Name: Demonstratie van het gebruik van de Novel zwaartekracht Spectrometer te rekken en te meten Stapel-eiwitten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-19T11:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 51 s
Description: Leer een nieuwe zwaartekrachtspectrometer te gebruiken voor het meten van moleculaire krachten in eiwitten. Deze methode biedt waardevolle inzichten voor neurowetenschap en biophysica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit materiaal is gebaseerd op werk ondersteund door de National Science Foundation onder Grant nummer 0842736.

Inleiding tot de Novel GFS-configuratie Het GFS bestaat uit een aantal essentiële onderdelen: Een regelmatige lichtmicroscoop, een equatoriale montering, een camera en een computer [Figuur 1]. De verzegelde flow-cell kamer die het monster houdt is ook onmisbaar op basis van de GFS ontwerp. Het Licht microscoop is gemonteerd op de equatoriale montering, zodat de ruimte kan worden gedraaid in verschillende oriëntaties in de ruimte. Dit vermogen kan de statische vector van de zwaartekracht worden benut, zodat de monsters kunnen dynamisch georiënteerd zijn ten opzichte van de vector, zodat de kracht van de zwaartekracht kan piconewton-range kracht ladingen geven aan de monsters. De camera vervangt de licht microscoop oculair lens, zodat het kan opnemen veranderingen in de oriëntatie van het monster. Deze ruwe data wordt gedigitaliseerd en gemanipuleerd door de computer om de gegevens te interpreteren in de werkelijke kracht en de afstand metingen. De verzegelde flow-kamer is ontworpen om alle graden van vrijheid in de ruimte toe te laten zonder monster verlies. In de kamer bevindt zich het monster molecule die in de buurt een eindstation vastgebonden aan een 'anker' kraal die is gelijmd aan het oppervlak van de kamer. Het tegenovergestelde eindpunt is gebonden aan een "mobiele" kraal die vrij is van de oppervlakte van de kamer. Het is deze mobiele kraal, vrij in de assay buffer die kan worden gehandeld bij de door de zwaartekracht waardoor het strekken van de vastgebonden molecuul bij zulke lage kracht belastingen [figuur 2]. Het monster ziet er gewoon als een paar van microsferen onder de microscoop, hoewel het wel enige ervaring te nemen om goede bruikbare paren gekoppeld door hun gehechtheid aan een molecuul van paren waar beide kralen zitten op het oppervlak van de flow-kamer te onderscheiden. Een wijziging in het systeem is de toevoeging van een drijvend platform dat de GFS bezit en is geschorst door veren. In deze configuratie, nadat het monster is gedraaid in een positie waar de zwaartekracht kan optreden op het monster, kan het platform en alle componenten laten vallen tegen de veer constant. De buurt van vrije val, de kracht die op de mobiele kraal is dicht bij nul en bij een maximale uitbreiding van de bronnen ', de zwaartekracht wordt vermenigvuldigd met maar liefst twee keer. Op deze manier kan een gegradeerde kracht / afstand reactie worden getekend om het gedrag van een enkel molecuul bij verschillende belastingen van kracht te meten. 1. Microsfeer Voorbereiding <ol><li> Dompel ongeveer 10 mg van het glas of silica kralen in 0,04% 3-aminopropyltriethoxysilaan (cut met aceton) voor twee minuten. </li><li> Spoelen met twee wijzigingen van dubbel gedestilleerd water en centrifuge om pellet bij 2000 XG gedurende 5 minuten. Gooi supernatant. </li><li> Voeg 5 mL van de koppeling buffer (0,01 M pyridine gesneden met dubbel gedestilleerd water en pH tot 6,0 te passen), en schud dit mengsel. Centrifuge zoals hierboven beschreven. Herhaal deze stap drie keer. </li><li> De natte cake van kralen, voeg 2 ml van 5% gluteraldehyde oplossing (gesneden gluteraldehyde met koppeling buffer). Schud krachtig. </li><li> Onder een kap, draait kraal / gluteraldehyde mengsel gedurende 3 uur bij kamertemperatuur. </li><li> Centrifugeer zoals hierboven en zuig het supernatant. </li><li> Was de kralen in 5 ml van de koppeling buffer door schudden ze krachtig en centrifuge en zuig het supernatant. Herhaal dit drie keer meer. </li><li> Voeg ongeveer 15 pi van het gewenste antilichaam aan kralen en schud krachtig. De kralen moeten worden gedraaid gedurende 16-24 uur. </li><li> Onder de motorkap, voeg 5 ml van 1 M glycine quenching-oplossing (cut glycine met dubbel gedestilleerd water en pH tot 7,0 te passen). Schud dit mengsel en draai voor 30 minuten. </li><li> Centrifugeer en zuig het supernatant. </li><li> Voeg 5 ml wasbuffer (0,01 M Tris, pH 7,0; 0,1% natriumazide, 0,1% BSA, 0,15 M NaCl en 0,001 M EDTA). Krachtig schudden, dit, centrifuge en zuig het supernatant. Herhaal deze stap drie extra keer. </li><li> Verandering buffer met een laag zout buffer (0,1 M KCl, 0,02 M imidazool, 5 mM MgCl 2, aan te passen aan pH 7,0). Herhaal dit drie keer. </li></ol> 2. Voorbeeld Bevestiging aan Microsferen <ol><li> Neem een ​​kleine hoeveelheid bereide kralen (echter ongeveer 2 pi van elke taart van kralen, als er een grote discrepantie in diameter tussen de partijen, is het voordelig om gebruik rond een 08:01 verhouding van groot tot klein kralen) en ze