Name: Whole-mount Immunohistochemische Analyse voor Embryonale Limb Skin vaatstelsel: een modelsysteem voor Vasculaire Vertakkingen Morphogenesis in Embryo Study (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Leer whole-mount immunohistochemie voor vasculaire netwerkvorming in muizenembryo ledemathuid met confocale microscopie. Deze methode visualiseert bloedvaten en lymfevaten voor ontwikkelingsbiologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken K. Gill voor hulp met de muis fokken en zorg en voor laboratorium-management. Dank ook aan Mukoyama lab leden voor technische hulp. De financiering werd verstrekt door Intramurale Research Program van Naitonal Institutes of Health.

1. Het verzamelen van muis embryonale Limb Skin (E13.5 ~ E17.5) <ol><li> Euthanaseren aangesloten vrouwen door erkende procedure. Volgens onze goedgekeurde dieren protocol worden de vrouwtjes gedood door de CO 2 belichting en vervolgens verzekerd door cervicale dislocatie. Leg het dier op haar absorberende papieren handdoek en grondig laat deze in 70% EtOH / H 2 O uit een knijpfles. </li><li> Ontleden de baarmoeder intact en plaats deze in een 100 x 15 mm petrischaal met Balanced Salt ijskoude Hanks 'Solution (HBSS) uit te spoelen bloed. </li><li> Scheiden en ontleden van de embryo. Verwijder de zeer dunne amnion van het embryo. </li><li> (Optie) Prepareer een enkel embryo in een 35 x 10 mm petrischaal als elk embryo moet worden gegenotypeerd. Ontleed staart is overgebracht naar een 0,2 ml PCR-buis voor genotypering. </li><li> Snijd de voorpoten van de embryo en de overdracht voorpoten door een ring tang in 24 wells plaat met 2 ml ijskoude verse 4% paraformaldehyde (PFA) in fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS). </li><li> Bevestig de voorpoten met zachte mengen op de Nutator Mixer bij 4 ° C gedurende de nacht. </li><li> Op de volgende dagen, verwijder de PFA en was drie keer voor 5 min in 2 ml PBS met zachte mengen op de Nutator Mixer bij kamertemperatuur. </li><li> Breng de voorpoten in 100% methanol (MeOH) en bewaar deze bij -20 ° C vriezer enzym (de vriezer met een kritische temperatuur controle en zonder automatische ontdooifunctie). Primaire antilichamen vermeld in tabel 1 het werk na de 100% MeOH behandeling. </li><li> Verwijder de huid van de voorpoot met fijne pincet. Limb huid, toen uitgedroogd, moet gemakkelijk los van de ledemaat. Eerste plaats de ledematen met ventrale zijde (handpalm zijde) naar boven gericht. Vervolgens met behulp van fijne pincet, snijd de huid zoals in de video. Volgende ontleden door het hele ledemaat, peeling van de huid af voorzichtig, zonder enige schade. </li></ol> 2. Whole-mount immunohistochemische kleuring van Limb Skins <ol><li> Hydrateren van de ledematen huiden in 5 ml polypropyleen ronde bodem buis door het incuberen van door de gesorteerde reeks van MeOH / PBT (PBS + 0,2% Triton X-100) (75%, 50%, 25%) gedurende 5 minuten elk. Merk op dat de uitwisseling van oplossingen moeten voorzichtig om te voorkomen dat schade aan de ledematen skins. </li><li> Was twee keer voor 5 min in PBT met zachte mengen op de Nutator Mixer bij kamertemperatuur. </li><li> Blokkeer de ledematen skins met ofwel 10% Geit serum / PBS +0.2% TX100 blokkerende buffer voor de geit secundaire antilichamen of 10% Donkey serum / PBS +0.2% TX100 blokkerende buffer voor de ezel secundaire antilichamen gedurende 2 uur met een voorzichtig mengen op de Nutator Mixer op kamertemperatuur. </li><li> Plaats de ledemaat skins op een 35 x 10 mm petrischaal en overdracht door een ring tang in 2ml-microcentrifugebuis met 800μl van primaire antilichamen (juiste verdunning zoals vermeld in de tabellen) in de blokkerende buffer (ofwel 10% Geit serum / PBS +0.2 TX100% of 10% Donkey serum / PBS +0.2% TX100). Incubeer de ledematen huiden met voorzichtig mengen op de Nutator Mixer bij 4 ° C gedurende de nacht. Merk op dat meerdere primaire antilichamen afgeleid van verschillende soorten (bijvoorbeeld rat monoklonaal antilichaam + konijn polyklonaal antilichaam) kunnen gelijktijdig worden gebruikt. </li><li> Op de volgende dag, plaatst u de ledemaat skins op een 35 x 10 mm petrischaal en overdracht door een ring tang in 5 ml polypropyleen ronde bodem buis met 4 ml van de wasbuffer (ofwel 2% Geit serum / PBS +0.2% TX100 of 2 Donkey% serum / PBS +0.2% TX100). </li><li> Was vijf keer gedurende 15 minuten met voorzichtig mengen op de Nutator Mixer bij kamertemperatuur. </li><li> Plaats de ledemaat skins op een 35 x 10 mm petrischaal en overdracht door een ring tang in 2ml-microcentrifugebuis met 800μl van secundaire antilichamen in het blokkerende buffer (ofwel 10% Geit serum / PBS +0.2% TX100 of 10% Donkey serum / PBS +0,2% TX100). Normaal gesproken gebruiken we secundaire antilichamen uit Jackson ImmunoResearch (Cy3, Cy5, 1:300 verdunningen) of Invitrogen (Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 633, 1:250 verdunning). Filter het secundaire antilichaam-oplossing met behulp van 0.22μm PVDF membraan spuit