Name: Detectie van post-translationele modificaties op native Intact Nucleosomen door middel van ELISA (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Leer nucleosoom ELISA (NU-ELISA) om post-translationele modificaties te detecteren op intacte nucleosomen uit zoogdiercellen. Deze gevoelige methode biedt een globaal beeld van chromatine-modificatiestatussen voor epigenetisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ontwikkeling van de NU-ELISA-methode werd ondersteund door NIH subsidie ​​RO1AG023687.

1. Zoogdiercelculturen NU-ELISA kan worden uitgevoerd op alle zoogdieren celtype dat kan worden gekweekt in cultuur. Wij geven de voorkeur tot matig voor te bereiden op grote hoeveelheden van de cellen, zodat nucleosomen kunnen worden geïsoleerd in voldoende hoeveelheid om een ​​aantal identieke geladen ELISA-platen voor te bereiden, zodat testen met verschillende antilichamen (Abs). De volgende cultuur schalen bieden voldoende materiaal: Voor muis embyronic stamcellen groeien een of twee 15 cm platen van cellen zonder feeder-cellen. Voor de fibroblasten, groeien 5 tot 10 cm 15 platen tot confluentie. 2. Isolatie van Kernen Opmerking: Alle stappen zijn op ijs met pre-gekoelde buffers, behalve waar aangegeven. <ol><li> Trypsinize cellen met 3 ml trypsine per plaat, combineren, en voeg 20 ml ijskoud PBS / butyraat. Centrifugeer bij 1000 rpm gedurende 5 minuten. </li><li> Resuspendeer de cellen in 10 ml PBS / butyraat en centrifugeer bij 1000 rpm gedurende 5 minuten. </li><li> Resuspendeer in 4 ml lysis buffer met proteaseremmers (Sigma-Aldrich P-8340). Dounce homogeniseren 20 slagen met type B stamper op ijs. </li><li> Centrifugeer bij 2000g gedurende 10 min bij 4 ° C. (Het supernatant bevat cytoplasma, wat niet nodig is voor dit protocol, maar het kan bewaard worden voor andere doeleinden worden indien gewenst). </li><li> Resuspendeer de pellet in 2 ml ijskoude wasbuffer C (met protease-remmers). </li><li> Laag de geresuspendeerde materiaal meer dan 5 ml 30% sucrose kussen, centrifugeer bij 2400G gedurende 5 minuten in een swingende emmer rotor. Kernen zal migreren door kussen, en het puin blijft in de interface. </li><li> Verwijder zorgvuldig alle vloeistof volume en resuspendeer de kernen in 250 ul ijskoude wasbuffer C + protease-remmers. </li></ol> 3. Isolatie van Nucleosomen door in situ Micrococcal Nuclease (MNase) Spijsvertering We maken gebruik van een procedure waarbij chromatine is in situ verteerd binnen de kernen door het inbrengen van MNase, gevolgd door een hypotone behandeling om vrij intacte nucleosomen rijden in het supernatant. <ol><li> Voeg 3 il 0,1 M CaCl 2 tot en met het monster. Zet in 37 ° C verwarmen blokkeren. Laat tot 37 ° C temperatuur te nemen. </li><li> Voeg 2 eenheden MNase (Micrococcal Nuclease, Sigma-Aldrich, opgelost in 2 units/10μl in MNase buffer), daarna voor incuberen bij 37 ° C gedurende 12 min, met frequente mixen met behulp van een pipet tip. </li><li> Voeg 6 pi van 0,5 M Na-EDTA, pH 8,0 om de reactie te stoppen. Leg op het ijs. </li><li> Centrifugeer bij 2000g gedurende 4 min, gooi supernatant. Resuspendeer de pellet in 300 ui 0,2 mM Na-EDTA. Op te slaan op ijs gedurende 1 uur af en toe lichtjes pipetteren. (Deze hypotone voorwaarden vrij nucleosomen te bevrijden van de kernen). </li><li> Centrifugeer bij 3000 g gedurende 4 minuten bij 4 ° C. Sla de supernatant, die gratis nucleosomen bevat, op het ijs. </li><li> Weer resuspendeer de pellet met 300 ul 0,2 mM Na-EDTA. Op te slaan op ijs gedurende 1 uur af en toe lichtjes pipetteren. </li><li> Centrifugeer bij 3000g voor 4min bij 4 ° C. Bewaar de supernatant en combineren met de eerste supernatans van stap 5. De resulterende mononucleosome preparaten kunnen worden gealiquoteerd en opgeslagen bij -80 ° C. </li></ol> Opmerking: De hoeveelheid chromatine kan ruw worden gekwantificeerd door het meten van absorptie bij 260 nm van een 10 ul monster toegevoegd aan 990 ul van water. A 260 = 10 (na correctie voor de 1 / 100 verdunning) komt overeen met ongeveer 1mg/ml van het chromatine. Ook tijdens de bovenstaande procedure, kunnen kleine monsters worden bewaard en later geanalyseerd op hun DNA inhoud aan de kwaliteit en de omvang van MNase ontsluitingen, die vooral moeten bevatten DNA van 146 bp in lengte te controleren. Laddering is een indicatie van onvolledige MNase spijsvertering. Let op: Fig.1 bevat een schematisch overzicht van de nucleaire isolement en MNase ontsluitingen stappen. 4. Nucleosoom-ELISA (NU-ELISA) We ontdekken PTMs over fracties die inheemse intact nuclesosomes die zijn geïmmobiliseerd op 96 well ELISA microtiterplaten. Voor elk monster, maken we een serie van 2-voudige verdunningen, en deze zijn voorzien op bronnen in drievoud. <ol><li> Coat MaxiSorp plaatjes gedurende een nacht bij 4 ° C met 50 ul / putje van de nucleosomen verdund in coating buffer. Suggesties voor seriële tweevoudige verdunningen van nucleosomen worden bereid uit de bovenste rij naar de onderste rij door het toevoegen van 0,1 ug, 0,05 ug, 0.025 ug, 0,0125 ug, 0,00625 ug, 0,00313 ug, 0,00156 ug, met een coating buffer alleen (0 ug chromatine) in de bodem rij. (Opmerking: plaat dekt zijn nodig voor deze stap.) </li><li> In de ochtend was de platen 4 keer met 200 ul / putje PBS/0.5% Tween-20 bij kamertemperatuur (RT) voor een totaal van 