toe te voegen aan een microcentrifugebuis met assay buffer. Verlagen de concentratie van uw proteïne tot ongeveer 5 uM, met behulp van de assay buffer. Voor te bereiden op zijn minst een totaal volume van 400 ul met inbegrip van de buffer, het eiwit, en de kralen. </li><li> Draai dit mengsel bij ongeveer 1 RPM voor 3 uur (als het eiwit is te veel opgewonden, zal het aggregaat en onbruikbaar). </li></ol> 3. Slide Kamer Voorbereiding <ol><li> Vacht een dikke microscoopglaasje met 0,01% nitrocellulose (in amylacetaat). Laat deze dia drogen voor ongeveer 10 minuten. </li><li> Met een scherpe glassnijder, knippen deksel schuiven om zo een kamer te maken. Dit vereist vier stroken glas. </li><li> Gebruik het feitORY rand van het glas en hark het over een uitstrijkje van vacuüm vet aan beide zijden van de rand. </li><li> Druk op vet gecoate strips op gedroogde nitrocellulose bedekt dia naar een kader aan te maken op het oppervlak van de dia. </li><li> Pipetteer ongeveer 2 pl van kraal / eiwitmengsel door te tikken op het oppervlak van pipetter van glas in de doos. </li><li> Voeg ongeveer 20 tot 400 ul van een laag zout buffer afhankelijk van hoe groot de kamer is. </li><li> Druk op een dekglas op de top van de box die reeds is voorzien van vacuüm vet om de verzegelde kamer en gebufferd afwerking. </li><li> Laat glijbaan zitten op een niveau plaats, zodat de kralen hebben ruimschoots de tijd om zich te verankeren aan de nitrocellulose. </li></ol> 4. GFS Data Acquisition <ol><li> Mount slide op GFS podium </li><li> Controleren wat de GFS camera opnemen en zoeken naar legitieme "kraal paren," waarin de kleine microsfeer is bevestigd nabij de evenaar van de grote microsfeer. </li><li> Wanneer een potentiële kraal paar is gevonden, gaan door de diepte van de focus te bepalen of de "mobiele" kraal is niet rust op het oppervlak van de dia. </li><li> Zodra een geschikt paar is geïdentificeerd, noteer hoek mobiele kraal is uit de buurt van d max (d max = de maximale afstand tussen de hartlijnen van de gekoppelde microsferen). Verplaats de mogelijkheden in de juiste positie om de video te verwerven. </li><li> De hoek van slag van het GFS moet voldoende zijn om d min, d max, en d min, die zou kunnen noemen voor de 25-90 graden, afhankelijk van de lengte van het molecuul vast te leggen. </li><li> RECORD als het paar reist van d min tot d max en weer terug naar d min. </li><li> Het is een goed idee om ook een film opneemt van de achtergrond, zodat het kan later worden afgetrokken voor analyse. </li><li> Als het uitvoeren van een GFS drop, terug naar de ruimte om d max en neem het laten vallen op ten minste 60 frames per seconde. De kritische deel is de eerste oscillatie, maar lange opnametijden kan ook gebruikt worden voor dynamische studie. </li></ol> 5. GFS Data Analysis <ol><li> Transformeren ruwe video in digitaal "thresholded" beeld en uitvoeren macro in ImageJ om het zwaartepunt positie van elke kraal vast te stellen in elk frame van de video. Dit is ook voor de daling video. </li><li> Dump de X, Y en het gebied van gegevens uit ImageJ in Excel en plot van de punten. </li><li> Als u een goede kraal paar werd overgenomen door video, een opmerkelijke bult in de grafiek is een indicatie van de kralen worden op hun dichtst (d min) en aan de top van de grafiek is de positie van d max. </li><li> Met behulp van deze gegevens, moet de straal van elke kraal precies te zijn in ImageJ worden bepaald en al deze informatie wordt in de geneste vergelijking: d = [(g sin α) 2 + (g cos α + d max - g) 2] 0,5 g = [d min 2 + r b 2 - (r + r een b) 2] 0,5 = r b sin β c = d max - r een - g (D = afstand tussen de hartlijnen; g = kracht van de zwaartekracht, α = de hoek in graden parallel aan de doelstelling lens; r b = straal van mobiele kraal, r = straal van een verankerde kraal; β = hoek van gehechtheid uit de as van de evenaar van de verankerde kraal. </li><li> Met behulp van de gemonteerd straal van de mobiele kraal, die ook geeft het volume, en gezien de dichtheid van de kraal, de kracht van de mobiele kraal verleent op het molecuul kan worden berekend in picoNewtons na de opwaartse druk van het oplosmiddel is afgetrokken. Deze methode meet de kracht op de vastgebonden molecuul in picoNewtons en berekent de absolute molecuul lengte tussen antilichaam bijlagen in nanometers. F = V (db) een (F = kracht, V = volume, d = dichtheid van het glas microsfeer, a = versnelling gevolg van de zwaartekracht, b = de dichtheid van het verplaatste water). </li></ol> 6. Representatieve resultaten: Als de kraal prep is dit juist gebeurt, zal er minimaal kraal samenvoeging, hoewel er misschien nog af en toe een kraal klonteren. Wanneer bekeken door de omvang, moet er een redelijke verdeling van de kralen al gepaarde of niet in de kamer. Het is belangrijk te minimaliseren trillingen zoveel mogelijk, om dit te doen of een lucht-tafel, speciale schokabsorberende voetjes voor een statief dat een EQ monteren bezit, of op het systeem dat gebruik maakt van bronnen kunnen worden gebruikt voor trillingsisolatie. Een andere nuttige tip met betrekking tot de verzegelde