Demonstratie van het gebruik van de Novel zwaartekracht Spectrometer te rekken en te meten Stapel-eiwitten

De opstelling voor gravitatiekracht bestaat uit een epi-mount, een conventionele lichtmicroscoop, een digitale camera en een computer. We gebruiken dit voor single-molecule analyse. We kunnen het krachtenevenwicht registreren of een graduele kracht uitoefenen door middel van een druppel.

Om te beginnen moeten we een glazen micropipet voorbereiden zodat deze voor dit type proces gebruikt kunnen worden. Om ongeveer 10 milligram van de bonen af te wegen die u gaat gebruiken, bereid ik gewoonlijk 2K voor. Hier hebben we vijf milliliter van wat we drie triologie gaan noemen.

Dat is waar we ons terminal Put One gaan halen. Meng dit vervolgens goed met een transferpipet en breng dan 2 mL van het mengsel aan op uw be cake. Laat de be cakes twee minuten staan en vortex daarna grondig gedurende twee minuten.

De neerwaartse verbruikte de natte twee. U wilt één purine in dubbel gedestilleerd water. pH zes koppeling.

Voeg simpelweg vijf milliliter van de koppelingsbuffer toe aan elke kraal; deze koppeling zorgt ervoor dat de kraal bindt. Vervolgens binden de antilichamen zich aan de zwevende koppeling; vortex vervolgens gedurende één minuut. Laat ze vijf minuten bezinken en gebruik de vriezer om uw glijmiddel te verkrijgen; u gaat dit verwateren van de huidige concentratie tot 5% met behulp van een koppelingsbuffer.

Neem vervolgens twee milliliters van deze oplossing en voeg deze toe; dit stelt de TER in staat om te koppelen met de terminalen die al op onze vortex aanwezig zijn. Doe dit voor twee, roteer gedurende drie. Koppelingbufferprocedure.

Voeg opnieuw vijf milliliters koppelingsbuffer toe aan uw feed cake. Meng, centrifugeer en aspireer opnieuw. Bij de vierde keer blijft er wat vloeistof op de bovenkant van de cake staan, zodat het antilichaam zich vrij kan bewegen.

Dit is ons antilichaam. Micro-pipetteer dit volume. Verdun de antilichamen tot een concentratie van 1 molar met dubbel gedestilleerd water en roteer het mengsel gedurende 30 minuten of de daarvoor bestemde tijd.

Om alle onderactieve lijm te neutraliseren, oog aan oog. We gaan het centrifugeren om de S te verwijderen. Vervolgens maakt u de inhoud waarvan het protocol is. Neem vijf milliliter van de kralen, hier zijn de kralen, intex down tooth.

Herhaal deze stap drie keer en doe vervolgens hetzelfde voor de assay die u uitvoert. Om met de voorbereiding te beginnen, moeten we eerst het eiwit verkrijgen. Ga in dit geval naar de -70 °C vriezer waar het eiwit is bewaard; het is belangrijk om dit eiwit te ontdooien en op te warmen.

Dit is nu veel meer geconcentreerd dan wat we in onze assay willen gebruiken. Daarom brengen we dit terug naar ongeveer vijftien en brengen we dat over in de tip. Daarna moet dit, omdat we een nauwkeurig volume nodig hebben nadat we het volume hebben verminderd tot ongeveer 5 µL voor de grote beads; we nemen een groter volume, namelijk 10 µL van deze voorbeeld-bead.

En dat zal een mooi resultaat geven; we voegen hier ongeveer 350 µL assaybuffer toe aan de microcentrifugebuis om de uiteindelijke concentratie te verkrijgen. We gaan dit nu mengen via vortexen; we zetten de vortex aan en voeren dit uit. Nu is het tijd om daadwerkelijk de flow te construeren waarop onze kralen zullen verblijven.

Ik plaats deze standaard microscoopglasplaat in een oplossing van 1% en deze wordt behandeld met een lijm om de verankeringen aan het oppervlak van het glas te bevestigen, zowel op de dekglasjes als op de microscoopglasplaten. Ik heb de randen al behandeld en ik zal dit dunnere stuk glas op een dikkere microscoopglasplaat aanbrengen. Deze kamer zal relatief klein zijn.

Hier is een kleine, en deze is beschadigd. Weer zo'n geval dat we elke dag tegenkomen. Het middel maakt het beter, een betere verbetering.

Hier proeven we voor de laatste keer de 25 jaar oude variant voordat we de cracker en de kaas gaan toevoegen. En u heeft er een paar gemist. Slechts enkele hebben geproefd, slechts enkele.

En als u hier goed kijkt, kunt u de kraal daadwerkelijk zien. Voor de tip begin ik simpelweg met het aantikken van het gebied waar de kraal zich bevindt en daarna vul ik de rest van het oppervlak van de objectglas hier in met ongeveer 40 µL, zodat we dit objectglas in verschillende oriëntaties kunnen plaatsen zonder dat we ons zorgen hoeven te maken dat de kralen naar beneden migreren. U heeft geen schroef nodig om mijn monster te fixeren; ik zet het vast aan de achterkant van de lijn en ik monteer het objectglas, waarbij ik een extra clip gebruik om alles stabieler te houden. Vervolgens kunnen we het objectief plaatsen.

Dit is een afstandsbediening die we gebruiken om de positie van de slide te bepalen; alles is ingeschakeld, inclusief de camera. We kunnen beginnen met het monitoren op potentiële beads door simpelweg het videoscherm in de gaten te houden. Die aan de linkerkant heeft een kleinere bead, en deze kleinere bead lijkt op de andere kleinere beads die daar gewoon op het oppervlak van de lop liggen.

Echter, het kraalpaar op de glijplaat heeft een kraal die in focus komt wanneer het oppervlak van de LOP-kraal buiten focus is, wat aangeeft dat die kraal zich in een ander focusvlak bevindt dan de andere kraal op de glijplaat; het paar op de rechterzijde (A) laat zien hoe paren op een glijplaat kunnen werken. We plaatsen de glijplaat en voeren een rotatie uit onder verschillende hoeken, wat ons verschillende lengtes geeft, waarna we rotatie toepassen. We zien een weergave van hoe een kraalpaar er via een computer zou kunnen uitzien.

We vinden beide. In dit geval kunnen we de opgegeven maatstaf weglaten, en hier laten we de F ook weg. Bedankt voor het kijken.

Veel succes met uw verstoring. Er is tijd om te dansen. Bovendien, denk niet dat niemand de mijne zal winnen.

Mijn vrienden zijn druk bezig om het te bemachtigen. Alles is aan mij gelaten. Waar is dat meisje met wie ik kwam?

Ze gaat weg met mijn vriend. Ze denkt echt dat ze dat is. Weet ze niet wat een echte man is.

Rijd opnieuw, rechts opnieuw, mechanische stier. Laat het los. Rechts, rechts, helemaal beneden in Mexico.

Ik hou van de manier waarop de rondes vanavond gaan. Mechanische stier. Ga niet vertragen.

Geef me 5 seconden om me neer te zetten als je klaar bent met mijn linkerhand. Om alleen mijn rechterhand te gebruiken. Ja, met mijn linkerhand ga ik gewoon rechts gebruiken.