10 minuten met een plaat wasmachine. </li><li> Blok 1 uur bij RT met 100 ul / putje PBS/0.05% Tween-20 / 5% BSA. </li><li> Verwijder de blokkering buffer door schudden van de omgekeerde plaat flinkboven een gootsteen. Deksel en bewaar de platen bij -20 ° C, of ​​ga direct naar de volgende stap. </li><li> Voeg 1 ° Abs in een volume van 50 ul / well verdund 1:1000 (of zoveel als nodig) in PBS/0.05% Tween-20 / 5% BSA, incuberen bij KT 1 uur op een rotator. </li><li> Spoel de platen 4 keer met 200 pl / well PBS/0.5% Tween-20 in RT en voor een totaal van 10 min in een plaat wasmachine. </li><li> Voeg mierikswortel peroxidase (HRP)-geconjugeerd 2 ° Abs, verdund 1:5000 (of zoveel als nodig) in PBS/0.05% Tween-20 / 5% BSA bij RT voor een uur op een rotator. </li><li> Spoel de platen 4 keer met 200 pl / well PBS/0.5% Tween-20. Elke wasbeurt is bij kamertemperatuur en voor een totaal van 10 minuten met een plaat wasmachine. </li><li> Ontwikkelen van de platen door het toevoegen van 50 pi van TMB substraat aan elk goed voor 10 min bij RT. Stop de reactie door toevoeging van 50 ul / putje van 2N H 2 SO 4 en lees de platen 450 nm. (Tip: Centrifugeer bij 1500 rpm gedurende 2 minuten met behulp van een plaat rotor om eventuele luchtbellen in de putjes verdwijnen voorafgaand aan het lezen van absorptie). </li><li> Exporteer de metingen te spreadsheet bestanden voor kwantitatieve en statistische analyses. </li></ol> Reagentia <table border="1"><tbody><tr><td> PBS / butyraat </td></tr><tr><td> 135 mM NaCl </td></tr><tr><td> 2,5 mM KCl </td></tr><tr><td> 8 mM Na 2 HPO 4 </td></tr><tr><td> 1,5 mM KH 2 PO 4 </td></tr><tr><td> 10 mM Na-butyraat </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> Lysis Buffer </td></tr><tr><td> 250 mM sucrose </td></tr><tr><td> 10 mM Tris-HCl, pH 7,4 </td></tr><tr><td> 10 mM Na-butyraat </td></tr><tr><td> 4 mM MgCl 2 </td></tr><tr><td> 0,1% Triton X-100 </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> Wasbuffer C </td></tr><tr><td> 250 mM sucrose </td></tr><tr><td> 10 mM Tris-HCl, pH 7,4 </td></tr><tr><td> 10 mM Na-butyraat </td></tr><tr><td> 4 mM MgCl 2 </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> Sucrose Kussen </td></tr><tr><td> 30% (w / v) sucrose in wasbuffer C </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> Microccocal Nuclease Buffer </td></tr><tr><td> 5 mM NaPO 4 Buffer, pH 7,0 </td></tr><tr><td> 0,025 mM CaCl 2 </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> Coating buffer </td></tr><tr><td> 80 ml ​​Oplossing A + 170ml Oplossing B + 250ml dH 2 O </td></tr><tr><td> Oplossing A: 0,2 M Na 2 CO 3 </td></tr><tr><td> Oplossing B: 0.2 M NaHCO 3 </td></tr></tbody></table> 5. Representatieve resultaten Met behulp van de NU-ELISA methode, een reeks van verschillende identieke platen zijn bereid die kunnen worden geladen met chromatine opgesteld in de vorm van mononucleosomes. We meestal voor te bereiden serie van identiek-geladen platen, zodat elke kan worden afgetast met verschillende anti-PTM specifieke antilichamen (ABS). We hebben ook altijd voor te bereiden een plaat die kan worden gemerkt met een Ab die histon-eiwitten detecteert zonder te letten op hun wijziging staat in totaal chromatine het laden van controle. Deze controle is essentieel om later kwantitatief vergelijken PTM inhoud van de nucleosomen bereid uit verschillende monsters. Om kwantificeren de niveaus van PTMs binnen een bepaalde chromatine monster corrigeren we de ruwe absorptie waarden met behulp van deze aanpak: Ten eerste, trekken we elke achtergrond signaal met behulp van waarden die zijn verkregen van de controle putjes die geen chromatine (achtergrond is meestal te verwaarlozen). Vervolgens hebben we standaardiseren PTM-specifieke signalen naar NU-ELISA-resultaten van een identiek geladen plaat die werd getest met een Ab die nucleosomen onafhankelijk van hun wijziging staat detecteert. (We hebben polyklonale Abs specifiek voor histonen H2A H2B of voor dit doel). Vervolgens bepalen wij de middelen en varianties voor elke verdunning van chromatine en de gegevens die zijn verkregen uit het lineaire gedeelte van de ELISA-test. Gedetailleerde voorbeelden van NU-ELISA wiskundige en statistische analyses zijn eerder vier gemeld <img src="/files/ftp_upload/2593/2593fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Schematische diagam van de NU-ELISA stappen. A. zoogdiercellen zijn geoogst; B. Kernen worden gescheiden van de cellen door Dounce homogenization, C. Verstoorde cellen worden geladen op de top van een 30% w / v sucrose kussen, D. Na centrifugeren, worden kernen afgezet in de pellet, E, F. chromatine worden verteerd in situ overwegend mononucleomes door MNase, G, H , ik. Oplosbare mononucleosomes worden geëxtraheerd door hypotone behandeling en herhaaldelijk centrifugeren van de resterende nucleair materiaal. J. Mononucleosomes uit verschillende monsters (het label samp. 1 en 2 in dit geval) zijn bekleed microtiterputjes in serie van identiek-geladen platen en ondervraagd met PTM-specifieke Abs en PTM-onafhankelijke Abs aan de totale chromatine belasting te bepalen. K. Voorstelling van differentiële signaal detectie niveaus in twee steekproeven die verschillen in hun PTM inhoud, maar hebben soortgelijke algemene chromatine-inhoud, zoals beoordeeld door de anti-H2B immunoreactiviteit.