kamer stroom is om het te laten staan ​​voor ongeveer vijf minuten op een niveau van tafel nadat deze volledig is gebouwd. Hierdoor kunnen eventuele losse grotere kralen naar beneden zweven door de buffer en de rest in de laag van nitrocellulose. Als de dia waren in plaats daarvan direct gemonteerd na voltooiing, zou de onderzoeker voortdurend te maken hebben met kralen letterlijk vliegen door het gezichtsveld, en als dit gebeurt tijdens de video-acquisitie kan corrupt ee experiment. Als dit goed wordt gedaan, is kraal vlucht aanzienlijk geminimaliseerd en schoner video resultaten. Wanneer een potentiële kraal paar is geïdentificeerd door de GFS exploitant, is het nuttig om het gebracht door middel van een eerste rotatie om het gedrag van het paar te controleren. In zeldzame gevallen is de grote kraal niet stevig bevestigd aan de dia. Als dit gebeurt, is er geen gebruik in het benutten van het paar, omdat het is van cruciaal belang dat de grotere kraal verblijf in een vaste positie door de duur van de overname verankerd. Als het paar is stabiel en vertoont niet 'verankerd kraal roll, "dan is het geschikt is voor experimenten. Een perceel van kraal afstanden ten opzichte van verandering in de hoek ten opzichte van de zwaartekracht kan worden gebruikt om de verkregen gegevens te evalueren. Een goede vertegenwoordiger resultaat zou tonen weinig scheiding op een plateau en als de mobiele kraal bevrijdt zich van de verankerde kraal als gevolg van de invloed van de zwaartekracht, de grafiek zal meer scheiding te kunnen aantonen. Dit gaat door totdat een mooie piek is bereikt, dat heet d max en de curve naar beneden begint weer terug te keren naar de basislijn d min [Figuur 1]. In ideale omstandigheden, deze handtekening is symmetrisch. Een niet-representatieve resultaat zou laten zien een grafiek met onsamenhangende patronen toont geen duidelijke d min-d max-d min patroon, of het zou aantonen scheidingen die ordes van grootte te hoog voor een enkel molecuul aangeeft misschien was er een stukje stof tussen de kralen, of misschien dat de mobiele kraal was gewoon helemaal niet bevestigd. Het proces van het vinden van het paar, schieten, verwerken en analyseren van het heeft vele gaten stoppen van misbruik kraal paren worden afgemaakt uit. Dus, als je aan het einde van het gehele proces en je hebt een molecule lengte die in overeenstemming is met eerdere resultaten, kan men er veel vertrouwen in dat de oorspronkelijke kraal paar representatief is en kan worden opgenomen in de resultaten. Op een goede dag, kan ongeveer de helft van de kraal paren schot worden genomen door middel van een legitieme data punt te worden. Zo is de lengte van de opgerolde spoel van myosine tussen MF20 en MF30 antilichamen, bekend op basis van EM-gegevens en de AFM, data tot 100 nm 2,7,8,9 aanpak. Als het resultaat is een paar keer deze lengte, heeft het monster samengevoegd. De hier gepresenteerde resultaten zijn van de standaard GFS rotatie experimenten en aantonen dat er een afstand van 96 nm ± 5 nm, [figuur 2] die nauw is het eens met de metingen van de MF30 (die bindt aan de N-terminus van myosine subfragment-2) en MF20 (wat bindt in het licht meromyosin) antilichaam afstand op myosine afgeleid uit de literatuur waarden [figuur 3]. <img src="/files/ftp_upload/2624/2624fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. GFS configuratie. Grote delen van het GFS zijn gelabeld. <img src="/files/ftp_upload/2624/2624fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Schematische voorstelling van GFS principe. Linkerkant toont zwaartepunt van de mobiele kraal op een minimale afstand van zwaartepunt van verankerd kraal. Omdat GFS is gedraaid, mobiele kraal samenvalt met vector van de zwaartekracht die ook parallel loopt met de as van de vastgebonden molecuul. In deze positie, de afstand tussen de hartlijnen van de mobiele en verankerd kralen is een maximum. Rechts boven ziet u een vertegenwoordiger van een slice GFS film. Rechtsonder is een beeld van het GFS ondergaan rotatie. <img src="/files/ftp_upload/2624/2624fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3 Vertegenwoordiger resultaat dat d min aan de linkerkant van de grafiek;. D max bij een relatieve scheiding van 17,78 micron, en een terugkeer naar d min rond de baseline van ongeveer 17,75 micron van de relatieve afstand tussen de kralen. <img src="/files/ftp_upload/2624/2624fig4.jpg" alt="Figuur 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4. Vertegenwoordiger gevolg van de SBO-rotatie experiment met afstand tussen de MF20 en MF30 antilichamen gemiddeld 96 nm. Dit komt overeen met de lengte van de S2. <img src="/files/ftp_upload/2624/2624fig5.jpg" alt="Figuur 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 5"> Figuur 5. Myosine II dimeer gebruikt om de eventuele bijlagen te tonen voor gebruik met de GFS waaronder antilichaam en / of actine bijlagen. Verschillende bevestiging mogelijkheden biedt voor verschillende GFS strategieën om de verschillende regio's te meten, of om kracht loodrecht parallel toe te passen of de roede domein van de myosine dimeer.

