Imaging C. elegans Embryo's met behulp van een epifluorescerende Microscoop en Open Source Software
March 24th, 2011
De C. elegans Embryo is een krachtig systeem voor het bestuderen van de celbiologie en ontwikkeling. We presenteren een protocol voor live beeldvorming van C. elegans Embryo's gebruik te maken van DIC optiek of met behulp van fluorescentie beschikbaar epifluorescerende microscopen en open-source software.
Dit protocol laat zien hoe dynamische gebeurtenissen in vroege CL Egan's embryo's kunnen worden geïmagerd met Norky DIC-optica of fluorescentie door gebruik te maken van algemeen beschikbare microscopen en open source software. Het protocol begint met het beschrijven hoe CL Gans embryo's worden gedissecteerd en gemonteerd voor beeldvorming. Vervolgens wordt de juiste instelling van de DIC Nor masky-optica besproken om optimale beelden met het hoogste detail te garanderen.
De kalibratie van wide field epi fluorescentie en verlichting wordt ook besproken voor het verzamelen van goede fluorescente beeldgegevens in combinatie met open source software. Goede microscopie kan celdynamica in een zich ontwikkelend embryo visualiseren. Visuele illustraties van deze methode zijn cruciaal, omdat het correct instellen van D iic Optica moeilijk is, omdat de terminologie verwarrend kan zijn en de juiste techniek moeilijk in schriftelijke vorm te beschrijven is.
Daarnaast moeten onderzoekers voorzichtig zijn met minimaliseren van lichtblootstelling bij het uitvoeren van fluorescentiebeeldvorming. Om fototoxiciteit en fotobleken te beperken, bereidt u eerst embryo's voor op beeldvorming door twee montageoplossingen te maken. De ene is gesmolten vaseline en de andere is twee tot 3% aros in buffer.
Densore aros kan worden gemaakt als de te beeldvormen structuren erg kwetsbaar zijn, wees voorzichtig om te voorkomen dat ze koken. Beide stockoplossingen worden gesmolten in de magnetron en vervolgens opgeslagen als vier tot vijf milliliter aliquoten. Op de dag van beeldvorming, smelt u een aliquot vaseline-oplossing in een temperatuurblok van 65 tot 70 graden Celsius en smelt u een aliquot aros-oplossing in de magnetron.
Weer zonder te koken. Om deze oplossingen gesmolten te houden, bewaar ze dan in een temperatuurblok. Bedek vervolgens de boven- en onderkant van twee dia's met een strook labtape en plaats een schone dia tussen de twee vastgelijmde dia's.
Pip nu een paar druppels van de gesmolten aros op de schone dia en bedek deze met een andere schone dia. De Aros verspreidt zich in een dunne vierkante pad met de wormpad voorbereid. Gebruik een dissectief scope en een platina draad om twee volwassen wormen over te brengen naar een negen tot 12 microliter druppel buffer op een 18 bij 18 millimeter dekglas.
Snijd vervolgens. Open de wormen met een naald of scalpel om de embryo's vrij te maken met de agarro-kant naar beneden. Plaats de wormpad op het 18 bij 18 millimeter dekglas en scheer eventueel overhangend agar weg met een scheermes.
Ten slotte, om het dekglas te verzegelen, breng de gesmolten vaseline-oplossing aan langs de omtrek met een penseel of tandenstoker. De cellen zijn nu klaar voor beeldvorming. Zorg ervoor dat de twee polarisatoren loodrecht op elkaar staan wanneer u de dia op de microscoop plaatst.
Zorg ervoor dat zowel wallers als prisma's buiten de lichtbaan zijn. Als het veld niet donker is, draait u de polarisator onder de condensator totdat het dat wel is. Zoek de embryo's met behulp van het 10-voudige objectief.