filters om geaggregeerde deeltjes van de secundaire antilichamen te verwijderen. Incubeer de ledematen skins in het donker of omwikkeld met aluminium folie gedurende 1 uur met een voorzichtig mengen op de Nutator Mixer bij kamertemperatuur. Merk op dat verschillende fluorescerende geconjugeerd secundair antilichamen afgeleid van verschillende soorten kunnen gelijktijdig worden gebruikt. </li><li> Plaats de ledemaat skins op een 35 x 10 mm petrischaal en overdracht door een ring tang in 5 ml polypropyleen ronde bodem buis met 4 ml van de wasbuffer (ofwel 2% Geit serum / PBS +0.2% TX100 of 2% Donkey serum / PBS +0.2% TX100). Was vijf keer gedurende 15 minuten in het donker of omwikkeld met aluminium folie met voorzichtig mengen op de Nutator Mixer bij kamertemperatuur. </li><li> (Optie voor tegenkleuring tegen de kern) Incubeer de ledematen huiden met 4 ml van de wasbuffer (ofwel 2% Geit serum / PBS +0.2% TX100 of 2% Donkey serum / PBS +0.2% TX100) met To-Pro-3 (Invitrogen T3605 , 1:3000 verdunning) in het donker of omwikkeld met aluminium folie gedurende 10 minuten met een voorzichtig mengen op de Nutator Mixer bij kamertemperatuur temperare. Daarna, was drie keer voor 5 min met 4 ml van de wasbuffer (ofwel 2% Geit serum / PBS +0.2% TX100 of 2% Donkey serum / PBS +0.2% TX100) in het donker of verpakt door aluminium folie met zachte mixen op de Nutator Mixer bij kamertemperatuur. Merk op dat sterke en specifieke kleuring voor de kernen is waargenomen voor To-pro-3 in een specifieke emissie (HeNe 633 nm excitatie). </li></ol> 3. Montage van de Limb Skins op dia <ol><li> Plaats de ledemaat skins op een 35 x 10 mm petrischaal. Verwijderen stof, kristallen, vezels van de binnenste laag van de huid met behulp van fijne pincet onder de stereomicroscoop met een lage verlichting tot uitgebreide foto bleken te voorkomen. </li><li> Breng de ledematen skins om lijm microscopisch preparaat door een ring tang. Leg de huiden met de binnenste laag liggend naar boven op de dia (dwz naar dekglaasje). Platter de huiden zorgvuldig met fijn pincet en verwijder de carry-over wasbuffer door Kimwipe. </li><li> Monteren in anti-fade montage media zonder luchtbellen. We maken gebruik van 25 "x25" dekglaasje aan. Cure op een vlakke ondergrond in het donker (bijvoorbeeld de monsters bevestigd met Gold reagens ProLong worden 's nachts geplaatst in het donker bij kamertemperatuur voordat u deze bekijkt). Voor de lange-termijn opslag, sluit de dekglaasje aan de dia en bewaar bij 4 ° C. </li></ol> 4. Confocale microscopie <ol><li> Opzetten van passende lasers voor fluoroforen. We maken gebruik van Leica TCS SP5 confocale microscoop met drie bronnen, waaronder laser-Argon 488nm (voor Alexa Fluor 488 en GFP), DPSS 561nm (voor Alexa Fluor 568 en Cy3) en HeNe 633nm (voor Alexa Fluor 633, Cy5 en To-Pro-3) . </li><li> Gebruik opeenvolgende scanner te voorkomen of te verminderen crosstalk in waarin alle kleurstoffen in dubbele of drievoudige-gekleurde monsters worden opgewonden tegelijk. In de sequentiële scan-modus worden beelden worden vastgelegd in een volgorde. </li><li> Meer algemene informatie over de fluorescente kleurstoffen en lasers voor excitatie kunnen worden opgericht "confocale microscopie voor biologen" door Hibbs (2004) </li></ol> 5. Representatieve resultaten Whole-mount triple-label confocale microscopie immnofluorescence in de muis voorpoot huid E15.5 met antilichamen tegen de pan-endotheliale cel marker PECAM-1 (Figuur 1A-C, D blauw), de neurofilament marker 2H3 (Figuur 1A groen), en de gladde spiercel marker αSMA (Figuur 1A, B rood) onthulde een karakteristiek patroon van vertakking αSMA + slagaders, in lijn met 2H3 + perifere zenuwen in de ledematen huid. Naast het bloedvat vertakking, is dit onderdeel skin vasculatuur model gebruikt om de patronen van lymfevat vertakkingen met behulp van antilichamen tegen het lymfatische endotheelcel marker LYVE-1 (figuur 1D, E rood) en Neuropilin2 (NRP2) (figuur 1D, F groene studie ). <img src="/files/ftp_upload/2620/2620fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. (AC) Slagaders lijn te brengen met perifere zenuwen in de embryonale ledematen huid. Whole-mount triple-label confocale microscopie immnofluorescence met antilichamen tegen de pan-endotheliale cel marker PECAM-1 (AC, blauw), de neurofilament marker 2H3 (A, groen), en de gladde spiercellen marker αSMA (A en B, rood ) is weergegeven. Bij E15.5, 2H3 + perifere zenuwen (open pijlen) associëren met slagaders (pijlpunten), die vallen onder αSMA + gladde spiercellen. (DF) Lymfatische bloedvaten in de embryonale ledematen huid. Triple-label confocale microscopie immnofluorescence met antilichamen tegen de pan-endotheliale cel marker PECAM-1 (D, blauw), de lymfatische endotheelcel marker LYVE-1 (D en E, rood) en Neuropilin2 (NRP2) (D en F, groen ) is weergegeven. Lymfevaten worden gevisualiseerd door zowel LYVE-1 en NRP2, terwijl LYVE-1 wordt ook uitgedrukt door een subset van macrofagen (open pijlpunten). Schaal bar: 100 urn.