<ol><li>Schwaiger, I., Sattler, C., Hostetter, D. R., Rief, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+myosin+coiled-coil+is+a+truly+elastic+protein+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">The myosin coiled-coil is a truly elastic protein structure.</a> Nat. Mater. 1, 232-235 (2002).</li>
<li>Root, D. D., Yadavalli, V. M., Forbes, J. G., Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coiled-coil+nanomechanics+and+uncoiling+and+unfolding+of+the+superhelix+and+alpha-helices+of+myosin%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Coiled-coil nanomechanics and uncoiling and unfolding of the superhelix and alpha-helices of myosin.</a> Biophysical Journal. 90, 2852-2866 (2006).</li>
<li>Nishizaka, T., Miyata, H., Yoshikawa, H., Ishiwata, S., Kinosita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbinding+force+of+a+single+motor+molecule+of+muscle+measured+using+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Unbinding force of a single motor molecule of muscle measured using optical tweezers.</a> Nature. 377, 251-254 (1995).</li>
<li>Gawalapu, R. K., Root, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+labeling+and+computational+analysis+of+the+strut+of+myosin%27s+50+kDa+cleft%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Fluorescence labeling and computational analysis of the strut of myosin's 50 kDa cleft.</a> Arch. Biochem. Biophys. 456, 102-111 (2006).</li>
<li>Kellermayer, M. S. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+and+manipulating+individual+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules+Physiol.+Meas%22%5BJournal%5D)">Visualizing and manipulating individual protein.</a> Molecules Physiol. Meas. 26, R119-R153 (2005).</li>
<li>Shimizu, T., Dennis, J. E., Masaki, T., Fischman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axial+arrangement+of+the+myosin+rod+in+vertebrate+thick+filaments%3A+immunoelectron+microscopy+with+a+monoclonal+antibody+to+light+meromyosin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Axial arrangement of the myosin rod in vertebrate thick filaments: immunoelectron microscopy with a monoclonal antibody to light meromyosin.</a> J. Cell Biol. 101, 1115-1123 (1985).</li>
<li>Godfrey, J. E., Harrington, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-association+in+the+myosin+system+at+high+ionic+strength.+I.+Sensitivity+of+the+interaction+to+pH+and+ionic+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Self-association in the myosin system at high ionic strength. I. Sensitivity of the interaction to pH and ionic environment.</a> Biochemistry. 9, 886-893 (1970).</li>
<li>Root, D. D., Stewart, S., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+docking+of+myosin+and+actin+observed+with+resonance+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Dynamic docking of myosin and actin observed with resonance energy transfer.</a> Biochemistry. 41, 1786-1794 (2002).</li>
<li>Xu, J., Root, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+Selection+during+Weak+Binding+at+the+Actin+and+Myosin+Interface%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Conformational Selection during Weak Binding at the Actin and Myosin Interface.</a> Biophys. J. 79, 1498-1510 (2000).</li>
<li>Sattin, B. D., Pelling, A. E., Goh, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+base+pair+resolution+by+single+molecule+force+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">DNA base pair resolution by single molecule force spectroscopy.</a> Nucleic Acids Res. 32, 4876-4883 (2004).</li>
</ol>

