Verwerping van Fluorescentie Achtergrond in Resonance en spontane Raman Microspectroscopie

Het doel van deze procedure is het construeren van een volledig optische poort die Raman-verstrooid licht doorlaat terwijl fluorescentiesignalen worden geweerd. Dit wordt bereikt door eerst de Raman-verstrooiing te exciteren en te polariseren. De tweede stap van de procedure is het voorbereiden van de pompbundel om de poort te bedienen.

Ten derde moeten de pomp, de ram en de pulsen worden afgesteld zodat ze elkaar overlappen. De laatste stap van de procedure is het verkrijgen van tijdspoortspectra. Uiteindelijk kunnen resultaten worden behaald die biochemische kwantificering en classificatie aantonen via analyse van Raman-signalen met een hoge signaal-ruisverhouding.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals het softwarematig verwijderen van de fluorescentieachtergrond, is dat de shotruis die door de fluorescentie wordt veroorzaakt, aanzienlijk wordt verminderd. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van cruciale vragen in de biologische en biomedische vakgebieden, zoals de niet-invasieve karakterisering van de chemische samenstelling van endogene fluorforen in bacteriële cellen en weefsels, en het begrijpen van cellulaire processen en ziekten, zoals kanker, vasculaire of neurodegeneratieve aandoeningen, door gebruik te maken van intrinsieke markers. Deze methode kan daarnaast bijdragen aan de ontwikkeling van nieuwe probes die zowel als fluorescentie- als RAM-labels kunnen worden gebruikt, evenals aan niet-invasieve medische sensoren voor bloedanalyse.

Hoewel deze methode inzicht kan bieden in biologische systemen voor de biomedische techniek, kan deze ook worden toegepast op andere vakgebieden, zoals biobrandstofonderzoek of de telecomindustrie. Biologische monsters worden doorgaans geplaatst op een dekglas met dikte nummer één, gemonteerd in een ATO Fluor-celkamer.

Vloeibare monsters, in het bijzonder die welke toxisch zijn voor mensen, worden geplaatst in een klein glazen flesje met een dekglas dat met siliconenepoxy aan de opening is vastgelijmd; dit wordt vervolgens omgekeerd voor meting. Plaats de monsters op het secundaire platform dat bovenop de microscooptafel is gemonteerd en dat over een eigen onafhankelijke focusregeling beschikt om tijdpoort-raman-spectra op te nemen. Ten eerste moet de excitatiestraal correct worden voorbereid. Begin met licht dat voortkomt uit een instelbare gepulste GI-saffierlaser van 2,4 watt. Elke puls in de 80 megahertz pulstrein moet een energie van 30 nano joules hebben, een temporele breedte van 140 femtosecond en een spectrum gecentreerd op 808 nanometers met een spectrale bandbreedte van ongeveer zes nanometers. Om te voorkomen dat terugreflecties de laserholte opnieuw binnendringen, moet het licht door een Faraday-isolator worden geleid. Plaats een halve-golfplaat vóór de Faraday-isolator om continue afstemming van het totale vermogen dat naar het systeem wordt gestuurd mogelijk te maken.

Omdat een bandbreedte van zes nanometer te breed is om de meeste ramen-modi te kunnen onderscheiden, wordt de bundel door een zeer nauwe banddoorlaatfilter gestuurd. Stel deze in op 808 nanometer. Gebruik vervolgens een aromatisch dubbellet om het licht te focussen op een vijf millimeter bèta-bariumboor-kristal.

Gebruik een kristal om de golflengte te halveren van 808 nanometer naar 404 nanometer. Plaats het bètabariumboraatkristal in een houder met tip- en tiltregelingen, gemonteerd op een translatiepodium. Om de efficiëntie van de golflengteconversie te maximaliseren, moet het kristal precies symmetrisch ten opzichte van het brandpunt van het dubbelvoudig lensstelsel worden geplaatst, met de kristalas uitgelijnd op de polarisatie van de inkomende bundel.

Omdat de efficiëntie van de golflengteconversie polarisatieafhankelijk is, kan de hoeveelheid licht die naar het monster wordt gestuurd worden geregeld door een tweede halve-golfplaat na de Faraday-isolator te plaatsen. Door deze golfplaat te draaien, kan de intensiteit van het licht naar het monster onafhankelijk van de intensiteit van de pompstraal worden aangepast. Het golflengte-geconverteerde licht wordt vervolgens opnieuw gecollimeerd door een tweede achromatische dublet, gekozen zodanig dat de excitatiestraal groot genoeg is om de achteropening van het microscoopobjectief te vullen, en wordt via twee stuurspiegels in een geïnverteerde microscoop geleid.

Het objectief van de microscoop definieert de optische as, waarlangs de excitatiebundel wordt uitgelijnd. Plaats een spiegel in het monsterplane van de microscoop. De twee stuurspiegels worden vervolgens iteratief afgesteld terwijl de teruggekaatste laserbundel wordt geobserveerd op een CCD-camera die is bevestigd aan de beeldpoort van de microscoop.

