Name: Concurrerende Homing Testen om de Gut-tropische T-cel-migratie Study (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-01T17:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Leer een concurrerende homing-test om de migratie van darm-tropische T-cellen te bestuderen in muizen. Deze methode vergelijkt migratie naar mesenteriale lymfeklieren en milt.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

EJV wordt ondersteund door een beurs van de Crohn en Colitis Ulcerosa s Foundation of America (CCFA). JRM wordt ondersteund door subsidies van CCFA, Cancer Research Institute (CRI), Howard H. Goodman (MGH), Massachusetts Life Science Center (MLSC) en New Innovator NIH directeur s Award.

1. Ex vivo generatie van darm-homing en controle op T-cellen (zie figuur 1) <ol><li> Isoleer splenocyten door stampen een milt van wild-type muizen. Resuspendeer de cellen suspensie in PBS en centrifugeer gedurende 5 'op 400 x g. Verwijder het supernatant en lyseren van de rode bloedcellen door resuspenderen de cel pellet in 4 ml van ACK lysis buffer voor 2-3 minuten. Daarna, voeg 5 ml PBS. Centrifugeer gedurende 5 'op 400 xg en verwijder het supernatant. </li><li> Resuspendeer totaal splenocyten op 1 x 10 6 / ml in IMDM + 10% FBS + 50 mM 2-mercapto-ethanol + penicilline / streptomycine (compleet IMDM). Scheid de cellen in twee groepen, waarvan er een is met RA (of synthetische RAR-agonisten, zoals Am80 of Am580), aangevuld tot een uiteindelijke concentratie van 100-200 nM 3. T-cellen geactiveerd in de aanwezigheid van een RA-of RAR-agonisten zullen upregulate a4b7and CCR9 en zal gut-tropische T-cellen, terwijl T-cellen geactiveerd zonder RA zal controle T-cellen. </li><li> Voeg 1,5-2,0 ml van de celsuspensie in elk putje van een 24-wells plaat voorheen bekleed met anti-CD3 (10 mg / ml) en anti-CD28 (10 mg / ml) toe en incubeer bij 37 ° C in 5% CO 2 (voor het coaten van de plaat toe te voegen 500 ml / putje van anti-CD3 plus anti-CD28 in PBS en incubeer gedurende 2 uur bij 37 ˚ C en vervolgens twee keer wassen met 2 ml PBS). </li><li> Om de T-cel overstimulatie te vermijden, overdragen na 2-3 dagen de cel suspensies in een nieuwe ongestreken 24-well plaat. Incubeer extra 2-3 dagen. Afhankelijk van de celdichtheid en proliferatie in de media zou kunnen worden zuur (geel), in welk geval kan het noodzakelijk zijn om de helft van de media te vervangen door verse volledig IMDM. Oogst de cellen na 4-5 dagen (te rekenen vanaf dag 0). </li><li> Typische uiteindelijke opbrengsten zijn 1-2 x 10 6 effector-T-cellen / well. Daarom moet een minimum van 9-12 putten van elk darm-tropische T-cellen en T-cellen controle worden uitgeplaat in om te eindigen met 10-20 x 10 6 T-cellen per conditie. </li></ol> 2. Analyse van de darm-homing receptoren op de geactiveerde T-cellen Na 4-5 dagen van de cultuur die we moeten houden aan een hoge expressie van darm-homing receptoren a4b7and CCR9 op T-cellen geactiveerd in de aanwezigheid van een RA-of RAR-agonisten, terwijl controle T-cellen moeten verwoorden zeer lage niveaus van deze receptoren 4. Flowcytometrie (FACS) analyse. <ol><li> Verzamel tussen 0,2-0,5 x10 6 cellen en centrifugeer 5 minuten bij 300 g bij 4 ° C. </li><li> Incubeer met anti-CD4-FITC, anti-a4b7-PE (BD Biosciences), anti-CCR9-APC (eBiosciences) en anti-CD8-PercP gedurende 15 min bij 4 ° C in het donker. </li><li> Na de incubatie, centrifuge gedurende 5 minuten bij 300 g 4 ° C. Wassen en de cellen resuspendeer in kleuren buffer en analyseren door FACS. </li></ol> 3. T-cel etikettering met CFSE en CMTMR cel trackers <ol><li> Houd alle oplossingen bij 37 ° C alvorens te beginnen. Was gut-tropische T-cellen (a4b7 High CCR9 Hoog) en controle op T-cellen (a4b7 Low / Neg CCR9 Low / Neg) tweemaal met PBS om het serum te verwijderen. Pas de T-cel-concentratie tot 10-15 x 10 6 / ml in PBS. </li><li> Voeg CFSE (carboxyfluoresceïne succinimidylester) of CMTMR (chloormethyl-benzoyl-amino-tetramethylrodamine) fluoroforen ofwel gut-tropische T en controle T-cellen tot een uiteindelijke concentratie van 5 mm en 10 mm, respectievelijk, zacht vortex en incubeer gedurende 20 minuten bij 37 ° C. Het wordt aanbevolen om de labelings swap in dezelfde of in een afzonderlijk experiment om potentiële intrinsieke effecten van fluoroforen op de T-cel migratie uit te sluiten. </li><li> Na de incubatie, blussen met een volume van FBS en incubeer voor 1-5 min bij kamertemperatuur. Verdun 10 keer met warm PBS en centrifugeer 5 minuten bij 300 g. Was tweemaal met PBS en resuspendeer in complete IMDM. </li><li> Idealiter zou 10 tot 20 x 10 6 cellen van elk T bevolking worden gemengd in een 1:1 verhouding en vervolgens gecentrifugeerd bij 300 xg gedurende 5 minuten. Ten slotte is resuspendeer de cellen in 200-250 ml van de warme PBS en injecteren via de staartader. </li><li> Voor het berekenen van de exacte ingang ratio (ideale ligging dicht bij 1) op te slaan 5-10 ml van de geïnjecteerde celsuspensie en verdun met 300 ml PBS en analyseren door FACS. </li></ol> 4. Analyse van de T-cel homing Hoewel muizen kunnen worden geanalyseerd op verschillende tijdstippen (tussen 1 uur en enkele dagen na de T-cel-injectie), is homing van darm-tropische T-cellen best