Bij het omzetten van een film naar een digitaal thresholded voorstelling, is het cruciaal voor de thresholded afbeelding om het hetzelfde gebied in elk frame van de video te behouden. Omdat de kralen in een kraal paar bewegen onafhankelijk van elkaar, kan een eventuele verschuiving in de thresholded gebieden ook de oorzaak van de relatieve afstanden tussen de hartlijnen van de kralen te drijven en de invoering van belangrijke fouten. Het beheersen van de drempel gebied verminderde de fout vijfvoudige in de verte metinge...

<table><tbody><tr><td>3-Aminopropyltriethoxysilaan</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>919-30-2</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Fisher Scientific</td><td>A18P-4</td><td></td></tr><tr><td>Pyridine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>110-86-1</td><td></td></tr><tr><td>Glutaaraldehyde</td><td>Fisher Scientific</td><td>G7776</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Research Organics</td><td>BP381-1</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9682T</td><td></td></tr><tr><td>Natriumazide</td><td>Amresco</td><td>71289</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>AMR-0332-100G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>MSI</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>Nitrocellulose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60443</td><td></td></tr><tr><td>N,N-Dimethylformamide</td><td>Extracted from Large New</td><td>D4254</td><td></td></tr><tr><td>Skeletale myosin II van konijn</td><td>Zeelandse Witte Konijnen (7-8)</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>MF30-antilichaam (9-10)</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>MF30</td><td></td></tr><tr><td>MF20-antilichaam (6)</td><td>Hybridoma Bank</td><td>MF20</td><td></td></tr><tr><td>Laboratoriummicroscoop</td><td>Boreal</td><td>WW57905M00</td><td></td></tr><tr><td>Equatoriale montering</td><td>Celestron</td><td>CG-5</td><td></td></tr><tr><td>Digitale videocamera</td><td>Sony Corporation</td><td>XCDV60</td><td></td></tr><tr><td>Schuifmaatsysteem</td><td>Cabelas</td><td>IA-415482</td><td></td></tr><tr><td>Drukveer</td><td>Jones Spring Co.</td><td>723</td><td></td></tr><tr><td>Trekveer</td><td>Jones Spring Co.</td><td>770</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Fire-i drivers &amp;amp; applicatie</td><td>Unibrain</td><td>3.80</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

demonstratie van het gebruik van de novel zwaartekracht spectrometer te rekken en te meten stapel-eiwitten

Demonstrating the Uses of the Novel Gravitational Force Spectrometer to Stretch and Measure Fibrous Proteins