<ol><li>Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+nerves+determine+the+pattern+of+arterial+differentiation+and+blood+vessel+branching+in+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin.</a> Cell. 109, 693-705 (2002).</li>
<li>Mukouyama, Y. S., Gerber, H. P., Ferrara, N., Gu, C., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+nerve-derived+VEGF+promotes+arterial+differentiation+via+neuropilin+1-mediated+positive+feedback%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Peripheral nerve-derived VEGF promotes arterial differentiation via neuropilin 1-mediated positive feedback.</a> Development. 132, 941-952 (2005).</li>
<li>Wang, H. U., Chen, Z. F., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+distinction+and+angiogenic+interaction+between+embryonic+arteries+and+veins+revealed+by+ephrin-B2+and+its+receptor+Eph-B4%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular distinction and angiogenic interaction between embryonic arteries and veins revealed by ephrin-B2 and its receptor Eph-B4.</a> Cell. 93, 741-753 (1998).</li>
<li>Gerety, S. S., Wang, H. U., Chen, Z. F., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symmetrical+mutant+phenotypes+of+the+receptor+EphB4+and+its+specific+transmembrane+ligand+ephrin-B2+in+cardiovascular+development%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Symmetrical mutant phenotypes of the receptor EphB4 and its specific transmembrane ligand ephrin-B2 in cardiovascular development.</a> Mol Cell. 4, 403-414 (1999).</li>
</ol>

Het vasculaire systeem is cruciaal voor orgel ontwikkeling tijdens de embryogenese, alsook voor orgel onderhoud en reproductieve functies in de volwassenen, want het levert voldoende zuurstof en voedingsstoffen naar de organen. Een goede vasculaire netwerk is goed opgezet met complexe en multi-step processen angiogenese waarbij reeds bestaande capillaire netwerk wordt gereorganiseerd met zeer vertakte en hiërarchische structuren. Hoewel talrijke werken is aangetoond dat een verscheidenheid van moleculen is betrokken bij...