gedocumenteerde tussen de 12-24 uur na de injectie. Langere tijd punten te verhogen van de potentiële effecten van andere variabelen die de laatste cel aantallen / verhoudingen, zoals T-cel apoptose en T-cel af te sluiten uit het weefsel. Nadat de muizen zijn gedood, celsuspensies van verschillende weefsels moeten worden geïsoleerd zonder uitstel om celdood verlagen, kan dat invloed op de uiteindelijke opbrengsten en resultaten. Weefsels van belang zijn de dunne darm, dikke darm, milt, lymfeklieren, plaques van Peyer, lever, longen en bloed. Als hetgeïnjecteerd T-cellen zijn bona fide gut-tropische T-cellen, moeten zij thuis gemiddeld 5-10 keer beter (of hoger) naar de dunne darm slijmvlies in vergelijking met de T-cellen te controleren. Moet echter andere weefsels, zoals bloed en de milt, niet vertonen een preferentieel T-cel migratie. Isolatie van lymfocyten uit de darm lamina propria en de intra-epitheliale compartiment is eerder beschreven 5. <ol><li> FACS kleuring: De monsters worden geresuspendeerd, afhankelijk van het aantal cellen verzameld, met een dichtheid niet hoger dan 3,0 x 10 6 cellen / ml. Als congenic CD45.1 + of Thy1.1 + muizen werden gebruikt als ontvangers, worden de cellen gekleurd met de bijbehorende congenic marker (bijv. CD45.2 of Thy1.2) in combinatie met een aantal afstamming marker (bijv. TCRbchain, CD4, CD8 , CD45.1 + / CD45.2 +). </li><li> Tijdens de FACS-analyse, cellen gated op de congenic marker (bijv. CD45.1) en vervolgens op de specifieke lijn markers (bijv. CD4/CD8) en geanalyseerd op de verhouding tussen CMTMR en CFSE positieve cellen. </li><li> De gegevens worden gewoonlijk uitgedrukt als de Homing Index (HI), die wordt berekend als de verhouding CFSE / CMTMR (of CMTMR / CFSE) in elk weefsel, gedeeld door de corresponderende ingang ratio (zie hieronder). Als de input-verhouding is zeer dicht bij 1, dan is het weefsel ratio's zullen gelijk zijn aan de HI. </li></ol> HI = CFSE weefsel / CMTMR weefsel: CFSE input / CMTMR ingang Bloed moet ook worden geanalyseerd om te bepalen of beide T-celpopulaties gelijk vertegenwoordigd zijn in de circulatie, of als een T-cel populatie wordt verlaagd respect naar de andere (bijvoorbeeld door preferentiële vangen in de longen / lever of door een verminderde levensvatbaarheid). Dit kan gebeuren bij het vergelijken naïef of rusten geheugen T-cellen ten opzichte van recentelijk geactiveerde effector-T-cellen, aangezien dit kan worden afgevangen om een ​​grotere mate in de longen. Als de HI in het bloed is significant anders is dan 1, kan een HI normaliseren in de weefsels door de HI in het bloed. Bloed kan worden verkregen via het hart doorboren van muizen verdoofd (met Avertin of isofluorane voor euthanasie) en moet twee keer worden gelyseerd met ACK buffer voordat u deze voor FACS kleuring. Bloed normaliseren = HI weefsel / HI Blood 5. Representatieve resultaten Ontvangende muizen (Thy1.1 +) waren euthanized18h na de cel injectie. Celsuspensies werden gegenereerd uit de milt, perifere lymfeklieren (PLN), mesenteriale lymfeklieren (MLN) en de dunne darm lamina Propia (LP). Na dat de cellen werden gekleurd voor Thy1.2 en CD8 en vervolgens geanalyseerd door FACS door gating op levensvatbare Thy1.2 + CD8 + cellen, die uiteindelijk werden geanalyseerd op de verhouding tussen CMTMR + cellen (darm-tropische T-cellen) en de CFSE + cellen (controle T-cellen) gedeeld door de input-ratio. De resultaten kunnen worden weergegeven zoals in figuur 2, waarin het kan worden begrepen dat gut-tropische en controle T-cellen homed ook voor de milt (HI dicht tot1, aangegeven met een rode lijn). Daarentegen, gut-tropische T-cellen migreerden ongeveer 10 keer efficiënter naar de LP in vergelijking met de T-cellen te controleren. <img src="/files/ftp_upload/2619/2619fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1:. Diagram van de generatie en de etikettering van darm-tropische en niet-gut tropische T-cellen T-cellen worden geïsoleerd van wild-type muizen en geactiveerd met anti-CD3/anti-CD28 en in de aanwezigheid of afwezigheid van 100-200 nM alle - trans retinoïnezuur (RA). Na 4-5 dagen RA behandeld met T-cel het verwerven van de expressie van de darm homing receptoren CCR9 en a4b7. Vervolgens worden gut-tropische en controle T-cellen verschillend gelabeld met CFSE of CMTMR, gewassen, gemengd in een verhouding van 1:1 en geïnjecteerd in een ontvanger muis via de staartader. Een aantal gelabelde cellen worden gebruikt om de CFSE / CMTMR ingang ratio (moet dicht bij 1 worden) te bepalen. <img src="/files/ftp_upload/2619/2619fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2:. Voorbeeld van een homing analyse Muizen geanalyseerd 12-18 uur na de T-cel-injectie en single celsuspensies worden verkregen uit de organen van belang. De cellen zijn gekleurd met anti-Thy1.2 (congenic marker) plus anti-CD8 en dan Thy1.2 + CD8 + T-cellen worden geanalyseerd op de verhouding van CMTMR + en CFSE + cellen in elk weefsel door FACS. Het weefsel CMTMR / CFSE ratio's worden vervolgens genormaliseerd door de Input CMTMR / CFSE verhouding tot de homing indices (HI) te verkrijgen. In dit voorbeeld CMTMR + en CFSE + cellen zijn darm-tropische en controle effector T-cellen, respectievelijk.

