Het tellen van menselijke neurale stamcellen
August 22nd, 2007
Kennis van het exacte aantal levensvatbare cellen is nodig voor vele weefselkweek manipulaties. Dit protocol beschrijft hoe onderscheid te maken tussen levende en dode cellen en kwantificeren cellen met behulp van een hemacytometer. Hoewel het beschrijft het tellen van menselijke neurale stamcellen / precursor cellen (hNSPCs), kan het worden gebruikt voor andere celtypen.
Nu ga ik je laten zien hoe je humane neuro precursor cellen telt en je zou je cellen tellen wanneer je ze wilt gebruiken voor immunochemie of wanneer je een transfectie wilt doen met een nucleair factor machine. Ik gebruik een fasecontrast hemo cytometer die een randrooster heeft en we gebruiken ook een kleurstof genaamd trip en blauw. En de kleurstof is nuttig omdat het onderscheid kan maken tussen levende en dode cellen.
Dode of stervende cellen nemen deze kleurstof op en ze zien er blauw uit. Wanneer je de cellen in de hemo cytometer bekijkt, zijn levende cellen in staat om deze kleurstof uit te sluiten en ze, ze, ze zien er niet blauw uit. Zodat je op die manier de levensvatbaarheid van je cellen kunt bepalen om een oplossing van trip en blauw en media te bereiden.
Ik ga 20 microliters van de trap en blauwe oplossing toevoegen aan deze 0,5 ml epi tube. En dan ga ik 25 microliters media toevoegen. Zodat ik nu 45 microliters heb van een trap pan blauw en media oplossing, zodat wanneer ik vijf microliters celsuspensie toevoeg, ik een 1 op 10 verdunning heb.
En nu ga ik vijf microliters celsuspensie toevoegen. Eerst ga ik ervoor zorgen dat de cellen goed worden opgeschort door middel van vingervorming. Dus nu wil ik er zeker van zijn dat deze oplossing goed gemengd is.
Dus ik ga het bed een paar keer op en neer doen. En tenslotte ga ik ongeveer 12 microliters van deze celsuspensie in een hemo cytometer laden. Het heeft twee poorten en je kunt beide gebruiken.
Dus alles wat je hoeft te doen is de oplossing bij deze poort introduceren en de vloeistof zal worden opgezogen door capillaire werking. En nu ben ik klaar om te tellen. Hier is een kijkje in de hemo cytometer bij 10 x en hier hebben we een kwadrant dat 16 vierkantjes bevat.
En zoals je kunt zien, kunnen we hier levende en dode cellen observeren. Hier hebben we levende cellen zoals deze en deze en deze. En we hebben ook enkele dode cellen zoals deze.
Als je merkt, ziet de dode cel er donkerblauw uit, terwijl levende cellen een soort halo om zich heen hebben. Dus nu ga ik alle levende cellen tellen. Dus ik ga van links naar rechts en van boven naar beneden.
1, 2, 3, 4, 5, 6, 33, 1 32, 33, 34, 3 5, 3 6. Dus we hebben in totaal zes cellen in dit kwadrant. Dus als ik cellen zie die op de rand van het kwadrant liggen, zoals langs deze lijn hier, tel ik consequent de cellen die op de linkerrand en de bovenrand staan.
En ik tel consequent cellen op die randen voor alle kwadranten op de hemo cytometer. Dus nu gaan we berekenen hoeveel cellen we per microliter hebben. En om dat te doen ga ik het gemiddelde van de cellen per kwadrant nemen, dat is 38 en vermenigvuldigen met 10, wat een factor is die wordt bepaald door de afmetingen van de kamer.
En we gaan ook vermenigvuldigen met 10, wat onze verdunningsfactor is in dit geval. En uiteindelijk krijgen we het aantal cellen per microliter. Dus in dit geval hebben we 3.800 cellen per microliter.