<ol><li>Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+nucleosome+core+particle+at+2.8+A+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution.</a> Nature. 389, 251-260 (1997).</li>
<li>Jenuwein, T., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+the+histone+code%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Translating the histone code.</a> Science. 293, 1074-1080 (2001).</li>
<li>Turner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+acetylation+and+an+epigenetic+code%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Histone acetylation and an epigenetic code.</a> Bioessays. 22, 836-845 (2000).</li>
<li>Dai, B., Rasmussen, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+epiproteomic+signatures+distinguish+embryonic+stem+cells+from+differentiated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Global epiproteomic signatures distinguish embryonic stem cells from differentiated cells.</a> Stem Cells. 25, 2567-2574 (2007).</li>
<li>Tanasijevic, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+accumulation+of+epigen+etic+heterogeneity+during+human+ES+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Progressive accumulation of epigen etic heterogeneity during human ES cell culture.</a> Epigenetics. 4, 330-338 (2009).</li>
<li>Thomas, J. O. Isolation and fractionation of chromatin and linker histones. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aThomas%2C+JO+%22Chromatin%3A+a+practical+approach%22">Chromatin: a practical approach</a>. Gould, H. , Oxford University Press. Oxford. 12-14 (1998).</li>
<li>Thorne, A. W., Cary, P. D., Crane-Robinson, C. Extraction and separation of core histones and non-histone chromosomal proteins. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aThorne%2C+AW+%22Chromatin%3A+a+practical+approach%22">Chromatin: a practical approach</a>. Gould, H. , Oxford University Press. Oxford. 38-39 (1998).</li>
</ol>