Antilichamen Pan-endotheliale cel marker <table border="1"><tbody><tr><td> Antilichaam </td><td> Soorten </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus # </td><td> Werkende staat </td></tr><tr><td> PECAM-1 </td><td> Armeense hamster (M) </td><td> Chemicon </td><td> MAB1398Z </td><td> 1:100 verdunning # 1 </td></tr><tr><td> PECAM-1 </td><td> Rat (M) </td><td> BD </td><td> 553369 </td><td> 1:300 verdunning </td></tr><tr><td> VEGFR2 </td><td> Rat (M) </td><td> eBioscience </td><td> 14-5821-82 </td><td> 1:200 verdunning </td></tr><tr><td> CD34 </td><td> Rat (M) </td><td> eBioscience </td><td> 13-0341 </td><td> 1:300 verdunning </td></tr><tr><td> Collageen IV </td><td> Konijn (P) </td><td> AbD Serotec </td><td> 2150-1470 </td><td> 1:300 verdunning # 2 </td></tr></tbody></table> Arteriële endotheelcellen marker <table border="1"><tbody><tr><td> Antilichaam </td><td> Soorten </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus # </td><td> Werkende staat </td></tr><tr><td> Neuropilin1 </td><td> Konijn (P) </td><td> The Alex Kolodkin&#39;s lab # 3 </td><td></td><td> 1:3000 verdunning </td></tr><tr><td> Unc5H2 </td><td> Geit (P) </td><td> R &amp; D </td><td> AF1006 </td><td> 1:200 verdunning </td></tr></tbody></table> Veneuze endotheelcellen marker <table border="1"><tbody><tr><td> Antilichaam </td><td> Soorten </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus # </td><td> Werkende staat </td></tr><tr><td> EphB4 </td><td> Geit (P) </td><td> R &amp; D </td><td> AF446 </td><td> 1:100 verdunning </td></tr></tbody></table> Lymfatische endotheelcellen marker <table border="1"><tbody><tr><td> Antilichaam </td><td> Soorten </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus # </td><td> Werkende staat </td></tr><tr><td> LYVE-1 # 4 </td><td> Konijn (P) </td><td> Abcam </td><td> ab14917 </td><td> 1:200 verdunning </td></tr><tr><td> LYVE-1 # 4 </td><td> Rat (M) </td><td> MBL </td><td> D225-3 </td><td> 1:200 verdunning </td></tr><tr><td> Prox-1 </td><td> Konijn (P) </td><td> Chemicon </td><td> AB5475 </td><td> 1:1000 verdunning </td></tr><tr><td> Prox-1 </td><td> Geit (P) </td><td> R &amp; D </td><td> AF2727 </td><td> 1:50 verdunning </td></tr><tr><td> Neuropilin2 </td><td> Konijn (P) </td><td> Cell Signaling </td><td> 3366 </td><td> 1; 100 verdunning </td></tr><tr><td> Podoplanin </td><td> Syrische hamster (M) </td><td> Hybridoma Bank </td><td> 8.1.1 </td><td> 1:200 verdunning </td></tr></tbody></table> Gladde spiercellen / pericyte marker <table border="1"><tbody><tr><td> Antilichaam </td><td> Soorten </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus # </td><td> Werkende staat </td></tr><tr><td> αSMA-Cy3 </td><td> Muis (M) # 5 </td><td> Sigma </td><td> c-6198 </td><td> 1:500 verdunning # 6 </td></tr><tr><td> NG2 </td><td> Konijn (P) </td><td> Chemicon </td><td> AB5320 </td><td> 1:200 verdunning </td></tr><tr><td> SM22α </td><td> Konijn (P) </td><td> Abcam </td><td> ab14106 </td><td> 1:200 verdunning </td></tr></tbody></table> Antilichamen voor GFP reporter <table border="1"><tbody><tr><td> Antilichaam </td><td> Soorten </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus # </td><td> Werkende staat </td></tr><tr><td> GFP </td><td> Konijn (P) </td><td> Invitrogen </td><td> A11122 </td><td> 1:300 verdunning </td></tr><tr><td> GFP </td><td> Rat (M) </td><td> Nacalai tesque </td><td> 04404-84 </td><td> 1:1000 verdunning </td></tr><tr><td> GFP </td><td> Chick (P) </td><td> Chemicon </td><td> P42212 </td><td> 1:300 verdunning </td></tr></tbody></table> Antilichamen voor LacZ reporter <table border="1"><tbody><tr><td> Antilichaam </td><td> Soorten </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus # </td><td> Werkende staat </td></tr><tr><td> β-gal </td><td> Konijn (P) </td><td> MP Biomedische </td><td> 55976 </td><td> 1:5000 verdunning </td></tr><tr><td> β-gal </td><td> Geit (P) </td><td> AbD Serotec </td><td> 4600-1409 </td><td> 1:500 verdunning </td></tr><tr><td> β-gal </td><td> Chick (P) </td><td> Abcam </td><td> ab9361 </td><td> 1:200 verdunning </td></tr></tbody></table> Antilichamen voor perifere axon <table border="1"><tbody><tr><td> Antilichaam </td><td> Soorten </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus # </td><td> Werkende staat </td></tr><tr><td> 2H3 </td><td> Muis (M) # 7 </td><td> Hybridoma Bank </td><td> 2H3 </td><td> 1:200 verdunning </td></tr><tr><td> Tuj1 </td><td> Muis (M) # 8 </td><td> Covance </td><td> MMS-435P </td><td> 1:500 verdunning </td></tr><tr><td> Peripherin </td><td> Konijn (P) </td><td> Chemicon </td><td> AB1530 </td><td> 1:1000 verdunning </td></tr></tbody></table> Antilichamen voor de migratie Schwann-cellen <table border="1"><tbody><tr><td> BFABP </td><td> Konijn (P) </td><td> De Thomas Müller lab # 9 </td><td></td><td> 1:3000 verdunning </td></tr></tbody></table> (P): polyklonaal antilichaam, (M): monoklonaal antilichaam # 1: geit anti-Armeense hamster-Cy3 (Jackson ImmunoResearch 127-165-160) antilichaam moet worden gebruikt als een secundair antilichaam. # 2: De Collagen IV antistof kan worden gebruikt om de bloedvaten te sporen na in situ hybridisatie. # 3: De Neuropilin1 antilichaam wordt vriendelijk verzorgd door het laboratorium van de Alex Kolodkin in de Johns Hopkins University. Schapen anti-humaan antilichaam Neuropilin1 is verkrijgbaar in R &amp; D (AF3870), hoewel we nog niet getest nog niet. # 4: De LYVE-1-antilichamen ook detecteren een subset van macrofagen in de embryonale huid. # 5: De anti-αSMA antilichaam is muizen IgG2a monoklonaal antilichaam. # 6: De Cy3-geconjugeerde αSMA antilichaam wordt gedurende 1 uur bij kamertemperatuur samen met de secsecundaire antilichamen voor andere primaire antilichamen. # 7: 2H3 antilichaam is muis IgG1 monoklonaal antilichaam tegen neurofilament. # 8: Tuj1 antilichaam is muizen IgG2a monoklonaal antilichaam tegen Neuron-specifieke klasse III beta-tubuline. # 9: De BFABP (hersen-specifieke vetzuur bindend eiwit) antilichaam wordt ter beschikking gesteld door het laboratorium van de Thomas Müller in Max-Delbrück-Center for Molecular Medicine.

