede fase van het experiment. Deze fase omvat de modificatie van het oppervlak met een zelfgeassembleerde monolaag van PEG-cycline. Maar voordat we dat doen, moeten we er zeker van zijn dat het oppervlak reactief is.

Om dit te doen, plaatsen we het in een plasmareiniger. Dit introduceert hydroxylgroepen op het oppervlak en maakt het daardoor reactief. Hiervoor plaatsen we simpelweg ons monster in de plasmareiniger en schakelen we vervolgens de vacuümpomp in.

We zetten de zuurstof aan en schakelen de hoofdvoeding in. Deze stroom wordt gebruikt om het zuurstofgas om te zetten in plasma, dat vervolgens wordt geïntroduceerd en zo de hydroxylgroeven vormt. Zodra de voeding is ingeschakeld, drukken we op start.

Nadat het proces is voltooid, halen we het substraat eruit, bewaren we het in een schaaltje, verlaten we de cleanroom, trekken we de kleding uit en gaan we door naar de volgende stap. Nu we de cleanroom hebben verlaten en het ideale patroon hebben aangebracht, gaan we het oppervlak dat we zojuist hebben gepatroneerd modificeren met polyethyleenglycol-silane, PEG-silane. Het is essentieel om te weten dat PEG-silane reactief is voor vocht.

Daarom moet alles wat we gebruiken, inclusief het hout, vrij zijn van vocht. Het glaswerk dat we hier hebben gebruikt, de petrischalen, zijn gedurende een nacht gebakken op 100 °C. En het toluène dat we als oplosmiddel gaan gebruiken, is ook anhydrisch.

Het bevat geen vocht. Nu ga ik wat watervrij tolueen in beide glazen bekerglazen gieten, waarvan één ons monster bevat. We moeten nu twee petrischalen gebruiken, omdat we in één daarvan de modificatie gaan uitvoeren.

En de andere gaan we later gebruiken, wanneer de modificatie is voltooid, om ons substraat daadwerkelijk mee te wassen. Nadat we ze in onze glazen petrischalen hebben geplaatst, neem ik ze mee en breng ik ze over naar onze sluiskamer hier in de glovebox. Na het sluiten van de sluiskamer gaan we stikstof in de kamer brengen.

De hoofdkamer is hier al gevuld met stikstof. Daarom willen we deze kamer niet openen, tenzij deze met stikstof is gevuld. Zodra beide kamers met stikstof zijn gevuld, zullen we al onze monsters overbrengen met behulp van een pipet.

We hebben een pinnetje en een pincet die we later zullen gebruiken om de monsters over te plaatsen. We trekken onze handschoenen aan, openen de kamer en halen vervolgens langzaam en voorzichtig alles uit de luchtsluis om het in de hoofdkamer te plaatsen. Dit is de Petrischaal met ons substraat en de Petrischaal met enkel tolueen die we voor het wassen zullen gebruiken.

De aanwezige pxi is verpakt onder stikstof en u mag deze fles niet openen tenzij u zich in een stikstofomgeving bevindt. Daarom plaatst u de fles direct terug in de zak zodra u het monster heeft ontnomen. Neem vervolgens uw cilinder; de concentratie die we gaan gebruiken is 2% in tolueen.

Neem het eruit, plaats het in de PBS en meng het. We gebruiken hiervoor ook de kamer en zorgen dat het goed gemengd is, en laten het monster vervolgens twee uur incuberen in PBS. Nu die twee uur zijn verstreken en ons monster in PBS heeft gezeten, halen we het monster eruit en dragen we het over naar een verse PBS-oplossing waarin we het kortstondig wassen, het voorzichtig bewegen en het vervolgens naar onze luchtsluiskamer verplaatsen.

Zodra het zich in onze luchtsluisbehuizing bevindt, openen we simpelweg de behuizing om ons gemodificeerde oppervlak eruit te halen, waarbij we de stikstofpistool kunnen gebruiken. We plaatsen het opnieuw in een schone, droge Petrischaal en plaatsen het vervolgens in een oven op 100 °C voor nog eens twee uur. Nu de monsters twee uur lang op 100 °C in de oven zijn gebakken, gaan we de draden bevestigen aan de elektroden die we hebben voorbereid.

Dit doen we door een een-op-een mengsel te maken van zilverepoxy en een uithardingsmiddel. Dit is de zilverepoxy, en nu voegen we dezelfde hoeveelheid uithardingsmiddel toe. We mengen dit goed en vervolgens gebruiken we dit om onze draden te bevestigen.

Vervolgens plaatsen we onze draad op de elektroden die we willen gebruiken en fixeren we deze. Solderen werkt niet op ITO, daarom moeten we zilver-epoxy en het uithardingsmiddel gebruiken. Daarna bakken we het geheel, zodat al het eerder gebruikte uithardingsmiddel wordt verwijderd en het geheel hard wordt, waardoor we het als elektrode kunnen gebruiken.

Nu we twee fasen hebben voltooid, gaan we beginnen met de derde fase van het experiment, namelijk het uitvoeren van het elektrochemische gedeelte. Hiervoor nemen we een monster en plaatsen dit in onze elektrochemische cel. Nadat we het in de elektrochemische cel hebben geplaatst, plaatsen we een O-ring erbovenop.

