Detectie van post-translationele modificaties op native Intact Nucleosomen door middel van ELISA

Het algemene doel van deze procedure is om nauwkeurig de relatieve niveaus van post-translationele modificaties te bepalen binnen preparaten van totale cellulaire nucleosomen verkregen uit een miljoen cellen. Dit wordt bereikt door eerst hoogwaardige homogene culturen van zoogdiercellen te bereiden. Vervolgens worden kernen geïsoleerd uit de cellen door mechanische verstoring met een downs homogenisator en centrifugatie.

De volgende stap is om intacte nucleosomen te verkrijgen door het chromatine dat aanwezig is in de kernen te verteren en een reeks hypotone extracties uit te voeren. Ten slotte worden de nucleosomen ondervraagd met behulp van een ELIZA-assay met de juiste controles om specifieke post-translationele modificaties te identificeren. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de relatieve niveaus van specifieke modificaties die aanwezig zijn in nucleosoommonsters laten zien.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals western blotting en chromatine-immunoprecipitatie is dat een globaal beeld van een aantal nucleosoommodificatietoestanden gemakkelijk kan worden bepaald. De methode is veel gevoeliger en nauwkeuriger dan western blotting en kan in de meeste labs worden uitgevoerd die zijn uitgerust voor algemene moleculaire biologie-experimenten. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het stamcel- en epigenetica-gebied, zoals wat er gebeurt wanneer grote differentiatie- en herprogrammeringsgebeurtenissen plaatsvinden.

Om de procedure te beginnen, probeer eerst de cellen met drie milliliter trypsine per 15 centimeter plaat om vers trypsiniseerd te verkrijgen. Voeg 20 milliliter ijskoud PBS-butyraat toe. Breng de cellen over naar een 50 milliliter conische buis en centrifugeer de buis om de cellen te verzamelen bij 1000 RPM gedurende vijf minuten, aspireer het supernatant en voeg 10 milliliter ijskoud PBS-butyraat toe om de celsuspensie opnieuw te centrifugeren bij 1000 RPM gedurende vijf minuten.

Verwijder het supernatant en resuspendeer het cellenpellet in vier milliliter lyseerbuffer met proteaseremmers zoals beschreven in het schriftelijke protocol. Pipet vervolgens de cellen naar een A-type B-pestle down homogenisator op ijs down homogeniseer met 20 slagen. Breng vervolgens het homogenaat over naar een centrifugebuis op ijs.

Centrifugeer het monster gedurende 10 minuten bij 2000 G. Bij vier graden Celsius. Verwijder de supernaam, die het cytoplasmatische materiaal bevat en resus.

Suspendeer de pellet in twee milliliter ijskoud wasbuffer C Met proteaseremmers, plaats het resuspendeerde materiaal voorzichtig op een vijf milliliter 30% sucrosekussen in een koude centrifugebuis. Om de kernen te isoleren, centrifugeer gedurende vijf minuten bij 2.400 G in een zwenkbuis, de kernen zullen door het kussen migreren en cellulair puin blijft op het grensvlak. Na centrifugatie, verwijder voorzichtig alle vloeistofvolume en resuspendeer de kernen in 250 microliter ijskoud wasbuffer C met proteaseremmers, breng de kernen over naar een 1,5 milliliter microcentrifugebuis.

Om de isolatie van nucleosomen te beginnen, voeg drie microliter 0,1 molair calciumchloride toe aan de kernen en plaats deze in een hitteblok van 37 graden Celsius tot de temperatuur geëgaliseerd is. Voeg vervolgens twee eenheden micrococal nuclease toe in 10 microliter micrococal nuclease-buffer en incubeer gedurende 12 minuten bij 37 graden Celsius. Meng regelmatig met een pipettip.

Na de incubatie, stop de reactie met zes microliter 0,5 molair natrium E-D-T-A-P-H acht en plaats op ijs om af te koelen. Centrifugeer vervolgens het monster gedurende vier minuten bij 2000 G, gooi het snat weg en resuspendeer de pellet. In 300 microliter 0,2 millimolair natrium EDTA, incubeer het monster op ijs gedurende een uur met af en toe voorzichtig pipetten om te mengen.

Na een centrifugatie gedurende vier minuten bij 3000 G. Bij vier graden Celsius, verzamel het supernatant, dat de vrije nucleosomen bevat, in een nieuwe Fuge-buis en bewaar op ijs voor aanvullende nucleosomen resus. Suspendeer het pellet in 300 microliter 0,2 millimolair natrium EDTA zoals eerder en incubeer op ijs gedurende een uur met af en toe voorzichtig mixen.

Na de incubatie, centrifugeer het monster. Combineer vervolgens het resulterende snat met het resterende monster in de micro fuge-buis op ijs. Om de nucleosoom Eliza-assay te starten, laad een 96-well Eliza-plaat met een aflopende reeks van vijf tweevoudige seriële verdunningen van nucleosomen en coatingbuffer, beginnend met 0,1 microgram per 50 microliter in de bovenste put. Alle verdunningsreeksen moeten in drievoud worden geladen.

Vergeet niet putten met alleen coatingbuffer op te nemen als controles. Incubeer de plaat een nacht bij vier graden Celsius. Gebruik een plate washer om de platen te wassen met 200 microliter per put van 0,5%tussen 20 in PBS bij kamertemperatuur vier keer gedurende een totale tijd van 10 minuten.

Voeg nu 100 microliter per put blokkeringsoplossing toe en incubeer gedurende een uur bij kamertemperatuur op een rotator. Verwijder na de incubatie het blokkeringsbuffer door de omgekeerde plaat krachtig te schudden boven een gootsteen. Voeg vervolgens het verdunde primaire antilichaam toe in een volume van 50 microliter per put in een oplossing van 5%PSA in 0,05%tussen 20 in PBS. Incubeer de oplossing gedurende een uur op een rotator bij kamertemperatuur.

Na de incubatie met het primaire antilichaam, was de platen zoals eerder met behulp van de plate washer. Zodra de wasprocedure is voltooid, voeg 50 microliter per put van paardradischenperoxidase geconjugeerd secundair antilichaam toe, verdund in PBS met 5%BS, A en 0,5%20. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende een uur op een rotator. Was de platen vervolgens zoals eerder.

Gebruik de plate washer om de plaat te ontwikkelen. Voeg 50 microliter TMB Eliza-substraat toe aan elke put en incubeer gedurende 10 minuten. Bij kamertemperatuur worden de putten van de ELIZA-plaat blauw en de intensiteit is evenredig met de hoeveelheid nucleosoommodificaties die aanwezig zijn in elk.

Stop vervolgens de reactie.