whole-mount immunohistochemische analyse voor embryonale limb skin vaatstelsel: een modelsysteem voor vasculaire vertakkingen morphogenesis in embryo study

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Whole-mount immunohistochemische analyse voor de beeldvorming van de hele vasculatuur is cruciaal voor het begrijpen van de cellulaire mechanismen van vertakking morfogenese. We hebben de ledemaat huid vasculatuur model vasculaire ontwikkeling, waarbij een reeds bestaande primitieve capillaire plexus is omgevormd tot een hiërarchisch vertakte vasculaire netwerk te bestuderen. Whole-mount confocale microscopie met meerdere etikettering maakt voor robuuste beeldvorming van intacte bloedvaten evenals hun cellulaire componenten, waaronder endotheelcellen, pericyten en gladde spiercellen, met behulp van specifieke fluorescente merkers. Vooruitgang in dit onderdeel de huid vaatstelsel model met genetische studies hebben een beter begrip moleculaire mechanismen van vasculaire ontwikkeling en patroonvorming. De ledematen huid vasculatuur model is gebruikt om te bestuderen hoe perifere zenuwen een ruimtelijk model voor de differentiatie en patroonvorming van de slagaders. Deze video artikel beschrijft een eenvoudige en robuuste protocol om intact bloedvaten vlek met vasculaire specifieke antilichamen en fluorescente secundaire antilichamen, die van toepassing is voor de gevasculariseerd embryonale organen waar we in staat zijn om het proces van vasculaire ontwikkeling te volgen.

We introduceren een hele-mount immunohistochemie en laser scanning confocale microscopie met meerdere etikettering voor het analyseren van complexe vasculaire netwerk-vorming in de muis embryonale ledematen huid.

Whole-mount Immunohistochemische Analyse voor Embryonale Limb Skin vaatstelsel: een modelsysteem voor Vasculaire Vertakkingen Morphogenesis in Embryo Study

Whole-mount immunohistochemische analyse voor het in beeld brengen van het gehele vaatstelsel is cruciaal voor het begrijpen van de cellulaire mechanismen van vertakkingsmorfogenese. We hebben het model van de vaatstructuur in de ledemaathuid ontwikkeld om de vasculaire ontwikkeling te bestuderen, waarbij een reeds bestaand primitief capillair plexus wordt gereorganiseerd tot een hiërarchisch vertakt vasculair netwerk. Whole-mount confocale microscopie met meervoudige labeling maakt robuuste beeldvorming van intacte bloedvaten en hun cellulaire componenten mogelijk, waaronder endotheelcellen, pericieten en gladde spiercellen, met behulp van specifieke fluorescente markers. Vooruitgang in dit model van de vaatstructuur in de ledemaathuid, in combinatie met genetische studies, heeft het begrip van de moleculaire mechanismen van vasculaire ontwikkeling en patroonvorming verbeterd. Het model van de vaatstructuur in de ledemaathuid is gebruikt om te bestuderen hoe perifere zenuwen een ruimtelijk sjabloon bieden voor de differentiatie en patroonvorming van arteriën. Dit videoartikel beschrijft een eenvoudig en robuust protocol om intacte bloedvaten te kleuren met vaatspecifieke antilichamen en fluorescente secundaire antilichamen, dat toepasbaar is op gevasculariseerde embryonale organen waarbij we het proces van vasculaire ontwikkeling kunnen volgen.