De studie van macromoleculaire structuur is geworden van cruciaal belang voor het ophelderen van de moleculaire mechanismen en functie. Er zijn verschillende beperkte, maar belangrijke bioinstruments geschikt voor het testen van de kracht afhankelijkheid van structurele kenmerken in eiwitten. Schaal is een beperkende parameter over hoe nauwkeurig onderzoekers kunnen peer in de nanomechanical wereld van moleculen, zoals nucleïnezuren, enzymen, en de motor eiwitten die levensverlengend werken uit te voeren. Atomaire kracht microscopie (AFM) is goed afgestemd op eigen structuren van de vezelachtige eiwitten te bepalen met een resolutie van afstand op gelijke voet met elektronenmicroscopie. Echter, in AFM kracht studies, de krachten zijn meestal veel hoger dan een enkel molecuul kan ervaring 1, 2. Optische vallen (OT) zijn erg goed in het bepalen van de relatieve afstand tussen de kralen opgesloten en ze kunnen overbrengen zeer kleine krachten 3. Echter, ze niet toegeven accurate absolute lengte van de moleculen onder studie. Moleculaire simulaties geven ondersteunende informatie om dergelijke experimenten, maar zijn beperkt in de mogelijkheid om het dezelfde grote moleculaire afmetingen, lange tijd frames, handvat en overtuigen sommige onderzoekers in de afwezigheid van andere bewijsstukken 2, 4. De zwaartekracht spectrometer (GFS) vult een kritische niche in het arsenaal van een onderzoeker door middel van een unieke combinatie van vaardigheden. Dit instrument is in staat om het genereren van krachten meestal met 98% of beter nauwkeurigheid van de femtonewton reeks tot de nanonewton bereik. De afstand metingen op dit moment in staat zijn om het oplossen van de absolute moleculaire lengte tot vijf nanometer, en de relatieve kraal paar afstanden met een precisie die vergelijkbaar met een optische val. Ook kan het GFS bepalen uitrekken of afrollen waar de kracht ligt in de buurt evenwicht, of een gegradeerde kracht om naast elkaar tegen alle gemeten structurele veranderingen. Het is zelfs mogelijk om te bepalen hoeveel aminozuur residuen zijn betrokken bij het ​​afrollen gebeurtenissen onder fysiologische kracht belastingen 2. In tegenstelling tot in andere methoden waar sprake is van een uitgebreide kalibratie van kracht dat elke test moet voorafgaan, de GFS vereist geen zo&#39;n kracht kalibratie 5. Door het aanvullen van de sterke punten van andere methoden, zal het GFS brug hiaten in het begrijpen van de Nanomechanica van vitale eiwitten en andere macromoleculen.

Dit is een stap-voor-stap handleiding toont het doel, de werking, en representatieve resultaten van de roman zwaartekracht spectrometer.

Demonstratie van het gebruik van de Novel zwaartekracht Spectrometer te rekken en te meten Stapel-eiwitten

De studie van macromoleculaire structuren is essentieel geworden voor het ontrafelen van moleculaire mechanismen en functies. Er zijn verschillende beperkte, maar ...