Uitgaande van het feit dat het beeld op de camera gecentreerd is op het gezichtsveld van de microscoop, bevindt de bundel zich op de as. Wanneer de brandpuntsvlek gecentreerd is op de chip van de microscoop en de translatie van het objectief langs de Z-as geen verandering teweegbrengt. Het middelpunt van de defocused beam ramen scattering treedt op wanneer het monster in het monsterplan wordt geplaatst en wordt bestraald met laserlicht.

Een dichroïsch filter dat onder het microscoopobjectief is geplaatst, scheidt het Raman-verstrooide licht van de excitatiebundel en geleidt het Raman-verstrooide licht naar de zijpoort van de microscoop. De microscoop is aangepast om alle lenzen in dit pad te verwijderen, zodat het signaallicht uit de microscoop komt omdat de signaalbundel die de microscoop verlaat groter is dan de vrije opening van de afdichting.

Thompson-polarisatoren, een 0,47 keer telescoop bestaande uit twee aromatische dubletten, worden gebruikt om de bundel te verkleinen. Het signaallicht wordt vervolgens gepolariseerd door een gland Thompson-polarisator die onder nul graden ten opzichte van de verticale as in het laboratoriumframe is georiënteerd, en wordt geleid naar een dichroïsche spiegel waar het wordt gecombineerd met de pompbundel. De pompbundel wordt gestuurd naar een vertragingslijn bestaande uit twee spiegels die loodrecht op elkaar staan, beide geplaatst op een lineaire translatietafel die kan worden afgesteld om de temporele overlap van de pomp- en signaalpulsen te waarborgen.

Na de vertragingslijn wordt de bundel door een halve-golfplaat en een polarisator gestuurd die onder een hoek van 45 graden ten opzichte van de verticale as in het laboratoriumframe zijn georiënteerd. Dit waarborgt de juiste polarisatietoestand van de pompbundel wanneer deze het niet-lineaire medium bereikt. Het licht wordt vervolgens gereflecteerd door twee stuurspiegels, waarvan er één is voorzien van piëzo-elektrische bediening; deze dient te worden gebruikt om de positie van de pompbundel definitief af te stellen, zodat deze ruimtelijk overlapt met de signaalbundel.

Om deze overlap te verkrijgen, worden de pomp- en signaalstralen op twee locaties geobserveerd, één dicht bij en één ver van de dichroïsche spiegel waar de stralen worden gecombineerd. Door de eerste stuurspiegel te gebruiken om de twee stralen op het nabije punt te laten overlappen en de piëzospiegel om de stralen op het verre punt te laten overlappen, kan de pompstraal exact collineair worden gemaakt met de signaalstralen. Vervolgens moet het collimatie- en verzamelsysteem worden ingesteld om het verzamelde tijdgestuurde signaal te maximaliseren. Hiervoor worden de pomp- en signaalstralen eerst door een dichroïsch filter geleid met een OD van zes bij 404 nanometers om te voorkomen dat residueel excitatielicht excitatie en verstrooiing binnen het niet-lineaire medium veroorzaakt.

De pomp- en signaalbundels worden vervolgens door een aromatisch dubbellet gefocust in een kwartscuvet met een padlengte van één centimeter die het niet-lineaire materiaal bevat; elk niet-lineair materiaal met een geschikt hoge niet-lineaire index en een geschikt korte temporele respons kan worden gebruikt. Voor deze experimenten gebruiken we koolstofdisulfide. Het licht wordt vervolgens opnieuw gecollimeerd door een tweede dubbellet met een brandpuntsafstand die identiek is aan die van het eerste.

De stralen worden vervolgens door een Glan-Thompson-analysator op een draaibare houder geleid, en daarna door een set absorptie- en interferentiefilters die gecombineerd een OD van 10 hebben bij 808 nanometer. Ten slotte wordt het signaallicht door een aromatisch dubbellensstelsel gefocust in een multimode optische vezel van 50 micron, waarbij de vezel is gemonteerd in een houder die translatie in X, Y en Z mogelijk maakt. De vezel wordt vervolgens gekoppeld aan een commerciële imaging-spectrograaf met een aangesloten CCD-camera om het verzamelsysteem uit te lijnen voor maximale signaalopvang, de analysator op nul graden in te stellen en een testmonster tolueen in het monsterplat te plaatsen; optimaliseer vervolgens het opgevangen Raman-signaal door de X-, Y- en Z-bediening van de vezelhouder aan te passen om een juiste ruimtelijke en temporele overlap van de pomp- en signaalstralen te waarborgen. Plaats een spiegel in het monsterplat van de microscoop.