Kijk in de buurt van de lichamen van de worm voor groepen jonge embryo's om meerdere embryo's binnen het beeldveld te krijgen. Vermijd embryo's binnenin de worm voor de beste beelden. Wanneer de beste embryo's zijn gelokaliseerd, schakelt u over naar een objectief met hogere vergroting.
Schakel nu de filtercube naar DIC. Plaats vervolgens het bovenste objectief walstone-prisma in de lichtbaan en draai de knop op de condensator om het onderste walstone-prisma te selecteren dat overeenkomt met het objectief. Met de prisma's op hun plaats, pas de schuifschuif onder deze torentje aan om de numerieke apertuur van de lens te matchen.
Om de optimale Kohler-verlichting te krijgen, stelt u de condensator scherp totdat de rand van de condensatordiafragma het scherpst lijkt. Scherp is wanneer de grens tussen licht en donker het scherpst is of scherp staat. Om optimaal contrast te krijgen, pas de appelmuur en het prisma aan door de knop op de schuifschuif te draaien.
Nu is de microscoop bijna klaar voor gebruik. Het is tijd om aanvullende beeldvormingsparameters op de computer te bedienen met micromanager en open source software. Begin met het instellen van de cameraversterking op nul.
Schakel vervolgens over naar het opslaan van bestanden als acht bits, niet 16 bits tiffs. TIFF-bestanden kunnen later worden geanalyseerd met open source software zoals Image J. Pas vervolgens het lichtniveau aan tot waar de helderste pixels net onder de verzadigingsniveaus liggen. Als alles correct is gedaan, ziet het beeld er 3D uit met licht dat onder een hoek lijkt te schijnen.
Nu het beeld er briljant uitziet, selecteert u de embryo's die u wilt afbeelden en tekent een interessegebied. Als de microscoop een focusmotor heeft, gebruik deze om meerdere brandvlakken op elk moment te verzamelen. Open het venster voor multidimensionale acquisitie en stel het bovenste en onderste vlak van de Z-stack in door de focusknop aan te passen om het eerste en laatste brandvlak te vinden met enkele yoke-granules in focus.
Stel de stapgrootte in. Dit bepaalt het aantal verzamelde brandvlakken. Stel nu een tijdsinterval in dat lang genoeg is om alle brandvlakken te verzamelen.
De maximale tijdstippen kunnen zeer hoog worden ingesteld zodat de software beelden maakt totdat deze handmatig wordt gestopt. Stel de software in om alleen het laatst verworven beeld weer te geven, zodat het proces kan worden gevolgd. Geef nu de beelden een bestandsnaam en begin met het verzamelen van beelden.
Beeldanalyse wordt kort besproken aan het einde van de volgende sectie. Het construeren van een GFP-film is vergelijkbaar met het maken van een vier D Nor Musky DIC, maar er wordt een configuratiebestand gebruikt dat softwarebesturing van fluorescente scherven omvat. In plaats van de embryo's te lokaliseren, zorg ervoor dat het bovenste walstone-prisma niet in de lichtbaan staat en schakel de filtercube naar F-I-T-C-G-F-P.
Zorg ervoor dat de cameraversterking op 255 is ingesteld als dit bij het opstarten niet automatisch is ingesteld met behulp
Overzicht
Dit protocol demonstreert live beeldvorming van C. elegans embryo's met behulp van DIC-optica of fluorescentie. Het biedt gedetailleerde stappen voor het voorbereiden van embryo's en het optimaliseren van beeldvormingstechnieken.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Celbiologie
- Ontwikkelingsbiologie
- Microscopietechnieken
Achtergrond
- C. elegans embryo's zijn een modelsysteem voor het bestuderen van cellulaire dynamica.
- Live beeldvormingstechnieken zijn essentieel voor het observeren van ontwikkelingsprocessen.
- Juiste instelling van beeldvormingsapparatuur is cruciaal voor hoogwaardige resultaten.
- Minimaliseren van lichtblootstelling is belangrijk om fototoxiciteit te voorkomen.