NU-ELISA is een methode om de wereldwijde status van nucleosoom PTMs aanwezig in een bepaald celtype vast te stellen. NU-ELISA studies hebben aangetoond dat de wereldwijde nucleosoom wijziging verklaart verschillen in vergelijkingen van verschillende celtypen 4. Daarnaast, NU-ELISA PTM-profielen te wijzigen wanneer de cellen worden blootgesteld aan epigenetische modulerende middelen zoals trichostatine-A of wanneer de muis embyronic stamcellen zijn gedifferentieerd 4. De methode is ook met succes toegepast op de chromatine van menselijke embryonale stamcellen 5 studiepunten. Het is belangrijk op te merken van de NU-ELISA, in de huidige vorm, kan alleen de composiet handtekening van PTMs aanwezig in de totale som van de cellulaire epigenoom op te sporen. Dit verschilt duidelijk van genoom-brede chromatine immunoprecipitatie, die de verdeling van een specifieke PTM over specifieke genetische loci kan bepalen. De eerste stappen van de NU-ELISA procedures worden aangepast van bovenstaande methoden om mononucleosomes isoleren van zoogdieren kernen 6,7. Deze aangepaste methoden geven een doelmatige manier om de hoge kwaliteit intact mononucleosomes te verkrijgen van zoogdiercellen, en de daaruit voortvloeiende fracties zijn uitgebreid in de chromatine inhoud, maar bevatten een veel extra nucleair materiaal. Aangezien de specifieke Abs worden gebruikt, is niet-vervuilende nucleosomale materiaal goed wordt verdragen in de NU-ELISA-test, in tegenstelling tot de massa-spec benaderingen die grotere zuiverheid nodig hebben. Echter, NU-ELISA is gevoeliger en kwantitatieve dan western blotting 4, en zo goede alternatieven voor westerns en de massa spec voor de detectie van nucleosomale PTMs.