Het algemene doel van deze procedure is het uitvoeren van een whole-mount immunohistochemische analyse voor het in beeld brengen van de volledige vasculatuur in de ontwikkelende huid van de ledematen. Dit wordt bereikt door eerst vier ledematen van het embryo af te snijden, deze vier ledematen te fixeren in 4% paraformaldehyde in PBS, en ze vervolgens te dehydrateren in 100% methanol. De tweede stap is het gebruik van een fijne pincet om de huid aan de basis van het ledemaat los te pellen.Volg de blauwe stippellijnen en pel de huid af in een schaaltje met 100% methanol. Verwijder de huid van het ledemaat. Vervolgens wordt de immunohistochemische kleuring met vaatspecifieke primaire antilichamen en fluorescente secundaire antilichamen op de huid van het ledemaat uitgevoerd.Ten slotte maakt confocale whole-mount microscopie met meervoudige labeling een robuuste beeldvorming van de gehele vasculatuur van de ledemaathuid mogelijk. Het voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals histologische analyse van dwarsdoorsneden met behulp van embryo-sectionering, is dat whole-mount immunohistochemische analyse van de vasculatuur van de ledemaathuid ons in staat stelt om niet alleen de volledige vasculatuur, inclusief de cellulaire componenten, in beeld te brengen, maar ook om processen van differentiatie, het patroon van bloedvatcellen en de vertakking van lymfevaten te bestuderen. We demonstreren de procedure samen met een postdoc uit mijn laboratorium; embryonale ledemaathuiden worden verzameld van drachtige vrouwelijke muizen.Nadat de baarmoeder is verwijderd en gewassen, werkt u onder een dissectiemicroscoop om de embryo's te scheiden en te dissecteren. Zodra de embryo's zijn gedissecteerd, is de volgende stap het verwijderen van de vier LIMS uit de embryo's met een fijne pincet. Snijd de vier ledematen af bij de schouder en gebruik vervolgens een ringpincet om de vier ledematen over te brengen naar een 24-wells plaat met ijs.Plaats twee vier-daagse ledematen per put in twee milliliter 4% PFA (paraformaldehyde) in PBS, koud en vers. Fixeer de ledematen onder zachte menging op een rotator bij 4 °C gedurende de nacht. Verwijder de volgende dag de PFA uit elke put en voeg twee milliliter PBS toe.Was de preparaten vijf minuten met zachte menging op de mutator-mixer bij kamertemperatuur. Herhaal deze wasstap tweemaal, voor een totaal van drie wasbeurten. Breng vervolgens de vier ledematen over naar een polypropyleen rondbodembuis van 5 mL met 100% methanol en bewaar deze bij -20 °C in een enzymvriezer met kritische temperatuurbeheersing en zonder automatische ondooi-functie. Na een nacht bewaren bij -20 °C kan de huid van het ledemaat worden gepeld.Dit is een van de meest kritieke aspecten van deze procedure, omdat het succes van de daaropvolgende kleuring en beeldvorming afhangt van het feit dat de huid niet beschadigd raakt. De huid van het ledemaat laat gemakkelijk los wanneer deze op deze manier wordt gedehydrateerd om de huid van de vier ledematen af te pellen. Plaats eerst het ledemaat met de ventrale zijde naar boven.Dissect vervolgens met een fijne pincet door de huid nabij de basis van het ledemaat in een rechte lijn richting de poot. Dissecteer daarna rondom het gehele ledemaat, waarbij u de huid eraf pelt terwijl u het ledemaat draait. Zodra de huid is gepeld.Begin met de whole-mount immunohistochemische kleuring van de vier ledemaathuiden. Bereid vooraf drie voorraadbuisjes van 50 milliliter voor met 75%, 50% en 25% methanol in PBT voor de rehydratie. De ledemaathuiden worden gerehydrateerd door ze gedurende vijf minuten per stap te incuberen in een gradiëntserie van methanol, van de hoogste naar de laagste methanolconcentraties.Begin met het overbrengen van de ledemaathuid naar een polypropyleen rondbodembuis van vijf milliliter die 75% methanol in PBT bevat. Na vijf minuten op de mutator-mixer wordt de 75% methanol voorzichtig afgezogen en aangevuld met 50% methanol en PBT. Vijf minuten later.Vervang de 50% methanol door 25% methanol en PBT. Aan het einde van de laatste incubatie: aspireer voorzichtig de 25% methanol PBT en vul opnieuw aan met PBT.Was de ledematenhuiden gedurende vijf minuten met voorzichtig mengen op de mutator-mixer bij kamertemperatuur. Herhaal deze wasstap één keer. Wees voorzichtig om beschadiging van de ledematenhuiden te voorkomen tijdens het wisselen van de oplossingen.Zodra de ledematenhuiden zijn gehydrateerd, worden deze geblokkeerd met de geschikte blokkeringsbuffer. Incubeer gedurende twee uur met voorzichtig mengen op de nutt-mixer bij kamertemperatuur. Plaats de