De opstelling voor gravitatiekracht bestaat uit een epi-mount, een conventionele lichtmicroscoop, een digitale camera en een computer. We gebruiken dit voor single-molecule analyse. We kunnen het krachtenevenwicht registreren of een graduele kracht uitoefenen door middel van een druppel.Om te beginnen moeten we een glazen micropipet voorbereiden zodat deze voor dit type proces gebruikt kunnen worden. Om ongeveer 10 milligram van de bonen af te wegen die u gaat gebruiken, bereid ik gewoonlijk 2K voor. Hier hebben we vijf milliliter van wat we drie triologie gaan noemen.Dat is waar we ons terminal Put One gaan halen. Meng dit vervolgens goed met een transferpipet en breng dan 2 mL van het mengsel aan op uw be cake. Laat de be cakes twee minuten staan en vortex daarna grondig gedurende twee minuten.De neerwaartse verbruikte de natte twee. U wilt één purine in dubbel gedestilleerd water. pH zes koppeling.Voeg simpelweg vijf milliliter van de koppelingsbuffer toe aan elke kraal; deze koppeling zorgt ervoor dat de kraal bindt. Vervolgens binden de antilichamen zich aan de zwevende koppeling; vortex vervolgens gedurende één minuut. Laat ze vijf minuten bezinken en gebruik de vriezer om uw glijmiddel te verkrijgen; u gaat dit verwateren van de huidige concentratie tot 5% met behulp van een koppelingsbuffer.Neem vervolgens twee milliliters van deze oplossing en voeg deze toe; dit stelt de TER in staat om te koppelen met de terminalen die al op onze vortex aanwezig zijn. Doe dit voor twee, roteer gedurende drie. Koppelingbufferprocedure.Voeg opnieuw vijf milliliters koppelingsbuffer toe aan uw feed cake. Meng, centrifugeer en aspireer opnieuw. Bij de vierde keer blijft er wat vloeistof op de bovenkant van de cake staan, zodat het antilichaam zich vrij kan bewegen.Dit is ons antilichaam. Micro-pipetteer dit volume. Verdun de antilichamen tot een concentratie van 1 molar met dubbel gedestilleerd water en roteer het mengsel gedurende 30 minuten of de daarvoor bestemde tijd.Om alle onderactieve lijm te neutraliseren, oog aan oog. We gaan het centrifugeren om de S te verwijderen. Vervolgens maakt u de inhoud waarvan het protocol is. Neem vijf milliliter van de kralen, hier zijn de kralen, intex down tooth.Herhaal deze stap drie keer en doe vervolgens hetzelfde voor de assay die u uitvoert. Om met de voorbereiding te beginnen, moeten we eerst het eiwit verkrijgen. Ga in dit geval naar de -70 °C vriezer waar het eiwit is bewaard; het is belangrijk om dit eiwit te ontdooien en op te warmen.Dit is nu veel meer geconcentreerd dan wat we in onze assay willen gebruiken. Daarom brengen we dit terug naar ongeveer vijftien en brengen we dat over in de tip. Daarna moet dit, omdat we een nauwkeurig volume nodig hebben nadat we het volume hebben verminderd tot ongeveer 5 µL voor de grote beads; we nemen een groter volume, namelijk 10 µL van deze voorbeeld-bead.En dat zal een mooi resultaat geven; we voegen hier ongeveer 350 µL assaybuffer toe aan de microcentrifugebuis om de uiteindelijke concentratie te verkrijgen. We gaan dit nu mengen via vortexen; we zetten de vortex aan en voeren dit uit. Nu is het tijd om daadwerkelijk de flow te construeren waarop onze kralen zullen verblijven.Ik plaats deze standaard microscoopglasplaat in een oplossing van 1% en deze wordt behandeld met een lijm om de verankeringen aan het oppervlak van het glas te bevestigen, zowel op de dekglasjes als op de microscoopglasplaten. Ik heb de randen al behandeld en ik zal dit dunnere stuk glas op een dikkere microscoopglasplaat aanbrengen. Deze kamer zal relatief klein zijn.Hier is een kleine, en deze is beschadigd. Weer zo'n geval dat we elke dag tegenkomen. Het middel maakt het beter, een betere verbetering.Hier proeven we voor de laatste keer de 25 jaar oude variant voordat we de cracker en de kaas gaan toevoegen. En u heeft er een paar gemist. Slechts enkele hebben geproefd, slechts enkele.En als u hier goed kijkt, kunt u de kraal daadwerkelijk zien. Voor de tip begin ik simpelweg met het aantikken van het gebied waar de kraal zich bevindt en daarna vul ik de rest van het oppervlak van de objectglas hier in met ongeveer 40 µL, zodat we dit objectglas in verschillende oriëntaties kunnen plaatsen zonder dat we ons zorgen hoeven te maken dat de kralen naar beneden migreren. U heeft geen schroef nodig om mijn monster te fixeren; ik zet het vast aan de achterkant van de lijn en ik monteer het objectglas, waarbij ik een extra clip gebruik om alles stabieler te houden. Vervolgens kunnen we het objectief plaatsen.Dit is een afstandsbediening die we gebruiken om de positie van de slide te bepalen; alles is ingeschakeld, inclusief de camera. We kunnen beginnen met het monitoren op potentiële beads door simpelweg het videoscherm in de gaten te houden. Die aan de linkerkant heeft een kleinere bead, en deze kleinere bead lijkt op de andere kleinere beads die daar gewoon op het oppervlak van de lop liggen.Echter, het kraalpaar op de glijplaat heeft een kraal die in focus komt wanneer het oppervlak van de LOP-kraal buiten focus is, wat aangeeft dat die kraal zich in een ander focusvlak bevindt dan de andere kraal op de glijplaat; het paar op de rechterzijde (A) laat zien hoe paren op een glijplaat kunnen werken. We plaatsen de glijplaat en voeren een rotatie uit onder verschillende hoeken, wat ons verschillende lengtes geeft, waarna we rotatie toepassen. We zien een weergave van hoe een kraalpaar er via een computer zou kunnen uitzien.We vinden beide. In dit geval kunnen we de opgegeven maatstaf weglaten, en hier laten we de F ook weg. Bedankt voor het kijken.Veel succes met uw verstoring. Er is tijd om te dansen. Bovendien, denk niet dat niemand de mijne zal winnen.Mijn vrienden zijn druk bezig om het te bemachtigen. Alles is aan mij gelaten. Waar is dat meisje met wie ik kwam?Ze gaat weg met mijn vriend. Ze denkt echt dat ze dat is. Weet ze niet wat een echte man is.Rijd opnieuw, rechts opnieuw, mechanische stier. Laat het los. Rechts, rechts, helemaal beneden in Mexico.Ik hou van de manier waarop de rondes vanavond gaan. Mechanische stier. Ga niet vertragen.Geef me 5 seconden om me neer te zetten als je klaar bent met mijn linkerhand. Om alleen mijn rechterhand te gebruiken. Ja, met mijn linkerhand ga ik gewoon rechts gebruiken.

demonstrating-uses-novel-gravitational-force-spectrometer-to-stretch

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Time-lapse microscopie- en beeldverwerkingstechnieken werden gebruikt om fibroblastgemedieerde gelverdichting en fibrinevezelherschikking in een milieuvriendelijke bioreactor gedurende een periode van 48 uur te observeren en te analyseren.

