In vivo Canine spierfunctie Assay

Het algemene doel van deze procedure is om de mechanische eigenschappen van de spieren in de achterpoten van een levende hond te meten en te karakteriseren met behulp van niet-invasieve methoden. Dit wordt bereikt door de hond eerst correct te positioneren in de fysiologische opstelling. De tweede stap van de procedure is het meten en registreren van het isometrische twitch-koppel en het titanische tibiaal-tarsale flexiekoppel.

De derde stap van de procedure is het uitvoeren van excentrische contracties. De laatste stap van de procedure is het meten en registreren van de isometrische twitch, het koppel en het titanische koppel tijdens tibiale tarsale extensie. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de spierkracht van de achterpoten en de respons op herhaalde excentrische contracties aantonen via een niet-invasieve fysiologische methode.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals ex vivo-assays van geïsoleerde spieren die terminale studies zijn, is dat de hier gebruikte methode in de loop van de tijd kan worden herhaald omdat deze niet-invasief is en goed wordt getolereerd. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen de spierfysiologie, zoals de reactie van spieren op contractie-geïnduceerde beschadiging of vermoeidheid. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de therapie of diagnose van spierdystrofieën, aangezien de methode de spierfunctie meet bij honden of andere grote zoogdieren.

Dergelijke grote dieren zijn vereist in preklinische studies van vele nieuwe therapieën voorafgaand aan klinische trials en patiënten. Hoewel deze methode inzicht kan bieden in hondmodellen, kan zij ook worden toegepast op andere diermodelstelsels, zoals niet-menselijke primaten. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben vanwege de zorg die nodig is bij het plaatsen van de stimulatie-elektroden en de kennis van wat men kan verwachten van de koppelregistraties. Een visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien de stappen voor het positioneren van de elektroden moeilijk aan te leren zijn vanwege de precisie die vereist is om de maximale koppelrespons van de spieren op te wekken.

Tijdens het onderzoek worden twee protocollen, geschreven in de software voor dynamische spiercontrole (Dynamic Muscle Control of DMC), gebruikt om de stimulatie- en dataloggingparameters te definiëren. Het eerste protocol, het isometrische contractieprotocol, wordt gebruikt voor zowel de twitch- als de tetanuscontracties. Het tweede protocol, het excentrische stretch-letselprotocol, wordt gebruikt voor de excentrische contracties. De stimulatorinstellingen en de softwaresequenties die voor elk protocol worden gebruikt, zijn weergegeven in de hier getoonde tabel; twitchcontracties worden opgewekt met een stimulatie van 1 Hz.

Tetanische en excentrische contracties worden opgewekt met een stimulatie van 50 hertz. In het geval van de excentrische contractie wordt een rek over de samentrekkende spier gelegd. Deze experimenten omvatten het opwekken van verschillende typen spiercontracties, waarbij de nervus peroneus wordt gestimuleerd om twitch-, tetanische of excentrische contracties van een flexorspier op te wekken, en de nervus tibialis wordt gestimuleerd om twitch- of tetanische contracties van een extensorspier op te wekken.

Controleer na het anesthetiseren van de hond de knipperreflex om er zeker van te zijn dat het dier diep onder narcose is. Monitor de koolstofdioxide, de pulsoximetrie en de temperatuur nauwgezet. Scheer tijdens de procedure de haren op de laterale knie waar de stimulerende elektroden zullen worden geplaatst.

Plaats vervolgens de hond op de fysiologische tafel. Zet het bekkenlid in rugligging zodanig dat het femur en de tibia een rechte hoek vormen en de tibia parallel loopt aan het tafelblad; controleer of het krachtpedaal veilig kan draaien. Het moet stug aanvoelen wanneer het handmatig wordt bewogen.

Zet vervolgens de fysiologische opstelling aan en activeer het pedaal. De beweging van het pedaal wordt aangestuurd door de servomotor, die weer door de computer wordt geregeld. Plaats nu voorzichtig de poot van de hond op het voetpedaal; meet en noteer de lengte van de poot van de centrale rotatieas tot aan het uiteinde van de laterale vinger.

Zet vervolgens de poot van de hond vast in het voetpedaal met behulp van elastisch zelfklevend verband. De transducer in het pedaal registreert de kracht van de spiercontracties van de poten. Stel de stimulatie-elektroden in door de afgeschermde monopolaire 24 gauge elektroden aan te sluiten op de stimulus-isolatie-eenheid.