Doel van de studie
- Om een uitgebreid protocol te bieden voor het beeldvormen van C. elegans embryo's.
- Om het begrip van cellulaire dynamica tijdens vroege ontwikkeling te verbeteren.
- Om toegankelijke microscopietools en open-source software te gebruiken.
Gebruikte methoden
- Dissectie en montage van C. elegans embryo's.
- Calibratie van DIC-optica en fluorescentie-instellingen.
- Gebruik van open-source software voor beeldverwerving en analyse.
- Optimalisatie van beeldvormingsparameters om hoogwaardige beelden te bereiken.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle beeldvorming van dynamische gebeurtenissen in C. elegans embryo's.
- Het belang van een juiste optische instelling voor duidelijkheid is aangetoond.
- Richtlijnen zijn gegeven voor het minimaliseren van lichtblootstelling tijdens beeldvorming.
- Het verzamelen van multi-dimensionale beeldgegevens is vergemakkelijkt.
Conclusies
- Het protocol maakt effectieve beeldvorming van C. elegans embryo's mogelijk.
- Juiste techniek en instelling zijn cruciaal voor succesvolle beeldvorming.
- Open-source software verbetert de toegankelijkheid voor onderzoekers.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Live imaging of C. elegans embryos enables mechanistic de-risking of cellular processes such as chromosome assembly and cytokinesis, providing predictive confidence in target validation for early discovery programs. The protocol leverages accessible microscopy and open-source software to support scalable, reproducible phenotypic screening in a disease-relevant system with known lineage and genetic tractability.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through direct visualization of dynamic cellular events in vivo.
- Operational Value: Supports biological de-risking by clarifying gene function in developmental pathways using fluorescent reporters or DIC contrast.
- Predictive Value: Facilitates lead identification by linking genetic perturbations to phenotypic outcomes in a high-fidelity embryonic model.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream compound evaluation using standardized embryo mounting and imaging workflows.
- Quantitative Outputs: Enables time-lapse acquisition of Z-stacks and multi-dimensional data for reproducible measurement of cellular dynamics.
- Platform Reuse: Leverages widely available epifluorescent microscopes and open-source software to reduce dependency on specialized imaging infrastructure.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Connects fundamental cellular mechanisms to developmental phenotypes with translational biomarker alignment potential.
- Preclinical Continuity: Supports risk-adjusted advancement decisions by providing dynamic, lineage-resolved data from genetic perturbation studies.
- Mechanistic De-risking: Reduces ambiguity in target validation by observing real-time consequences of gene knockdown or mutation on embryogenesis.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling hypothesis testing, pathway clarification, and phenotypic screening prior to lead optimization stages.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and biological de-risking through live imaging of embryonic cell divisions and developmental transitions.
- Screening: Enables assay standardization and reproducibility via controlled embryo mounting, illumination calibration, and open-source acquisition.
- Analytics: Generates quantitative readouts such as fluorescence intensity, nuclear morphology, and cytokinesis timing for comparative condition analysis.
- Translational Research: Aligns with preclinical validation by linking embryonic phenotypes to genetic perturbations relevant to human disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging capability across projects studying conserved cellular mechanisms in genetically tractable models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in cellular process regulation.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability through standardized protocols and open-source software compatibility.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early, in vivo phenotypic data that reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on phenotypic severity and expressivity in embryonic development.
Implementation Considerations
- Requires expertise in C. elegans handling, embryo dissection, and mounting techniques.
- Dependent on functional epifluorescent microscope with DIC optics, filter cubes, and focus motor for Z-stacking.
- Necessitates standardization of illumination levels, exposure times, and mounting solution preparation across users.
- Involves adaptation considerations for different genetic backgrounds or mutant strains affecting embryo viability or morphology.
- Includes practical limitations such as phototoxicity risk during fluorescence imaging and embryo drift during long acquisitions.