<ol><li>Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte-endothelial+cell+recognition%3A+Three+%28or+more%29+steps+to+specificity+and+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Leukocyte-endothelial cell recognition: Three (or more) steps to specificity and diversity.</a> Cell. 67, 1033-1036 (1991).</li>
<li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traffic+signals+for+lymphocyte+recirculation+and+leukocyte+emigration%3A+the+multistep+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm.</a> Cell. 76, 301-314 (1994).</li>
<li>Iwata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+imprints+gut-homing+specificity+on+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid imprints gut-homing specificity on T cells.</a> Immunity. 21, 527-538 (2004).</li>
<li>Mora, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+and+dynamic+control+of+CD8+T+cell+homing+by+dendritic+cells+from+skin-+and+gut-associated+lymphoid+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Reciprocal and dynamic control of CD8 T cell homing by dendritic cells from skin- and gut-associated lymphoid tissues.</a> J Exp Med. 201, 303-316 (2005).</li>
<li>Mora, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+imprinting+of+gut-homing+T+cells+by+Peyer%27s+patch+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Selective imprinting of gut-homing T cells by Peyer's patch dendritic cells.</a> Nature. 424, 88-93 (2003).</li>
<li>Mempel, T. R., Scimone, M. L., Mora, J. R., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+leukocyte+trafficking+in+blood+vessels+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of leukocyte trafficking in blood vessels and tissues.</a> Curr Opin Immunol. 16, 406-417 (2004).</li>
</ol>

Hoewel homing experimenten zorgen voor een zeer waardevolle informatie over de migratie van het totaal celpopulaties in een bepaald weefsel, moet in gedachten worden gehouden dat deze testen niet rechtstreeks endotheel hechting daarom te analyseren en niet discrimineren, waarin stap (pen) van de meerstaps hechting cascade (tethering / rollen, activering of plakken) een bepaalde homing receptor optreedt. De gouden standaard om de specifieke rol van de homing-receptoren te definiëren in de hechting cascade is intravitale ...