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het serum </th><th> Vennootschap </th><th> Catalogus nummer </th><th> Reacties </th></tr><tr><td> Micrococcal Nucleae </td><td> Sigma </td><td> N3755 </td><td> Maak fracties van 2 U/10μl buffer, opgeslagen bij -20 ° C </td></tr><tr><td> Nunc MaxiSorp microtiterplaten </td><td> Visser </td><td> 12-565-135 </td><td> Zelfklevende plaat dekt kunnen ook besteld worden door middel van Fisher </td></tr><tr><td> Geautomatiseerde plaatwasser </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1-Step TMB-ELISA substraat </td><td> Doorboren </td><td> 34028 </td><td> Bewaren bij 4 ° C voor te verwarmen om RT vóór gebruik of zoals aangegeven op het specificatieblad </td></tr><tr><td> Microtiterplaat Reader </td><td> Bio-Rad microplaat reader (model: 680) </td><td></td><td> De meeste colorimetrische plaat lezer modellen zijn geschikt </td></tr></tbody></table>

detectie van post-translationele modificaties op native intact nucleosomen door middel van elisa

Detection of Post-translational Modifications on Native Intact Nucleosomes by ELISA

Het genoom van eukaryoten bestaat als chromatine die zowel DNA en eiwitten bevat. De fundamentele eenheid van chromatine is het nucleosoom, die 146 basenparen van DNA geassocieerd met twee elk van de histonen H2A, H2B, H3, H4 en 1 bevat. De N-terminale staarten van histonen zijn rijk aan lysine en arginine en zijn post-transcriptioneel gemodificeerd door acetylering, methylering, en andere post-translationele modificaties (PTMs). De PTM configuratie van nucleosomen kan invloed hebben op de transcriptionele activiteit van het DNA, en zo een manier van genregulatie dat epigenetische in de natuur 2,3. We ontwikkelden een methode genaamd nucleosoom ELISA (NU-ELISA) voor het kwantitatief bepalen wereldwijde PTM handtekeningen van nucleosomen uit cellen. NU-ELISA is gevoeliger en kwantitatieve dan western blotting, en is handig om het epiproteomic staat van specifieke celtypen te ondervragen. Deze video tijdschriftartikel toont gedetailleerde procedures uit te voeren NU-ELISA-analyse.

Nucleosoom ELISA (NU-ELISA) is een gevoelige en kwantitatieve methode om de wereldwijde patronen van post-translationele modificaties te detecteren in de voorbereiding van de inheemse, intacte nucleosomen. Deze wijzigingen zijn onder methylations, acetyleringen en fosforylaties op specifieke histon aminozuur residuen, en dus NU-ELISA geeft een globaal proteomics analyse van de totale chromatine modificatie staten van specifieke celtypen.

Detectie van post-translationele modificaties op native Intact Nucleosomen door middel van ELISA

Het genoom van eukaryoten bestaat uit chromatine, dat zowel DNA als eiwitten bevat. De fundamentele eenheid van chromatine is het nucleosoom, dat 146 ...

