Associated Chromosoom Trap voor het vaststellen van lange afstand DNA-interacties

Het algemene doel van het volgende experiment is om langafstandsgeassocieerde DNA-partners te ontdekken en identificeren. Dit wordt bereikt door fixatie, cellyse en vertering van DNA door het eerste restrictie-enzym, gevolgd door ligatie om een chimerisch DNA te creëren dat bestaat uit segmenten van de twee geassocieerde genen. Vervolgens worden linkers toegevoegd aan het chimerische DNA na de tweede restrictie-vertering Om de versterking te vergemakkelijken, wordt vervolgens PCR-versterking uitgevoerd met behulp van linker- en lokaas-DNA-specifieke primers om voldoende hoeveelheden van de geassocieerde DNA-fragmenten te verkrijgen. Resultaten worden verkregen die de langafstandsgeassocieerde DNA-partners met het lokaas-DNA laten zien op basis van sequentie-analyse van de versterkte DNA-fragmenten.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals chromosoombevestigingsvangst of drie C, is dat A-C-T-S-A kan worden gebruikt om een onbekende langafstandsgeassocieerde DNA-partner effectief te identificeren. Terwijl drie C ontstond voor verificatie van alleen eerder vermoedde interacties. Om dit protocol te starten, kweekt u menselijke cellen in een incubator die is voorzien van 5% koolstofdioxide bij 37 graden Celsius totdat ze 80 tot 90% confluent zijn.

Menselijke prom acida leukemiecellen worden gebruikt voor deze demonstratie. Verzamel de cellen door ze in een NOC-buis van 50 milliliter te gieten en centrifugeer gedurende 15 minuten bij 1200 RPM. Na centrifugatie verwijdert u het medium door aspiratie.

Voeg vijf milliliter kweekmedium toe om de cellenpellets te resuspenderen. Na het tellen van de cellen met een hemo cytometer, neemt u ongeveer een keer 10 tot de zevende cellen tot een volume van 40 milliliter met RPMI 1640, medium dat 10% FBS bevat. Voeg vervolgens 1,7 milliliter 37% formaldehyde toe om de verdunde chromatine te fixeren.

Incubeer het monster gedurende 10 minuten op kamertemperatuur met zacht schudden. Na incubatie dooft u de reactie met 2,4 milliliter twee molair glycine. Centrifugeer vervolgens het monster gedurende 15 minuten bij 1200 RPM en vier graden Celsius.

Na het verwijderen van de supernatie, wast u de pellet eenmaal met 40 milliliter ijskoud PBS en centrifugeert u het monster om de gewassen cellenpellet terug te krijgen. Resuspendeer het resulterende pellet in 40 milliliter ijskoud lysisbuffer met vers toegevoegde proteaseremmers en 0,1 millimolair PMSF. Incubeer het monster in een koude kamer met rotatie gedurende 90 minuten. Centrifugeer ten slotte het monster gedurende 15 minuten bij 2.500 RPM en verwijder de supernatie en verkrijg de geïsoleerde kernen. Resuspendeer de kernen in 0,5 milliliter van een XNEB-buffer drie en voeg 15 microliter 10% SDS toe.

Incubeer het monster gedurende een uur bij 37 graden Celsius met schudden. Voeg vervolgens 45 microliter 20% Triton X 100 toe om de SDS te sekwestreren en incubeer opnieuw gedurende een uur bij 37 graden Celsius met schudden en een aliquot van een keer 10 tot de zesde. De kernen of ongeveer 15 microgram worden gebruikt voor restrictie-enzymvertering tot 55 microliter kernenoplossing.

Voeg 433 microliter een XNEB-buffer drie en 12 microliter BGL twee toe. Om een ​​totaal reactievolume van 500 liters te maken, incubeer de reactie gedurende een nacht bij 37 graden Celsius. De volgende dag inactiveert u het restrictie-enzym door 95 microliter 10% SDS toe te voegen en denatureert u het enzym door 20 minuten te verwarmen bij 65 graden Celsius.

In een waterbad voegt u zeven milliliter een x ligatiebuffer en 360 microliter 20% Triton X 100 toe. Incubeer het monster gedurende een uur bij 37 graden Celsius. Verlaag de temperatuur tot 16 graden Celsius en voeg 50 microliter 400 eenheden per microliter toe.

T vier DNA Ligase. Laat de ligatiereactie gedurende vier uur bij 16 graden Celsius incuberen en vervolgens gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Nadat de ligatie voltooid is, voegt u 300 microgram proteinase K toe en incubeert u gedurende een nacht bij 65 graden Celsius.

Voeg vervolgens vijf microgram RNAA toe en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius. Zuiver DNA door fenol-chloroform-extractie en precipiteer DNA in isopropanol. Los het geprecipiteerde DNA op in 150 microliter steriel gedistilleerd water. Om linkers toe te voegen aan het chimerische DNA, verteer eerst het DNA door twee microgram gezuiverd DNA gedurende vier tot zes uur te incuberen met vijf eenheden van msp, een bij 37 graden Celsius. Na vertering inactiveert u MSP een bij 65 graden Celsius gedurende 10 minuten.

Vervolgens precipiteer het DNA in ethanol met een microliter van vijf milligram per milliliter. Glycogeen lost het resulterende DNA-palate op in 50 microliter steriel gedistilleerd water. Meng vervolgens 50 microliter MSP een behandeld DNA met twee microliter van een 20 micromolair linker-oligonucleïde L en een microliter van een 20 micromolair oligonucleïde S, voeg vervolgens een microliter steriel gedistilleerd water en zes microliter 10 X T vier DNA Ligase-buffer toe.

Bedek het mengsel met vloeibare was. Denatureer de oligonucleotiden gedurende een minuut bij 50 graden Celsius en laat geleidelijk afkoelen tot 10 graden Celsius in een gradiënt van 0,5 graden Celsius per minuut. Gebruik een thermische cycler, voeg een microliter van 400 eenheden per microliter T vier DNA ligase toe en incubeer de reactie gedurende een nacht bij 15 graden Celsius.

De volgende dag zuivert u het linker-geligateerd DNA met behulp van een kaya quick PCR-zuiveringskit en eluteert in 50 microliter steriel gedistilleerd water. Kies vervolgens een primer voor het specifieke DNA-gebied dat onderzocht moet worden op langafstandsinteracties. In dit voorbeeld wordt Abel gebruikt als de primer of het lokaas.

Bereid het gezuiverde DNA voor voor de eerste ronde PCR door een microliter van het gezuiverde DNA te combineren met een microliter van 20 micromolair able een specifieke primer, 46