ledematenhuiden na twee uur op een Petrischaal van 35 bij 10 millimeter. Gebruik vervolgens ringpincetten om de huiden over te brengen naar een centrifugebuis van twee milliliter die 800 µL primaire antilichamen bevat, verdund in de geschikte blokkeringsbuffer.Hierbij kunnen meerdere primaire antilichamen afkomstig van verschillende soorten gelijktijdig worden gebruikt. Incubeer de ledematenhuiden onder zachte menging op de mutator-mixer bij vier graden Celsius gedurende de nacht; plaats de ledematenhuiden de volgende dag in een Petri-schaal van 35 bij 10 millimeter. Breng de huiden over naar een polypropyleen ronde bodembuis van vijf milliliter met vier liters van de geschikte wasbuffer.Was vijf keer gedurende elk 15 minuten met voorzichtig mengen op de mutator-mixer bij kamertemperatuur. Vervang tijdens het wassen de gebruikte buffer zorgvuldig door nieuwe buffer voor elke wasbeurt. Bereid de secundaire antilichamen voor om geaggregeerde deeltjes van de secundaire antilichamen te verwijderen.Gebruik een 0,22 micron PVDF-membraan spuitfilter om de secundaire antilichaamoplossing in een 1,5 milliliter centrifugebuis te filteren. Centrifugeer vervolgens de gefilterde monsteroplossing 10 minuten lang bij 15.000 RPM bij vier graden Celsius om partikels en luchtbellen te verwijderen. Verzamel de gefilterde antilichaamoplossing in een microcentrifugebuis van twee milliliter.Wanneer de vijf wasbeurten zijn voltooid, worden de ledematenhuiden op een Petri-schaal van 35 bij 10 millimeter geplaatst en overgebracht naar een microcentrifugebuis van twee liter met 800 µL secundaire antistoffen in de blokkeringsbuffer. In deze stap kunnen verschillende fluorescente geconjugeerde secundaire antistoffen afkomstig van verschillende species gelijktijdig worden gebruikt. Incubeer de ledematenhuiden gedurende één uur in het donker bij kamertemperatuur met voorzichtig mengen op de mutator-mixer.Plaats na de incubatie van één uur de ledematenhuiden in een Petrischaal van 35 bij 10 millimeter en breng ze over naar een polypropyleen ronde bodembuis van vijf milliliter die vier milliliter van de passende wasbuffer bevat. Was vijf keer gedurende 15 minuten per keer in het donker met zachte menging op de Tator-mixer bij kamertemperatuur voor beeldvorming via confocale microscopie. De ledematenhuiden moeten na immunohistochemische kleuring op een objectglas worden gemonteerd.Om met deze procedure te beginnen, plaatst u de gekleurde ledematenhuiden in een Petri-schaal van 35 bij 10 millimeter, terwijl u werkt onder een stereomicroscoop met een lage verlichting. Om uitgebreide fotobleking te voorkomen, gebruikt u een fijne pincet om stofkristallen en vezels uit de binnenlaag van de huiden te verwijderen. Breng de ledematenhuiden over naar een adhesief microscopie-preparaatglas.Plaats de huiden met de binnenlaag naar boven op het objectglas, gericht naar het dekglas. Strijk de huiden vervolgens voorzichtig glad met een fijne pincet. Verwijder resterende wasbuffer met een Kimwipe.Voeg Antifa mounting media toe aan de huiden en plaats een dekglas van 25 bij 25 bovenop de preparaten. Laat de preparaten uitharden op een vlak oppervlak in het donker bij kamertemperatuur voor langdurige bewaring, waarbij u erop let dat er geen luchtbellen ontstaan. Kit het dekglas aan de objectglas vast met nagellak en bewaar bij vier graden Celsius.Het patroon van zenuwen en bloedvaten in de huid van de ledemaat van muizen bij E 15.5 wordt getoond door deze representatieve resultaten van whole-mount triple label confocale immunofluorescentiemicroscopie; de pan-endotheelcelmarker pcam one is blauw. De neurofilamentmarker two H three is groen, en de gladde spiercelmarker alpha SMA is rood. Deze beelden onthulden een kenmerkend vertakkingspatroon van alpha SMA-positieve arteriën, aangegeven door witte pijlpunten, die zijn uitgelijnd met de two H three-perifere zenuwen, aangegeven door open pijlen, naast de vertakking van de bloedvaten.Dit model van de vasculatuur van de ledemathuid kan ook het patroon van de vertakking van lymfevaten onthullen met behulp van de lymfatische endotheelcelmarker LYVE-1, in rood weergegeven, en Neuropiline-2, in groen weergegeven. Lymfevaten worden gevisualiseerd door zowel LYVE-1 als NRP-2, terwijl LYVE-1 ook tot expressie komt in een subgroep van macrofagen, aangegeven door de open pijlpunten. Deze techniek baant de weg voor onderzoekers in het veld van de vasculaire biologie om de complexe patroonvorming en de differentiatieprocessen van de vasculatuur tijdens weefselontwikkeling, weefselherstel en bij ziektecondities te onderzoeken.