Dieren: C57BL / 6 muizen worden vaak gebruikt voor het T-cel isolatie. Daarnaast, CD45.1 en Thy1.1 congenic stammen zijn beschikbaar via Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME). Cultuur media: IMDM (Iscove&#39;s gemodificeerd Dulbecco&#39;s Medium + L-Glutamine + Hepes) plus 10% hitte-geïnactiveerd FBS (Fetal Bovine Serum, een lage endotoxine, Gibco ®, Invitrogen, Carlsbad, CA), aangevuld met 100 U / ml penicilline, 100 mg / ml streptomycine (Hyclone Antibiotica, Waltham, MA), 0,5 mg / ml fungizone / amfotericine B (Gibco), en 50 mM b-mercapto-ethanol. ACK Red Blood Cell Lysis buffer (RBC, 10 mM KHCO 3, 150 mM NH 4 Cl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0), aan te passen aan de pH 7,2-7,4 en op te slaan op kamertemperatuur). PBS (fosfaat gebufferde fysiologische zoutoplossing, Hyclone, Waltham, MA). Flowcytometrie (FACS) media (PBS of IMDM + 2% FBS + 5 mM EDTA). Wanneer kleuring met behulp van selectine-Fc hersenschimmen, media met 2 mM Ca + + moet worden gebruikt in alle stappen (inclusief FACS acquisitie). IMDM is aan te bevelen in dit geval. T-cel etikettering en de adoptieve overdracht: CFSE (carboxyfluoresceïne diacetaat, succinimidylester), CMTMR ((5 - (en-6 )-((( 4-chloormethyl) benzoyl) amino) tetramethylrodamine) van Molecular Probes ®, Invitrogen, Carlsbad, Californië ). 1000 x voorraden moeten worden gemaakt in DMSO (5 mM CFSE, 20 mM CMTMR) en opgeslagen bij -20 ° C. Polyklonale T-cel activatie: 24-well of 96-well platen (tissue-cultuur behandeld, polystyreen, vlakke bodem met deksel, BD Falcon, Franklin Lakes, New Jersey) zijn gedurende 2 uur bij 37 ° C met 50 ml PBS, met respectievelijk , met anti-CD3 plus anti-CD28 antilichamen (10 mg / ml per stuk). Vervolgens worden kweekplaten tweemaal gewassen met PBS en direct gebruikt voor de T-cel cultuur. Als alternatief kan Dynabeads gecoat met anti-CD3/anti-CD28 (Dynal, Invitrogen, Carlsbad, CA) worden gebruikt voor de T-cel activatie in plaats van plaat-gebonden antilichamen. Flowcytometrie (FACS) kleuring: Polyklonale activering: CD3 (1452C11), CD28 (37.51). Lineage mAb: CD4 (L3T4), CD8a (Ly-2), Thy1.2 (CD90.2/53-1.2), CD45.2 (104). Gut-homing receptoren: gezuiverd CCR9 (CD199/eBioCW-1.2, eBioscience, San Diego, CA), a4b7 (LPAM-1/DATK3), isotype controle (IgG2a, k). Skin-homing receptoren: P-selectine-Fc (Gezuiverd Mouse P-selectine - IgG-fusie-eiwit, BD Pharmingen, San Jose, CA), E-selectine-Fc (Recombinant Mouse E-Selectin/Fc Chimera, R &amp; D Systems, Minneapolis, MN) plus bijbehorende secundaire reagens geit F (ab &#39;) 2 anti-humaan IgG R-PE (Invitrogen, Carlsbad, CA). All-trans-retinoïnezuur (Sigma, St. Louis, MO) is geresuspendeerd in absolute ethanol of DMSO met behulp van een gele lamp of een onrechtstreeks, een bron van licht tijdens de voorbereiding. Bewaar aliquots in glazen flesjes bij -80 ° C en beschermd tegen licht te allen tijde. Synthetische RAR-agonisten: Am80 (Wako Chemicals, Richmond, VA).