Observeren en kwantificeren van fibroblast-gemedieerde Fibrin Gel Compaction

Cellulosomen zijn multi-enzymcomplexen die zijn ontworpen voor het verteren van cellulose. AFM-gebaseerde SMFS werd gebruikt om de mechanische eigenschappen en vouwconfiguratie van cellulosome-geassocieerde eiwitassemblages te bestuderen. We presenteren een complete workflow voor eiwit-immobilisatie, dataverzameling en data-analyse om de interacties van individuele receptor-ligandcomplexen te bestuderen die betrokken zijn bij cellulosome-assemblage.

Onderzoeken Receptor-ligand systemen van de Cellulosome met AFM-gebaseerde Single-molecule Force Spectroscopie

Analyse van de contractiele eigenschappen van chemisch huid of doorlaatbaar gemaakt, skeletspier vezels een krachtig middel om spierfunctie beoordeeld op het niveau van de interne spiercel. In dit artikel schetsen we een valide en betrouwbare techniek bereid en getest doorlaatbaar skeletspier vezels in vitro.

Meting van de maximale isometrische kracht die door gepermeabiliseerd Skeletal Muscle Vezels

We presenteren een protocol voor de toepassing van Brillouin lichtverstrooiingsspectroscopie op elastine en trypsine-gezuiverde type I collageenvezels van de extracellulaire matrix om hun volledige elastische eigenschappen te extraheren.

Bereiding van extracellulaire matrix eiwit vezels voor Brillouin Spectroscopie

Er is onlangs een aantal FRET-gebaseerde krachtbiosensoren ontwikkeld, waardoor de proteïne-specifieke resolutie van intracellulaire kracht mogelijk is. In dit protocol laten we zien hoe een van deze sensoren, ontworpen voor de linker van het nucleoskelet-cytoskelet (LINC) complex-eiwit Nesprin-2G kan worden gebruikt om actomyosinekrachten op het nucleaire LINC-complex te meten.

Een protocol voor het gebruik van Förster Resonance Energy Transfer (FRET) -force Biosensors te meten mechanische krachten over de Nuclear LINC Complex

We beschrijven de gedetailleerde procedures en de strategieën voor het meten van de mechanische eigenschappen en mechanische ontvouwen trajecten van één eiwitmolecules met behulp van een atomic force microscope. We tonen ook representatieve resultaten als een referentie voor selectie en motivering van goed één eiwit molecuul opnames.

Kracht spectroscopie van één eiwitmolecules met behulp van een Atomic Force Microscope

Dit protocol beschrijft de covalente immobilisatie van eiwitten met een heterobifunctional silane koppelmiddel op siliciumoxide oppervlakken ontworpen voor de atomaire kracht microscopie gebaseerd enkel molecuul kracht spectroscopie die wordt geïllustreerd door de interactie van RrgA (pilus-1 tip antistoffen van S. pneumoniae) met fibronectine.

Covalente immobilisatie van eiwitten voor de enkel molecuul Force spectroscopie

Hier presenteren we een protocol voor het gelijktijdig gebruik van Förster resonance energie overdracht gebaseerde spanning sensoren voor het meten van eiwit belasting en fluorescentie herstel na photobleaching voor het meten van de dynamiek van de eiwitten waardoor de meting van kracht-gevoelige eiwit dynamiek binnen levende cellen.

Meting van de kracht-gevoelige eiwitten Dynamics in levende cellen met behulp van een combinatie van Fluorescent technieken

Ensemble force spectroscopy (EFS) is een robuuste techniek voor mechanische ontvouwing en real-time detectie van een ensemble set van biomoleculaire structuren in biofysische en biosensing velden.

Ensemble Force Spectroscopie door Shear Forces

Een unieke tissue engineering methode werd ontwikkeld om een ​​groot aantal zenuwvezels in de cultuur langwerpig door indient axon stretch groei, een vorm van het zenuwstelsel waarbij de groei van zenuwen langwerpig in combinatie met een groei van de zich uitbreidende lichaam.

Axon Stretch groei: de Mechanotransductie van neuronale groei

Leer een nieuwe zwaartekrachtspectrometer te gebruiken voor het meten van moleculaire krachten in eiwitten. Deze methode biedt waardevolle inzichten voor neurowetenschap en biophysica.

Demonstratie van het gebruik van de Novel zwaartekracht Spectrometer te rekken en te meten Stapel-eiwitten

Meer video's verkennen