Verwijder vervolgens het 404 nanometer filter uit het systeem. Draai de analyzer naar 90 graden, zodat de retro-gereflecteerde 404 nanometer straal naar de spectrograaf wordt gestuurd, waarbij de intensiteit zodanig wordt ingesteld dat de camera niet verzadigt. Draai nu, terwijl de pompstraal is uitgeschakeld, de analyzer om het getransmitteerde 404 nanometer signaal te minimaliseren.

Zet vervolgens de pompbundel weer aan en pas de vertragingstrap langzaam aan totdat de transmissie van het 404 nanometer licht begint te toenemen. Draai daarna iteratief aan de vertragingstrap, de piëzo-elektrische spiegel en de X-, Y- en Z-bedieningselementen van de vezel om het signaal te maximaliseren, aangezien de retro-gereflecteerde 404 nanometer bundel en het Raman-verstrooide licht mogelijk iets verschillende paden door het systeem volgen. Voer de laatste afstellingen uit door een sterke Raman-verstrooier, zoals tolueen, op de monsterhouder te plaatsen, het Raman-filter te vervangen en de uitlijning licht bij te sturen door de vertragingstrap, de piëzo-elektrische spiegel en de X-, Y- en Z-bedieningselementen van de vezel aan te passen om het Raman-signaal te optimaliseren.

Nu is het systeem klaar om spectra te verzamelen. Hiervoor moeten eerst enkele achtergrondcurven worden opgenomen om systeemartefacten te corrigeren. Begin met de analyzer ingesteld op nul graden, de excitatiebundel aan en de pompbundel uit.

Verkrijg een spectrum zonder gating, stel vervolgens de analyzer in op 90 graden en verzamel een achtergrondspectrum dat het strooilicht vertegenwoordigt dat door de polarisatoren lekt. Zet daarna, terwijl de analyzer op 90 graden blijft staan, de ramenstraal uit en de pompstraal aan. Verzamel een tweede achtergrondspectrum dat de hoeveelheid pomplicht vertegenwoordigt die door de dichroïsche filters lekt.

Verzamel tenslotte, terwijl alle lasers zijn uitgeschakeld, een basislijn-donkerspectrum dat het donkerstroomniveau van de camera en de elektronica vertegenwoordigt. Schakel daarna alle stralen in en verzamel een gated spectrum. Om het werkelijke spectrum van enkel het licht door de gate te verkrijgen, moeten de twee achtergrondspectra en het donkerspectrum van dit gated spectrum worden afgetrokken.

Hier zien we een schematisch diagram van het golvingssysteem. Het pad van de pompbundel is weergegeven als een doorgetrokken rode lijn, terwijl het SHG-pad is weergegeven als een doorgetrokken marineblauwe lijn. Het pad waar Raman en fluorescentie elkaar overlappen is in het groen weergegeven.

Terwijl het pad waar de fluorescentie tijdelijk is weggefilterd in geel wordt weergegeven. Hier zien we de ruwe spectra van coumarine opgelost in immersie-olie. De rode curve toont het spectrum dat is opgenomen terwijl de gate openstond, en de zwarte curve toont het spectrum dat is opgenomen met de analyzer ingesteld op minimale transmissie en een pompstraal toegepast.

De blauwe curve toont het spectrum dat is opgenomen met de analyzer uitgelijnd voor minimale transmissie en zonder toegepaste pompbundel, en de groene curve toont het spectrum dat is opgenomen met enkel de toegepaste pompbundel. Alle spectra zijn gladgestreken met een 11-punts derde-orde Savitzky-Golay filter. De gestreepte magenta lijnen geven het spectrale gebied aan dat wordt getoond in de volgende grafiek.

Hier zien we de spectra van coumarine opgelost in immersie-olie na aftrekking van de fluorescentieachtergrond. De rode curve is het spectrum waarbij de gate open is gehouden, en de blauwe curve is het gated spectrum. Het gated spectrum vertoont duidelijk de geconvolueerde piek bij een hoog golfgetal, kenmerkend voor oliën.

Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de laser eerst voldoende pulsenergie moet hebben om de ga aan te sturen, en dat het systeem een uiterst precieze ruimtelijke en temporele overlap van de twee pulsen vereist. Na het bekijken van deze video en het lezen van het bijgevoegde protocol, zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u de laserstraal kan scheiden in een excitatiestraal en een curve-straal, en hoe u deze twee stralen zowel ruimtelijk als temporeel kunt laten overlappen.

Hoe een Raman-signaal wordt geregistreerd via een spectrograaf en C, c, D, en hoe het Raman-signaal wordt gevisualiseerd en geanalyseerd. Vergeet niet dat werken met lasers extreem gevaarlijk kan zijn, en dat voorzorgsmaatregelen, zoals het dragen van een laserbril, altijd moeten worden getroffen tijdens het uitvoeren van deze procedure. Aanvullende veiligheidsregels zijn van toepassing op het gebruik van het niet-lineaire materiaal en op het gebruik van uw specifieke monster.