concurrerende homing testen om de gut-tropische t-cel-migratie study

Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

Om te oefenen hun functie lymfocyten moet het bloed te verlaten en in verschillende weefsels in het lichaam migreren. Lymfocyten hechting op endotheliale cellen en weefsels extravasatie is een complex proces gecontroleerd door verschillende adhesiemoleculen (homing-receptoren) uitgedrukt op lymfocyten en hun respectieve liganden (addressins) getoond op endotheelcellen 1 2. Ook al is de functie van deze receptoren hechting kan gedeeltelijk worden bestudeerd ex vivo, de ultieme test voor hun fysiologische relevantie is om hun rol te evalueren tijdens de in-vivo-lymfocyten adhesie en migratie. Twee complementaire strategieën zijn gebruikt voor dit doel: intravitale microscopie (IVM) en homing experimenten. Hoewel de IVM is essentieel om de precieze bijdrage van specifieke adhesie receptoren tijdens de hechting cascade in real time en in verschillende weefsels te definiëren, IVM is tijdrovend en arbeidsintensief, vaak de ontwikkeling van geavanceerde chirurgische technieken vereist, moet het voorafgaande scheiding van homogene celpopulaties en het mogelijk maakt de analyse van slechts een weefsel / orgaan op een bepaald moment. Daarentegen, concurrerende homing experimenten laat de directe en gelijktijdige vergelijking in de migratie van twee (of zelfs meer) cel subsets in dezelfde muis en ze ook toestaan ​​dat de analyse van een groot aantal weefsels en van een groot aantal cellen in hetzelfde experiment. Hier beschrijven we de klassieke concurrerende homing protocol dat wordt gebruikt in het voordeel / nadeel van een bepaald celtype te bepalen naar huis om specifieke weefsels in vergelijking met een controle-celpopulatie. We hebben ervoor gekozen om de trekkende eigenschappen van darm-tropische versus niet gut-tropische T-cellen te illustreren, omdat het darmslijmvlies is de grootste lichaamsoppervlak in contact met de externe omgeving en het is ook de extra-lymfoïde weefsel met de beste gedefinieerde trekkende eisen . Bovendien heeft recent werk vastgesteld dat de vitamine A metaboliet all-trans retinoïnezuur (RA) is de belangrijkste moleculaire mechanisme dat verantwoordelijk is voor het induceren van darm-specifieke aanhechting receptoren (integrine a4b7and chemokine-receptor CCR9) op lymfocyten. Zo kunnen we snel grote aantallen van darm-tropische als niet-tropische darm lymfocyten ex vivo door het activeren van T-cellen in de aanwezigheid of afwezigheid van RA, respectievelijk, die uiteindelijk kan worden gebruikt in de concurrerende homing experimenten hier beschreven.

Concurrerende homing experimenten toelaten om rechtstreeks de beoordeling van de trekkende eigenschappen van twee verschillende celpopulaties in een muis. Hier hebben we illustreren deze procedure door het vergelijken van de migratie van ex vivo gegenereerde gut-tropische versus niet-gut tropische T-cellen.

Concurrerende Homing Testen om de Gut-tropische T-cel-migratie Study

Om hun functie uit te kunnen oefenen, moeten lymfocyten de bloedbaan verlaten en migreren naar verschillende weefsels in het lichaam. De adhesie van lymfocyten aan endotheel...