whole-mount-immunohistochemical-analysis-for-embryonic-limb-skin

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit artikel beschrijft een methode voor het labelen van embryonale huid en thymus bloedvaten.

Een methode voor het labelen van bloedvaten in Embryonic Muizen

De neonatale muizen netvlies biedt een goed gekarakteriseerd fysiologisch model van angiogenese, die onderzoeken van de rol van de verschillende genen of medicijnen die angiogenese moduleren in een...

Hele Mount immunofluorescentiekleuring van de Neonatale Mouse Retina naar Angiogenese Onderzoek<em&gt; In vivo</em

Vascularisatie is de sleutel tot een succesvolle aanpak in de tissue engineering. Daarom zijn betrouwbare technologieën die voor de ontwikkeling van vasculaire netwerken in weefsel-constructen evalueren. Hier presenteren we een eenvoudige en kosteneffectieve manier te visualiseren en kwantificeren vascularisatie in vivo.

Een Full Skin Defect model te evalueren Vascularisatie Biomaterialen<em&gt; In Vivo</em

We beschrijven een microchirurgische benadering voor het genereren van een arterioveneuze (AV) -lus als model voor het analyseren van vascularisatie in vivo in een geïsoleerd en goed gekarakteriseerd omgeving. Dit model is niet alleen nuttig voor het onderzoek naar angiogenese, maar ook optimaal geschikt voor engineering axiaal gevasculariseerd en transplantable weefsels.

De arterioveneuze (AV) Loop in een klein proefdiermodel voor Angiogenese en Gevasculariseerd Tissue Engineering Studie

We presenteren een protocol voor de analyse van coronairvaten geheel muriene embryonale hart tot E15.5, met behulp van standaard immunologische werkwijzen kleuring gevolgd door optische klaring en confocale microscopie. Deze techniek maakt visualisatie van bloedvaten door het gehele hart zonder dat tijdrovende analyse van seriële secties.

Analyse van de coronaire vaten in Gewist Embryonale Hearts

Dit protocol toont een fluorescentie gebaseerde methode om de vasculatuur te visualiseren en de complexiteit ervan te kwantificeren in Xenopus tropicalis . Bloedvaten kunnen na de injectie van een fluorescerende kleurstof in het kloppende hart van een embryo worden gedetecteerd na genetische en / of farmacologische manipulaties om in vivo cardiovasculaire ontwikkeling te bestuderen.

Visualisatie en kwantitatieve analyse van embryonale angiogenese in<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Dit werk demonstreert een nieuwe aanpak om het proliferatie-, differentiatie- en vaartuigvormende potentieel van vasculaire endotheliale stamcellen (VESC's) te beoordelen door middel van transpiratie van de dikke dikvliesvoeding, gevolgd door een full-mount weefselbereiding voor microscopische observatie. Ook wordt een lineage-tracingsstrategie om het gedrag van VESC's in vivo te onderzoeken, ook voorgesteld.

Een nieuwe Mammary Fat Pad Transplantation Technique om de Vessel Generation van Vasculaire Endotheliale Stamcellen te visualiseren

Hier beschrijven we een hoge resolutie geheel-mount beeldvorming methode in de hele volwassen muis oor huid, waarmee we kunnen visualiseren vertakkende genuitdrukking en patronen van perifere zenuwen en bloedvaten, evenals immuun cel distributie.

Geheel-mount confocale microscopie voor volwassen oor huid: een modelsysteem om te studeren, Neuro-vasculaire vertakkende genuitdrukking en immuun cel distributie

Deze test maakt gebruik van embryonale stamcellen van muizen gedifferentieerd in embryoïde lichamen gekweekt in 3D-collageengel om de biologische processen te analyseren die kiemende angiogenese in vitro beheersen. De techniek kan worden toegepast voor het testen van medicijnen, het modelleren van ziekten en voor het bestuderen van specifieke genen in de context van deleties die embryonaal dodelijk zijn.

In vitro Driedimensionale kiemtest van angiogenese met behulp van embryonale stamcellen van muizen voor vaatziektemodellering en drugstests

Het huidige protocol beschrijft een uniek, klinisch relevant model van perifere arteriële ziekte dat femorale slagader en aderelektrocoagulatie combineert met de toediening van een stikstofmonoxidesynthaseremmer om hindlimb gangreen te induceren in FVB-muizen. Intracardiale DiI-perfusie wordt vervolgens gebruikt voor hoge resolutie, driedimensionale beeldvorming van de voetzool vasculatuur.

Driedimensionale beeldvorming met hoge resolutie van de voetzool vasculatuur in een Murine Hindlimb Gangreen model

Dit protocol introduceert een snelle methode voor kwantitatieve driedimensionale vasculaire beeldvorming op de hele berg met behulp van light-sheet fluorescentiemicroscopie. De werkzaamheid van de methode wordt aangetoond met behulp van het faryngeale boogslagadersysteem van het kuikenembryomodel, waarbij hemodynamische krachten worden gekwantificeerd via computationele vloeistofdynamica.

Snelle beeldvorming met hoge resolutie van de hele berg van het vaatstelsel van kleine dieren voor kwantitatieve studies

Leer whole-mount immunohistochemie voor vasculaire netwerkvorming in muizenembryo ledemathuid met confocale microscopie. Deze methode visualiseert bloedvaten en lymfevaten voor ontwikkelingsbiologisch onderzoek.

Whole-mount Immunohistochemische Analyse voor Embryonale Limb Skin vaatstelsel: een modelsysteem voor Vasculaire Vertakkingen Morphogenesis in Embryo Study (Video) | JoVE Journal

Whole-mount Immunohistochemische Analyse voor Embryonale Limb Skin vaatstelsel: een modelsysteem voor Vasculaire Vertakkingen Morphogenesis in Embryo Study

Meer video's verkennen