Het algemene doel van deze procedure is om nauwkeurig de relatieve niveaus van posttranslationele modificaties te bepalen binnen preparaten van totale cellulaire nucleosomen, verkregen uit een miljoen cellen. Dit wordt bereikt door eerst hoogwaardige homogene culturen van zoogdiercellen voor te bereiden. Vervolgens worden de kernen uit de cellen geïsoleerd via mechanische disruptie met een Dounce-homogenisator en centrifugatie.De volgende stap is het verkrijgen van intacte nucleosomen door het chromatine in de kernen te verteren en een reeks hypotone extracties uit te voeren. Tot slot worden de nucleosomen geanalyseerd met behulp van een ELISA-assay met de juiste controles om specifieke post-translationele modificaties te identificeren. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de relatieve hoeveelheden van specifieke modificaties in nucleosomenmonsters laten zien.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals western blotting en chromatine-immunoprecipitatie is dat een globaal beeld van een aantal nucleosoommodificatietoestanden gemakkelijk kan worden bepaald. De methode is veel gevoeliger en nauwkeuriger dan western blotting en kan worden uitgevoerd in de meeste laboratoria die zijn uitgerust voor algemene moleculair-biologische experimenten. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van stamcellen en epigenetica, zoals wat er gebeurt wanneer belangrijke differentiatie- en herprogrammeringsgebeurtenissen plaatsvinden.Om de procedure te starten, worden de cellen eerst getrypsiniseerd met drie milliliter trypsine per plaat van 15 centimeter om verse getrypsiniseerde cellen te verkrijgen. Voeg 20 milliliter ijskoude PBS butyraat toe. Breng de cellen over naar een conische buis van 50 milliliter en centrifugeer de buis om de cellen te pelletteren bij 1000 RPM gedurende vijf minuten; aspireer het supernatant en voeg 10 milliliter ijskoude PBS butyraat toe om te wassen. Centrifugeer de celsuspensie opnieuw bij 1000 RPM gedurende vijf minuten.Verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellet in vier milliliters lysisbuffer met protease-remmers, zoals beschreven in het schriftelijke protocol. Pipetteer de cellen vervolgens naar een homogenisator met een type B stamper op ijs en homogeniseer met 20 slagen. Breng het homogenisaat daarna over naar een centrifugebuis op ijs.Centrifugeer het monster bij 2000 G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Verwijder het supernatant, dat het cytoplasmatisch materiaal bevat, en resuspendeer.Suspendeer het pellet in twee milliliter ijskoud washbuffer C met protease-remmers en breng het resuspendeerde materiaal voorzichtig aan als laag over een kussen van vijf milliliter 30% sucrose in een koude centrifugebuis. Centrifugeer om de kernen te isoleren bij 2.400 G gedurende vijf minuten in een swinging-bucket rotor; de kernen zullen door het kussen migreren en celresten blijven op de interface. Verwijder na centrifugatie voorzichtig het volledige vloeistofvolume en suspendeer de kernen opnieuw in 250 microliter ijskoud washbuffer C met protease-remmers, waarna de kernen worden overgebracht naar een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter.Om te beginnen met de isolatie van nucleosomen, voegt u drie µL 0,1 M calciumchloride toe aan de kernen en plaatst u deze in een heatblock van 37 °C totdat de temperatuur is geëquilibreerd. Voeg vervolgens twee eenheden micrococcal nuclease toe in 10 µL micrococcal nuclease-buffer en incubeer dit gedurende 12 minuten bij 37 °C. Meng regelmatig met een pipetpunt.Stop na de incubatie de reactie met zes µL 0,5 M natrium-EDTA-pH 8 en plaats het op ijs om af te koelen. Centrifugeer vervolgens het monster 4 minuten bij 2000 ×g; verwijder na centrifugatie de supernatant en resuspendeer de pellet in 300 µL 0,2 mM natrium-EDTA. Incubeer het monster gedurende één uur op ijs, waarbij af en toe voorzichtig wordt gepipetteerd om te mengen.Na centrifugatie bij 3000 G gedurende vier minuten bij vier graden Celsius, wordt het supernatant, dat de vrije nucleosomen bevat, verzameld in een nieuwe centrifugebuis en op ijs bewaard voor later gebruik van extra nucleosomen. Suspendeer de pellet in 300 µL 0,2 mM natrium-EDTA zoals voorheen en incubeer dit gedurende één uur op ijs met af en toe voorzichtig mengen.Centrifuge het monster na de incubatie. Combineer de resulterende supernatant opnieuw met het resterende monster in de microcentrifugebuis op ijs. Om de nucleosoom-ELISA-assay te starten, vult u een 96-well ELISA-plaat met een aflopende reeks van vijf tweevoudige seriële verdunningen van nucleosomen en coatingbuffer, beginnend met 0,1 µg per 50 µL in de bovenste well; alle verdunningsreeksen moeten in triplikaat worden geladen.Vergeet niet om wells met alleen coatingbuffer als controles op te nemen. Incubeer de plaat overnacht bij vier graden Celsius tot de volgende dag. Gebruik een plaatwasser om de platen vier keer te wassen met 200 microliters per well van 0,5% Tween 20 in PBS bij kamertemperatuur, voor een totale duur van 10 minuten.Voeg nu 100 µL blokkeeroplossing per well toe en incubeer dit gedurende één uur bij kamertemperatuur op een rotator. Verwijder na de incubatie de blokkeerbuffer door de omgekeerde plaat krachtig boven een gootsteen te schudden. Voeg vervolgens de verdunde primaire antistof toe in een volume van 50 µL per well in een oplossing van 5% PSA in 0,05% Tween 20 in PBS en incubeer de oplossing gedurende één uur op een rotator bij kamertemperatuur.Was na de incubatie met het primaire antilichaam de platen zoals voorheen met de plaatwasser. Zodra de wasprocedure is voltooid, voegt u per put 50 µL toe van het met mierikswortelperoxidase geconjugeerde secundaire antilichaam, verdund in PBS met 5%BS, A, en 0.5%20. Na de incubatie met het secundaire antilichaam volgt een incubatie van één uur bij kamertemperatuur op een rotator. Was de platen zoals voorheen.Gebruik de plaatwasser om de plaat te ontwikkelen. Voeg 50 µL TMB Eliza-substraat toe aan elke put en laat dit 10 minuten incuberen. Bij kamertemperatuur zullen de putten van de ELIZA-plaat blauw kleuren en is de intensiteit proportioneel aan de hoeveelheid nucleosoommodificaties die in elke put aanwezig zijn.Stop vervolgens de reactie door 50 µL per well van 2N zwavelzuur toe te voegen. De kleur zal veranderen naar bruin; centrifugeer de plaat vervolgens 2 minuten bij 1500 RPM om eventuele luchtbellen te verwijderen.De plaat is nu klaar voor kwantificering op een colorimetrische platenlezer. Lees tot slot de plaat af bij 450 nanometer en exporteer de resultaten voor analyse. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in twee dagen worden voltooid indien deze na de ontwikkelingsfase correct wordt uitgevoerd.Deze techniek opende de deur voor onderzoekers in het veld van stamcelonderzoek om epigenetische responsen op differentiatie- en herprogrammeringsprocessen te onderzoeken op het niveau van het volledige epi-proteoom.