Het algemene doel van deze procedure is om de weefselspecifieke migratiecapaciteiten van twee of meer celpopulaties in dezelfde muisontvanger te vergelijken, waardoor de analyse van vele weefsels en cellen in één experiment mogelijk is. Hier tonen we een methode voor het vergelijken van de migratiecapaciteiten van in vitro gegenereerde darmtropische en controle T-cellen in een wildtype ontvangermuis. De methode kan bijvoorbeeld worden gebruikt om het vermogen van darmtropische T-cellen te bepalen om te migreren naar de mesenteriële lymfeklieren van de darm, perifere lymfeklieren en de milt.Vergeleken met controle-T-cellen moeten eerst darmtropische en controle-effector T-cellen in vitro worden gegenereerd. Vervolgens moeten de experimentele en controle-T-cellen worden gelabeld met verschillende kleurstoffen en in een verhouding van één-op-één worden gemengd. Daarna wordt het celmengsel, op een klein aliquoot na dat wordt gebruikt voor het bevestigen van de inputverhouding, in de recipiënte muis geïnjecteerd.Ten slotte wordt de muis 18 uur na de adoptieve transfer opgeofferd en worden de relevante organen geanalyseerd op de aanwezigheid van darmtropische en controle T-cellen via flowcytometrie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals de adoptieve transfer van een enkelcelpopulatie, is dat een combinatie van verschillende subtypes in dezelfde ontvanger-muizen wordt geïnjecteerd, waardoor de variabiliteit geassocieerd met intraveneuze injectie of het gebruik van verschillende ontvanger-muizen aanzienlijk wordt verminderd. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de therapie van ziekten die gepaard gaan met massale leukocyteninfiltratie, zoals inflammatoire darmziekten.Het stelt ons bijvoorbeeld in staat om te bepalen hoeveel moleculen er nodig zijn tijdens zowel normale als tijdens aran lymfocytmigratie naar de darm. Bovendien stelt deze procedure ons in staat om de effectiviteit van geneesmiddelen die zijn ontworpen om leukocytenverkeer te blokkeren te beoordelen. Coat elke put van een 24-wells plaat met 500 µL PBS bevatten 10 mg/mL anti-CD3 en anti-CD28 antilichamen. Incubeer de plaat gedurende twee uur bij 37 °C in 5% CO2 terwijl de putten worden gecoat.Offer een wild-type muis en dissecteer de milt, waarna deze in een buis van 50 milliliter met medium wordt geplaatst. Isoleer de PLE-cyten door de milt tussen twee objectglazen te plaatsen en deze boven een Petrischaal fijn te wrijven. Resuspendeer de cellen in PBS, pipetteer de celsuspensie in een nieuwe conische buis van 50 milliliter en centrifugeer gedurende vijf minuten.Centrifuge bij 400 Gs op kamertemperatuur, verwijder het supernatant en lyseer de rode bloedcellen door het celpellet gedurende twee tot drie minuten te resuspenderen in vier milliliter act lysis buffer. Stop de lyse met vijf milliliter PBS, centrifugeer de celsuspensie opnieuw gedurende vijf minuten bij 400 Gs op kamertemperatuur en verwijder het supernatant. Suspendeer het resulterende pellet in 1 × 10⁶ cellen per milliliter in compleet medium op ijs.Meng Coves gemodificeerd Delcos-medium of IMDM in gelijke delen, verdeel de resulterende celstuspensie over twee afzonderlijke buisjes en voeg aan één van de buisjes all-trans retinoïnezuur of RA toe tot een eindconcentratie van 100 tot 200 nanomolar. Bescherm het buisje tegen direct licht om degradatie van het all-trans retinoïnezuur te voorkomen. Haal de 24-wells plaat uit de incubator en was elke well twee keer met 2 mL PBS.Voeg 1,5 tot twee milliliters van de met RA aangevulde celsuspensie toe aan de helft van de 24-well plaat. Voeg vervolgens dezelfde hoeveelheid controlecellen toe aan elke well van de tweede helft van de 24-well plaat en plaats de plaat terug in de incubator. Na twee tot drie dagen worden de celsuspensies overgebracht naar een nieuwe, ongecoate 24-well plaat.Om overstimulatie van de T-cellen te voorkomen, worden de cellen nog twee tot drie dagen geïncubeerd. Als het medium geel wordt door de celdichtheid en/of proliferatie, voeg dan 500 µL vers IMDM toe aan elke put om een eindvolume van 1 mL per put te bereiken. Om de cellen te oogsten, wordt het supernatant op dag vier of vijf verzameld, waarbij de dag dat de cellen zijn uitgeplaatst als dag nul wordt geteld.De typische uiteindelijke opbrengsten zijn 1 tot 2 × 10⁶ effector T-cellen per well. Daarom moeten er minimaal negen tot 12 wells van zowel de gut-tropische als de gecontroleerde T-cellen worden geplaatst om 10 tot 20 × 10⁶ T-cellen per groep te genereren. Om de expressieniveaus van alfa 4, bèta 7 en CCR 9 op ra te controleren.Verzamel tussen 0,2 en 0,5 x 10⁶ van de vers geoogste experimentele cellen en controlecellen van geactiveerde en gecontroleerde T-cellen in 4 mL fax-buisjes en centrifugeer de buisjes vijf minuten lang bij 300 ×g bij 4 °C. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 100 µL kleuringsbuffer; incubeer gedurende 15 minuten bij 4 °C in het donker met anti-CD4 FITC, anti-CD4β7 PE, anti-CCR9 APC en anti-CD8 PerCP.Was na de incubatie de cellen gedurende vijf minuten met PBS bij 300 GS op vier graden Celsius, verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen opnieuw in kleuringsbuffer en analyseer deze via flowcytometrie aan het begin van deze stap. Verwarm een fles IMDM en een fles PBS voor op 37 graden Celsius voor later gebruik in het kleuringsprotocol.Nadat de T-cel-homing-fenotypes van de twee celculturen via flowcytometrie zijn bevestigd zoals beschreven in de vorige stap, worden de vers geoogste $\alpha4\beta7^{high}$ CCR9$^{high}$ darmtropische en de $\alpha4\beta7^{low/neg}$ CCR9$^{low/neg}$ controle T-celpopulaties gecentrifugeerd bij 300 ×g gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Was de cellen vervolgens nog twee keer met PBS om het serum te verwijderen en stel daarna de T-celconcentratie voor elke groep in op $10$ tot $15 \times 10^6$ cellen per milliliter. Voeg in PBS CFSE- of CMTMR-kleurstoffen toe aan respectievelijk de darmtropische T-cellen of de controle T-cellen.Hier wordt CFSE toegevoegd aan de controlecelpopulatie en C-M-T-M-R aan de darm-T-cellen tot een eindconcentratie van respectievelijk 5 mM en 10 mM. Vortex de cellen voorzichtig gedurende vijf seconden en incubeer de buizen gedurende 20 minuten bij 37 °C in het waterbad. Stop na de incubatieperiode de kleuring door toevoeging van 5 mL FPS en incubeer gedurende één tot vijf minuten bij kamertemperatuur.Verdun 10 keer met de warme PBS en centrifugeer gedurende vijf minuten bij 300 Gs bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant, was nog twee keer met PBS en resuspendeer de cellen in compleet IMDM. Idealiter moeten 10 tot 20 keer 1/10e van de zes cellen van elke T-celpopulatie in een verhouding van één-op-één in vier milliliter fax-buisjes worden gemengd.Om de exacte input-ratio te berekenen, bewaart u vijf tot 10 µL van de te injecteren cel-suspensie (de zogenaamde 'input') bij vier °C. Centrifugeer het te injecteren celmengsel gedurende vijf minuten bij 300 ×g bij kamertemperatuur. Resuspendeer de te injecteren cellen in 250 tot 300 µL warme PBS. Vul een insulinespuit van 1 cc met een naald van 28 gauge met de cellen voor injectie.Injecteer 250 µL van het cellengemengsel via de staartвена. Analyseer tot slot de inputcellen via flowcytometrie om het percentage CFSE- en C-M-T-M-R-positieve cellen te bepalen die eerder zijn geïnjecteerd. Dit is de te gebruiken inputratio.Bij de uiteindelijke berekening van de homing-index suspenderen we de celmonsters uit de weefsels voor de analyse van T-celhoming bij een dichtheid van maximaal 3 × 10⁶ cellen per milliliter. Indien congene muizen als ontvangers voor deze video worden gebruikt, werden CD45.1-positieve muizen gebruikt; deze werden gekleurd met de passende congene marker in combinatie met enkele lineage-markers. Tijdens de flowcytometrische analyse worden de cellen gegate op de gekozen congene marker en vervolgens op de specifieke lineage-marker CD8, waarna de ratio's tussen CMTMR- en CFSE-positieve cellen worden geanalyseerd.De gegevens worden vervolgens uitgedrukt als de homing-index of hi, die wordt berekend als de verhouding tussen de twee verschillende kleurstoffen in elk weefsel gedeeld door de overeenkomstige inputverhouding. De inputverhouding is de verhouding van de CFSE-positieve tot de CMTM TMR-positieve cellen in de spuit vóór de injectie, berekend op basis van het aliquot van 5 tot 10 µL cel-suspensie dat hiervoor apart was gezet en via flowcytometrie werd geanalyseerd. Als de inputverhouding zeer dicht bij één ligt, zijn de weefselverhoudingen gelijk aan de hi.Als de HI van het weefsel en die van het bloed significant verschillen van één, kan de HI in de geanalyseerde weefsels worden genormaliseerd aan de HI in het bloed door de ratio te berekenen van de HI in de weefsels gedeeld door de HI in de celsuspensies die 18 uur na injectie zijn verkregen uit de milt, perifere lymfeklieren (PLN), mesenteriale lymfeklieren (MLN) of de lamina propria (LP) van de dunne darm. Er werd geanalyseerd op CMTMR- en CFSE-expressie op gegatede CD8+ CD45.1+ cellen. Geactiveerde T-cellen die α4β7 en CCR9 tot expressie brachten en CMTMR-positief waren, migreerden in gelijke aantallen naar de milt als de controle-CFSE-positieve cellen, maar vertoonden een sterke toename in homing naar de darm en de drainerende lymfeweefsels bij berekening van de HI voor elk weefsel. Verder bevestigde dit dat de gut-tropische en controle T-cellen in gelijke mate naar de milt migreerden, maar in contrast hiermee ongeveer 10 keer efficiënter naar de LP migreerden in vergelijking met de controle T-cellen na het beheersen van de procedure.Het gebruik van congene muizen in plaats van kleurstofnivellering kan worden toegepast om het migratievermogen van aanvullende celtypen, zoals dendritische cellen of macrofagen, te beoordelen. Aangezien deze celtypen de neiging hebben de kleurstof te verliezen zodra ze in de recipientmuizen zijn geïnjecteerd, maakt het gebruik van congene dieren een betere tracking van de cellen mogelijk over veel langere tijdsperioden na adoptieve transfer.