Hiermee wordt het gebied geïsoleerd waar de elektrochemie zal plaatsvinden, en vervolgens zullen we de cel afsluiten. Ik heb mijn monster met de bevestigde draad in de elektrochemische cel geplaatst. Nu ben ik klaar om de potentiostaat te gebruiken om de spanning aan te leggen.

Ik ga de witte draad hier bevestigen aan de referentie-elektrode, de rode aan de tegenelektrode en tenslotte de groene draad aan onze werkelektrode. Zodra al deze elektroden zijn bevestigd, voeg ik een 1x oplossing van fosfaatgebufferde zoutoplossing of PBS toe aan de elektrochemische cel zelf. Om dit te verduidelijken: de volledige oppervlakte is op dit moment gemodificeerd met pxi.

Alle elektroden, inclusief de omliggende glasregio's, zijn dus gemodificeerd met pxi. Zodra ik overal de spanning aanleg waar ITO aanwezig is, wat de door ons gemaakte elektrodeontwerpen zijn, zal het peg-eiland alleen van die oppervlakken loskomen en zal er niets in de omliggende regio's worden beïnvloed. Hierdoor verwijderen we selectief het peg-eiland van ons substraat.

Ik ga nu op afspelen drukken, waardoor er een spanning van -1,4 V op onze werkelektrode wordt gezet. Zodra de spanning is aangelegd, is er een kleurverandering zichtbaar op de elektroden. Deze verandert van de transparante groenblauwe tint die we hadden naar bruin.

Wij vermoeden dat er een oxidatiereactie bij de elektroden kan plaatsvinden die ervoor zorgt dat deze bruin worden. Dit is ook een van de indicatoren dat de pxi inderdaad van het oppervlak is gestript. En nogmaals: overal waar u bruin ziet, is de peg-island verwijderd.

En de omliggende glazen regio's hebben nog steeds PXI die erop is gemonteerd. Daarom brengen we een spanning van -1,4 W gedurende 60 seconden aan. Dit geeft voldoende tijd om alle aanwezige PXI op de elektroden te verwijderen.

We kunnen deze methode ook gebruiken om elektroden te strippen die individueel worden geadresseerd. In dit geval waren er drie rijen cirkels die gestript zouden worden. We kunnen selecteren welke we willen strippen door gebruik te maken van alle drie de verschillende elektroden.

We hebben nu het derde deel van de elektrochemie succesvol afgerond, waarbij we het PG-silaan selectief van onze ITO-elektroden hebben verwijderd. Ik heb deze kort gewassen met PBS en gedestilleerd water, de draad verwijderd en de monsters in reguliere platen met zes putjes geplaatst. We gaan nu verder met het kweken van cellen op deze elektroden.

We bevinden ons nu in de kamer voor weefselkweek. Voor de laatste fase van het experiment gaan we vandaag fibroblasten gebruiken, 3T3-cellen. De concentratie die we gebruiken om de cellen uit te zaaien ligt tussen 0,5 en 1,5 miljoen cellen per ml.

Na het uitzaaien van de cellen laten we de cellen ongeveer 20 minuten op ons monster rusten. Dit geeft ze voldoende tijd om zich aan de gestripte regio's te hechten. Daarom plaatsen we het in de incubator.

Er zijn nu 20 minuten verstreken en we zijn klaar om naar de cellen te kijken die zich hebben gepositioneerd op de gestripte ITO-regio's, de bruine regio's die we eerder hebben gezien; ze binden uitsluitend specifiek aan die regio's en hechten nergens buiten deze gebieden aan. Hier is te zien dat de bruine regio's de ITO-regio's waren die waren gestript van pxi. Door middel van elektrochemie zijn de cellen alleen aan deze bruine regio's gehecht en niet aan de omliggende glasregio's.

In dit andere frame zien we opnieuw dat cellen zich hechten aan de gestripte regio's. Dat zijn de bruine regio's, maar boven die bruine regio's is nauwelijks te zien dat de PEG van dit ITO-ontwerp niet is verwijderd, waardoor er geen cellen aan zijn gehecht. Oké, dat is alles.

Het protocol is voltooid en de cellen vormen een patroon op de ITO-elektroden, wat precies is wat we wilden. Ik heb u zojuist getoond hoe de celadhesie op microgefabriceerde, optisch transparante indiumtinoxide-elektroden kan worden gecontroleerd. Vandaag heb ik u laten zien hoe u drie fibroblasten op deze elektroden kunt patroneren.

We hebben dezelfde procedure ook gebruikt om Hep G2-cellen, satellietcellen en primaire ratcellen te patroneren. Huidige technieken voor celpatronering maken slechts de assemblage van twee celtypen op het oppervlak mogelijk. De flexibiliteit van deze techniek zal in de toekomst de assemblage van meerdere, ruimtelijk geïsoleerde celtypen op het oppervlak mogelijk maken.

We zijn van plan deze techniek te gebruiken om drie verschillende leverceltypen ruimtelijk te isoleren op het ITO-substraat, om zo de in vivo micro-omgeving na te bootsen. Door dit te doen, kunnen we onrijpe cellen of stamcellen ruimtelijk scheiden van rijpe cellen en ondersteunende cellen. Dit zal een instructieve omgeving creëren voor de onrijpe cellen om te groeien en te differentiëren.