detection-post-translational-modifications-on-native-intact

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Ubiquitinatie is een belangrijke posttranslationele modificatie uitgevoerd door een set van drie enzymen. Mutaties van genen die betrokken zijn in deze wijziging worden geassocieerd met vele verschillende ziekten bij de mens. We beschrijven hier protocollen aan eiwit ubiquitinatie te detecteren in gekweekte...

Detectie van eiwit ubiquitinering

Door de combinatie van inheemse en verknopen van chromatine immunoprecipitatie met een hoge-resolutie massaspectrometrie, ChroP benadering stelt aan de samengestelde proteomics architectuur van histonmodificaties, varianten en niet-histonic eiwitten synergizing op functioneel verschillende chromatinedomeinen ontleden.

De ChroP aanpak combineert chip en massaspectrometrie te ontleden Locus-specifieke Proteomic Landschappen van Chromatin

Hier beschrijven we biochemische analyses die kunnen worden gebruikt om ATP-afhankelijke chromatine-hermodelleringsenzymen te karakteriseren op hun vermogen om 1) ATP-afhankelijk nucleosoomglijden te katalyseren, 2) te interageren met nucleosoomsubstraten en 3) ATP te hydrolyseren op een nucleosoom- of DNA-afhankelijke manier.

Biochemische assays voor het analyseren van activiteiten van de ATP-afhankelijke chromatine remodeling Enzymen

Dit protocol beschrijft een volledig geïntegreerde workflow voor het karakteriseren histon post-translationele modificaties met massaspectrometrie (MS). De workflow bevat histon zuivering uit celkweken of weefsels, histon derivatisering en de spijsvertering, MS analyse met behulp van nano-flow vloeistofchromatografie en instructies voor gegevensanalyse. Het protocol is ontworpen voor de voltooiing binnen 2-3 dagen.

Compleet Workflow voor Analyse van histon post-translationele modificaties Met behulp van Bottom-up Massaspectrometrie: Van Histon Extraction om Data Analysis

Dit protocol beschrijft de reconstructie van nucleosomen die differentieel-isotoop gemerkte zus histonen. Tegelijkertijd asymmetrisch post-translationeel gemodificeerde nucleosomen worden gegenereerd na het gebruik van een histon premodified kopie. Deze preparaten kunnen gemakkelijk worden gebruikt om wijzigingen crosstalk mechanismen bestuderen, gelijktijdig op beide zus histonen, met behulp van hoge-resolutie NMR-spectroscopie.