competitive-homing-assays-to-study-gut-tropic-t-cell-migration

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

T-lymfocyt migratie vindt plaats tijdens homing aan lymfoïde organen, het verlaten van het vaatstelsel en het aangaan van perifere weefsels. We beschrijven hier een protocol dat gebruikt kan worden om T-lymfocyten migratie te...

Human T-lymfocyt Isolatie, Cultuur en Analyse van de migratie In Vitro</em

This video describes the imaging of resident tumor-infiltrating CD8 T cells labeled with fluorescently coupled antibodies within human lung tumor slices. This technique permits real-time analyses of CD8 T cell migration using confocal microscopy.

Real-Time Analysis of Resident T-cell Migration in Different Tumor Regions Using Confocal Microscopy

We presenteren een ex vivo celmigratie analyse die exacte kwantificering van enterische neurale celmigratie potentieel in aanwezigheid van verschillende groeifactoren maakt.

Een kwantitatieve cel-migratie test voor Muriene Enterisch neurale voorlopercellen

De mechanismen die de interstitiële beweeglijkheid van CD4-effector-T-cellen regelen op plaatsen van ontsteking zijn relatief onbekend. Wij presenteren een niet-invasieve benadering visualiseren en manipuleren in vitro geprimed CD4 T-cellen in het ontstoken oor dermis, waardoor studie van het dynamisch gedrag van deze cellen in situ.

Beeldvorming CD4 T Cell interstitiële Migratie in de ontstoken Dermis

Protocollen voor kwantitatieve beoordeling van lymfocyt chemotaxis en migratie zijn belangrijke hulpmiddelen voor onderzoek van de immunologie. Hier, wordt een in vitro -protocol beschreven dat vergunningen real-time, multiplexed evaluatie van cel migratie, alsmede een complementaire in vivo techniek waardoor tracking van inheemse cellen met milt.

Kwantificeren van menselijke monocyt Chemotaxis In Vitro en lymfkliertest lymfocyt handel In Vivo

De hier ingevoerde protocol kunnen karakterisering van de homing longcapaciteit van primaire menselijke lymfocyten in vivo inflammatoire voorwaarden. Pulmonaire infiltratie van adoptively overgedragen menselijke immune cellen in een muismodel van allergische ontsteking kan worden beeld en gekwantificeerd door licht vel fluorescentie microscopie van chemisch gewiste longweefsel.

Geavanceerde Imaging van longkanker Homing menselijke lymfocyten in een experimenteel In Vivo Model van allergische ontsteking op basis van licht vel microscopie

In dit protocol worden lymfocyten in de bovenste kamer van een transmigratiesysteem geplaatst, gescheiden van de onderste kamer door een poreus membraan. Chemokine wordt toegevoegd aan de onderste kamer, die actieve migratie langs een Chemokine gradiënt induceert. Na 48 h worden lymfocyten in beide kamers geteld tot transmigratiegekwantata.

Beoordeling van de lymfocyten migratie in een ex vivo-Transmigratiesysteem

Hier presenteren we een protocol voor in vivo vergroting van gut-homing regulatoire T Cell inductie. In dit protocol zijn dendritische cellen ontworpen om lokaal hoge concentraties van de actieve vitamine D (1,25-dihydroxyvitamin D of 1,25 [OH]2d) en de actieve vitamine A (retinoïnezuur of RA) de Novo te produceren.

In vivo augmentatie van gut-homing regulatoire T Cell inductie

Dit protocol biedt een methode voor primaire muizen T-celisolatie en time-lapse-microscopie van T-celmigratie onder specifieke omgevingsomstandigheden met kwantitatieve analyse.

Real-time in-vitromigratietest voor primaire muizen CD8+ T-cellen

We presenteren verbeterde protocollen voor retrovirale transductie van transportreceptoren en competitieve homing om receptor-gemedieerde orgaan- en micro-omgevingsspecifieke lymfocytenpositionering te bestuderen. Deze methode biedt waardevolle inzichten in mechanismen voor het transport van immuuncellen en heeft potentiële toepassingen in toekomstig fundamenteel en therapeutisch onderzoek.

Efficiënte retrovirale transductie en competitieve homing voor het onderzoeken van GPCR-gemedieerde T-cellokalisatie in diverse weefselmicro-omgevingen

Leer een concurrerende homing-test om de migratie van darm-tropische T-cellen te bestuderen in muizen. Deze methode vergelijkt migratie naar mesenteriale lymfeklieren en milt.

Concurrerende Homing Testen om de Gut-tropische T-cel-migratie Study

Meer video's verkennen