En omdat we onze celpallet in 500 microliters oplossing hebben opgeschorst, kun je berekenen hoeveel cellen je in totaal hebt. En we zijn klaar.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode voor het tellen van menselijke neurale stam-/precursorcellen (hNSPC's) met behulp van een hemacytometer. Het benadrukt het belang van het onderscheid tussen levende en dode cellen voor verschillende weefselkweektoepassingen.
Belangrijkste onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Weefselkweek
Achtergrond
- Het tellen van levensvatbare cellen is cruciaal voor weefselkweekmanipulaties.
- Levende cellen kunnen bepaalde kleurstoffen uitsluiten, dode cellen niet.
- Een hemacytometer is een standaardhulpmiddel voor het tellen van cellen.
- Trippan blauwe kleurstof wordt veel gebruikt om de levensvatbaarheid van cellen te beoordelen.
Doel van het onderzoek
- Een betrouwbare methode bieden voor het tellen van hNSPC's.
- Levende en dode cellen effectief onderscheiden.
- Onderzoekers helpen bij het voorbereiden van verdere experimenten zoals immunochemie of transfectie.
Gebruikte methoden
- Gebruik van een fasecontrast hemacytometer.
- Toepassing van Trippan blauwe kleurstof om cellevensvatbaarheid te onderscheiden.
- Tellen van cellen onder een microscoop.
- Bereiding van een oplossing van Trippan blauwe kleurstof en media.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle differentiatie tussen levende en dode cellen.
- Accurate kwantificering van hNSPC's.
- Demonstratie van de effectiviteit van Trippan blauwe kleurstof.
- Validatie van de hemacytometer als betrouwbare telmethode.
Conclusies
- Het protocol biedt een eenvoudige aanpak voor celtelling.
- Het is toepasbaar op verschillende celtypen buiten hNSPC's.
- Begrip van cellevensvatbaarheid is essentieel voor succesvolle weefselkweekexperimenten.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Accurate quantification of viable human neural stem/precursor cells (hNSPCs) is essential for reproducible tissue culture workflows in neuroscience drug discovery. This protocol enables reliable cell viability assessment and concentration measurement, supporting consistent experimental seeding for downstream applications such as immunocytochemistry and transfection. By standardizing live/dead discrimination using Trypan blue and hemacytometer-based counting, the method enhances predictive confidence in early-stage target validation and assay development pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables precise seeding of hNSPCs for target engagement and pathway modulation studies.
- Operational Value: Reduces variability in cell-based assays by ensuring consistent input of viable cells.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides quantitative, reproducible cell concentration data critical for assay standardization.
- Operational Value: Supports scalable preparation of cell suspensions for high-content screening formats.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains cellular input consistency across discovery-to-preclinical transition stages.
- Operational Value: Facilitates cross-functional collaboration through standardized cell counting practices.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the early discovery continuum, supporting reliable cell preparation from target validation through assay optimization and preclinical efficacy testing.
- Discovery Biology: Ensures accurate cell dosing for target validation experiments involving hNSPCs.
- Screening: Delivers standardized, quantifiable cell inputs necessary for reproducible assay performance.
- Analytics: Generates viable cell concentration and total count outputs used to normalize experimental conditions.
- Translational Research: Supports continuity in cell handling between in vitro discovery and preclinical models.
- Enterprise Reuse: Represents a transferable, low-complexity capability applicable across multiple cell types and projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves predictive confidence by minimizing variability in cell-based experimental inputs.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization across laboratories and teams.
- Strategic Value: Supports better go/no-go decisions through reliable assay foundations.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement by ensuring data quality in early efficacy screening.
Implementation Considerations
- Requires basic tissue culture technique and microscopy proficiency.
- Dependent on hemacytometer availability and proper cleaning to avoid contamination.
- Necessitates consistent operator training for unbiased quadrant selection and border-counting rules.
- Limited by manual counting throughput; not suited for high-throughput automation without adaptation.
- Relies on correct dilution and mixing to ensure representative sampling of cell suspension.