Reconstructie van Nucleosomen met Differentieel Isotopen-gelabelde Sister Histon

Presenteren we een effectieve en reproduceerbare methode om te isoleren en cultuur van neurale voorlopercellen van embryonale en postnatale hersenweefsel voor chromatine immunoprecipitation (ChIP) van Histon 3 lysine 79 dimethylation (H3K79me2) - een Histon mark gelegen binnen de bolvormige domein van Histon 3.

Isolatie en teelt van neurale progenitoren gevolgd door chromatine-Immunoprecipitation van Histone 3 Lysine 79 Dimethylation Mark

Het onderzoeken van meerdere, kunnen endogene posttranslationele modificaties voor een eiwit-doelstelling zeer uitdagend. De hier beschreven technieken gebruiken een geoptimaliseerde lysis buffer en filter systeem ontwikkeld met specifieke PTM-targeting, affiniteit matrices te sporen van de acetylation, ubiquitination, SUMOylation 2/3 en tyrosine fosforylering wijzigingen voor een doel eiwit met behulp van een enkele, gestroomlijnde systeem.

Met behulp van een uitgebreide Immunoprecipitation verrijking systeem ter identificatie van het profiel van een endogene posttranslationele wijziging voor Target eiwitten

Ubiquitination is een post-translationele modificatie die belangrijke rollen speelt in cellulaire processen en nauw gecoördineerd wordt door deubiquitination. Defecten in beide reacties ten grondslag liggen aan menselijke pathologieën. Wij bieden protocollen voor het uitvoeren van Ubiquitination en deubiquitinisatie reactie in vitro met behulp van gezuiverde componenten.

In vitro Ubiquitination en Deubiquitinisatie assays van Nucleosomale histonen

Het huidige protocol belicht een gemodificeerde methode voor het detecteren en kwantificeren van DNA-eiwit crosslinks (DPC's) en hun posttranslationele modificaties (PTM's), waaronder ubiquitylering, SUMOylation en ADP-ribosylatie geïnduceerd door topoisomeraseremmers en door formaldehyde, waardoor de vorming en reparatie van DPC's en hun PTM's kan worden bestudeerd.

Kwantitatieve detectie van DNA-eiwit crosslinks en hun posttranslationele modificaties

Een analytische workflow op basis van vloeistofchromatografie, mobiliteitsspectrometrie met ingesloten ionen en time-of-flight-massaspectrometrie (LC-TIMS-ToF MS/MS) voor een zeer betrouwbare en zeer reproduceerbare "bottom-up"-analyse van histonmodificaties en identificatie op basis van de belangrijkste parameters (retentietijd [RT], botsingsdoorsnede [CCS] en nauwkeurige massa-tot-lading [m/z]-verhouding).

Screening op histonmodificatie met behulp van vloeistofchromatografie, Trapped Ion Mobility Spectrometry en Time-Of-Flight Mass Spectrometry

Genetische varianten in menselijke Spindlin Family Member 4 (SPIN4) zijn recentelijk vastgesteld bij patiënten met botovergroei, een nieuwe ontwikkelingsstoornis. Een protocol en nieuwe resultaten die de biochemische identificatie van gemodificeerde histonen in de context van nucleosomen als SPIN4-bindende substraten beschrijven, worden gepresenteerd.

Identificatie van gemodificeerde histonen als bindende substraten van het menselijke Spindlin-familielid 4 (SPIN4) door middel van peptidearrays en native nucleosoompulldown

Leer nucleosoom ELISA (NU-ELISA) om post-translationele modificaties te detecteren op intacte nucleosomen uit zoogdiercellen. Deze gevoelige methode biedt een globaal beeld van chromatine-modificatiestatussen voor epigenetisch onderzoek.

Detectie van post-translationele modificaties op native Intact Nucleosomen door middel van ELISA

Meer video's verkennen