Reinig met handschoenen aan de handen de huid van de hond met alcohol en palpeer de nervus peroneus communis net distaal van de laterale proximale fibula met een vinger om het gebied van de zenuw te markeren; breng vervolgens voorzichtig de zwarte kathode-elektrode onder de huid in en plaats de rode anode-elektrode net extern van het periosteum onder de huid, parallel en iets distaal ten opzichte van de kathode-elektrode. Beide elektroden moeten nu intern ten opzichte van de nervus peroneus communis liggen, net distaal van het fibulakopje. Activeer daarna de stimulator op één hertz en observeer de twitch-respons op de monitor.

Pas de posities van de elektroden indien nodig in kleine stappen aan om de grootst mogelijke twitch-amplitude te verkrijgen. Zodra de elektroden goed zijn geplaatst, activeert u de DMC-software om een twitch-respons te verzamelen. De volgende stap is het uitlokken van een tetanische contractie zonder de elektroden te verplaatsen.

Stel de stimulator in zoals gespecificeerd in de tabel voor een titanische contractie. Activeer vervolgens het isometrische contractieprotocol in de software om een isometrische titanische contractie van de spier op te wekken. Het volgende experiment, het protocol voor excentrische stretch-letsel, wordt ebenfalls uitgevoerd zonder de elektroden te verplaatsen.

Stel de stimulator in voor een excentrische contractie en start de stimulatie. In dit protocol wordt de zenuw 10 keer gestimuleerd bij 50 hertz gedurende één seconde. Tijdens die ene seconde trekken de flexorspieren isometrisch samen gedurende de eerste 800 milliseconden, waarna de spier wordt gerekt tijdens de laatste 200 milliseconden.

Laat de spier vier minuten rusten na één set van 10 excentrische contracties. Herhaal het protocol voor de excentrische stretchletsel vervolgens nog twee keer, met een rustperiode van vier minuten tussen elke set om de strekspier te stimuleren; verplaats de elektroden naar de nervus tibialis door de elektroden loodrecht op de huid en proximaal ten opzichte van de oorspronkelijke elektrodeplaatsing voor flexie in te brengen. Het geschatte plaatsingspunt bevindt zich langs een lijn die de hoek van 90 graden die door de knie wordt gevormd, halveert.

De nervus tibialis ligt dieper en caudaler dan de nervus peronea communis. Verplaats de elektroden indien nodig om de optimale twitchpotentialen op te wekken. Zodra de elektroden zijn geplaatst, wek dan een maximale twitch op met behulp van het isometrische protocol zonder de elektroden te verplaatsen.

Pas de instellingen van de stimulator aan zoals gespecificeerd voor titanische contracties. Activeer vervolgens een titanische contractie van de mus tibialis tarsalis extensor en registreer deze. Het programma voor dynamische spieranalyse, of DMA-programma, wordt gebruikt om het koppel en de temporele informatie van de spiercontracties te analyseren.

In deze figuur activeerde stimulatie van de nervus tibialis bij één hertz enkelvoudige trekkingen van de musculus extensor digitorum longus van de tarsus; voor de data-analyse zijn de posities van de drie cursors als volgt ingesteld. De blauwe cursor is geplaatst op het punt waar het koppel stijgt ten opzichte van het rustkoppel. De gele cursor is geplaatst op het punt waar het koppel terugkeert naar het rustkoppel.

Na de relaxatiefase is de witte cursor niet meer nodig en wordt deze daarom rechts van de gele cursor geplaatst. Deze figuur laat zien dat isometrische tetanische koppelstimulatie van de nervus tibialis met een trein van 50 Hz pulsen gedurende 1,5 seconde resulteerde in een tetanische contractie van de m. tibialis tarsal extensor. Voor de data-analyse worden de blauwe en gele cursoren geplaatst.

Wat betreft de twitch-analyse in deze figuur werden excentrische contracties opgewekt in de tibiale tarsale flexoren. Percutane stimulatie van de nervus perinealis activeerde een initiële isometrische contractie gedurende 800 milliseconden, waarna een geforceerde stretch op het been werd uitgeoefend. Voor deze data-analyse is de blauwe cursor geplaatst op het punt waar het isometrische koppel begint te stijgen vanaf het rustkoppel.

De gele cursor wordt geplaatst op het punt waar het excentrische strekmoment begint te stijgen vanaf het isometrische plateau. De witte cursor wordt geplaatst op het punt waar het moment terugkeert naar het rustmoment. Zodra deze techniek beheerst is, kan deze in ongeveer een uur worden uitgevoerd, mits dit correct gebeurt. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om een geprint protocol met stapsgewijze controlepunten te raadplegen bij het volgen van deze procedure.

Andere methoden, zoals spierbiopsieën, kunnen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals het type spiervezel of de expressie van een transgen na de ontwikkeling ervan. Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het veld van de spierfysiologie om de reacties op lichaamsbeweging bij honden met spierdistrofie te onderzoeken. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe u een niet-invasieve spierfysiologische assay bij honden uitvoert.