Een 1,5 uur Procedure voor de identificatie van Enterococcus Soorten Rechtstreeks van bloedkweken

Het algemene doel van deze procedure is het snel identificeren van enterokokkensoorten uit positieve bloedkweekflessen met behulp van peptide-nucleïnezuur-fluorescentie in situ hybridisatie. Zodra de bloedkweken zijn voorbereid en er een Gram-kleuring is uitgevoerd om de aanwezigheid van enterokokkenkweken te bevestigen, worden de monsters gefixeerd op PNA-FISH-microscoopglaasjes. De glaasjes worden vervolgens geïncubeerd met PNA-probes die specifiek zijn voor de organismen van belang.

Zodra de probes zijn gehybridiseerd, wordt er een stringente wasbeurt uitgevoerd om overtollige, niet-gehybridiseerde probes te verwijderen. Er wordt montage medium aan de coupes toegevoegd, waarna deze met dekglas worden afgedekt. De aanwezige enterococcus-soorten in het monster kunnen worden geïdentificeerd met fluorescentiemicroscopie.

Dit PNA Fish-identificatieprotocol is uniek omdat het een snelle en specifieke methode biedt voor de identificatie van enterococcus uit palsy. Bloedkweekmonsters van patiënten: Incubeer twee bloedkweekflessen, één aeroob en één anaeroob, met veneus bloed van een patiënt met vermoeden van sepsis in een geautomatiseerd bloedkweekapparaat bij 35 °C. Zodra het apparaat aangeeft dat er microbiële groei is gedetecteerd, neemt u de fles uit het apparaat en draait u de bloedkweekflessen voorzichtig rond om de bacteriën gelijkmatig te resuspenderen.

Overbreng vervolgens met een steriele spuit en naald aseptisch ongeveer vijf milliliter bloed van elke fles naar een aparte schroefdopbuis. Zodra alle monsters zijn verdeeld, gebruik dan een steriele pipet om een druppel bloed van elke buis op een aparte glazen microscoopglasplaatje over te brengen. Laat het glasplaatje ongeveer 15 minuten aan de lucht drogen.

Dompel het objectglas vervolgens in methanol om het monster te fixeren, zodra het glas volledig is opgedroogd. Nadat de objectglazen zijn gefixeerd, worden deze gewassen en volgt een standaard gramkleuring om de morfologie van de organismen in elke bloedkweek te bepalen. Onderzoek de gekleurde preparaten met een microscoop voorzien van een olie-immersieobjectief.

Een enterococcus-soort zal verschijnen als grampositieve coccen, gewoonlijk gerangschikt in paren of korte ketens. Plaats één druppel fixatieoplossing in de put van een p en een fish microscoopglas. Meng de buis met de te testen bloedkweek voorzichtig.

Breng vervolgens 10 µL van de cultuur over op de druppel fixeeroplossing en pipetteer dit op en neer om het monster te emulgeren. Plaats de objectglazen 20 minuten op een warmteplaat bij 55 °C om de uitstrijkjes in elke test te fixeren. Zorg ervoor dat positieve en negatieve controleglazen worden meegenomen voor de kwaliteitsbeoordeling van de assay.

Indien er geen callus-controleslides kunnen worden aangeschaft van Van DX, kunnen deze worden bereid met behulp van referentieculturen. Zodra het uitstrijkje gereed is, brengt u één druppel EFI callus O-E-P-N-A aan op de well met het bloedcultuurmonster, alsook op de wells voor de positieve en negatieve controle. Om contaminatie van de probe-stamoplossing te voorkomen, dient u erop te letten dat de tip van het druppelflesje het bloeduitstrijkje niet raakt.

Plaats een dekglas bovenop het monster, waarbij u er zorg voor draagt dat er geen luchtbellen ontstaan. Incubeer het preparaat vervolgens op een warmteblok bij 55 °C gedurende 30 minuten. Om het PNA na de incubatie te laten hybridiseren, plaatst u de preparaten in een preparaatenhouder.

Dompel de geladen objectglaashouder onder in een kleurbak met voorverwarmde Wash Solution van 55 °C. Verwijder het overtollige PNA van het monster en schuif het dekglas voorzichtig eraf door het objectglas in de buffer te bewegen of door een pincet te gebruiken. Incubeer het objectglas 30 minuten in de wash solution bij 55 °C.

Verwijder vervolgens het objectglas uit het kleuringsbakje en laat het aan de lucht drogen. Zodra het objectglas droog is, voegt u één druppel montage medium op kamertemperatuur toe aan het glas en plaatst u voorzichtig een dekglas op het monster. Onderzoek de objectglazen binnen twee uur na de bereiding met een fluorescentiemicroscoop met behulp van een duaalbandfilter.

Met deze methode kunnen iffy, callous, links in het groen weergegeven, worden onderscheiden van eum in het rood. In het middelste paneel uiterst rechts is een negatief resultaat te zien. Drie zaken om te onthouden voor het behalen van succesvolle resultaten zijn dat de instrumenttemperaturen op de ingestelde temperaturen moeten worden gehouden.

Het is noodzakelijk om de kleuringsprocedure zeer nauwkeurig te volgen, zoals beschreven in de bijsluiter. Ten slotte is een ervaren beoordelaar nodig die de slide grondig analyseert. Dit protocol is nuttig bij het maken van therapeutische beslissingen voor de behandeling van sepsis veroorzaakt door enterococcus.

Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.