Imaging C. elegans Embryo's met behulp van een epifluorescerende Microscoop en Open Source Software

Dit protocol demonstreert hoe dynamische gebeurtenissen in vroege CL egan-embryo's kunnen worden afgebeeld met Norky DIC-optica of fluorescentie, door gebruik te maken van algemeen beschikbare microscopen en opensourcesoftware. Het protocol begint met een beschrijving van hoe CL gans-embryo's worden gedissecteerd en gemonteerd voor beeldvorming. Vervolgens wordt de juiste configuratie van de DIC nor masky-optica besproken om optimale beelden met de hoogste detaillering te garanderen.

De kalibratie van breedveld epi-fluorescentie en belichting wordt eveneens besproken voor het verzamelen van kwalitatieve fluorescentiebeeldgegevens in combinatie met opensourcesoftware. Goede microscopie kan cellulaire dynamiek in een ontwikkelende embryo visualiseren. Visuele illustraties van deze methode zijn essentieel, aangezien het correct instellen van de Diic-optiek lastig is omdat de terminologie verwarrend kan zijn en de juiste techniek moeilijk in geschreven vorm te beschrijven is.

Daarnaast moeten onderzoekers er zorg voor dragen dat de blootstelling aan licht wordt geminimaliseerd bij het uitvoeren van fluorescentiebeeldvorming. Om fototoxiciteit en fotobleken te beperken en de embryo's voor beeldvorming voor te bereiden, worden eerst twee monteeroplossingen gemaakt. De ene bestaat uit gesmolten Vaseline en de andere uit 2 tot 3% agarose in buffer.

Dichtere aros kan worden gemaakt als de te beelden structuren zeer fragiel zijn, waarbij men voorzichtig moet zijn om koken te voorkomen. Beide stamoplossingen worden in de magnetron gesmolten en vervolgens bewaard als aliquots van vier tot vijf milliliter. Op de dag van beeldvorming wordt een aliquot vaselineloplossing gesmolten in een heatblock van 65 tot 70 °C en wordt één aliquot arosoplossing in de magnetron gesmolten.

Vermijd wederom koken. Bewaar deze oplossingen vervolgens in een warmteblok om ze gesmolten te houden. Bedek daarna de boven- en onderkant van twee objectglazen met een strip laboratoriumtape en plaats een schoon objectglas tussen de twee afgeplakte objectglazen.

Pipette nu enkele druppels van het gesmolten aros op de schone objectglas en dek dit af met een ander schoon objectglas. Het Aros verspreidt zich tot een dun, vierkant vlakje, waarmee het wormkussen is voorbereid. Gebruik een dissectiescoop en een platina draadpincet om twee volwassen wormen over te brengen naar een druppel buffer van 9 tot 12 microliter op een dekglas van 18 bij 18 millimeter.

Snijd vervolgens. Open de wormen met een naald of scalpel om de embryo's vrij te maken, met de agarzijde naar beneden. Plaats het wormenblokje op het dekglas van 18 bij 18 millimeter en snijd met een scheermes alle overhangende agar weg.

Breng tot slot, om het dekglas te verzegelen, de gesmolten vaselinelopossing langs de rand aan met een penseel of tandenstoker. De cellen zijn nu klaar voor beeldvorming. Controleer bij het plaatsen van de objectglas op de microscoop of de twee polarisatoren loodrecht op elkaar staan.

Zorg ervoor dat zowel de diafragma-schijven als de prisma's buiten het lichtpad liggen. Als het beeldveld niet donker is, draai dan aan de polarisator onder de condensor totdat dit wel het geval is. Zoek de embryo's op met het 10-voudige objectief.

Zoek nabij de wormlichamen naar groepen jonge embryo's om meerdere embryo's binnen het beeldveld te krijgen. Vermijd embryo's in de worm voor de beste beelden. Wanneer de beste embryo's zijn gelokaliseerd, kan worden overgeschakeld naar een objectief met een hogere vergroting.

Schakel nu de filterkubus over naar DIC. Plaats vervolgens het bovenste Wollaston-prisma van het objectief in de lichtweg en draai aan de ring op de condensor om het onderste Wollaston-prisma te selecteren dat overeenkomt met het objectief. Wanneer de prisma's op hun plaats zitten, past u de schuifregelaar onder deze revolver aan om deze af te stemmen op de numerieke apertuur van de lens.

Voor een optimale Köhler-verlichting stelt u de condensor scherp totdat de rand van het condensor diafragma het scherpst verschijnt. Het scherpste punt is bereikt wanneer de grens tussen licht en donker het meest helder of in focus is. Pas de apertuurring en het prisma aan door aan de knop op de schuif te draaien om een optimaal contrast te verkrijgen.

De microscoop is nu bijna klaar voor gebruik. Het is tijd om aanvullende beeldparameters op de computer te regelen met Micro-Manager en opensourcesoftware. Begin met het instellen van de cameragevinst op nul.

Schakel vervolgens over naar het opslaan van bestanden als 8-bits tiffs in plaats van 16-bits. TIFF-bestanden kunnen later worden geanalyseerd met opensourcesoftware zoals Image J. Pas daarna het lichtniveau aan zodat de helderste pixels net onder de verzadigingsniveaus liggen. Als alles correct is uitgevoerd, zal het beeld er 3D uitzien, waarbij het licht vanuit een hoek lijkt binnen te vallen.

Nu het beeld er uitstekend uitziet, selecteert u de embryo's die u wilt beelden en tekent u een regio van interesse. Als de microscoop over een focusmotor beschikt, gebruikt u deze om meerdere brandvlakken per tijdstip vast te leggen. Open het venster voor multidimensionale acquisitie en stel het bovenste en onderste vlak van de Z-stapel in door aan de focusknop te draaien om het eerste en laatste brandvlak te vinden waarop enkele dooierkorrels in focus zijn.

Stel de stapgrootte in. Hiermee wordt het aantal verzamelde brandvlakken bepaald. Stel nu een tijdsinterval in dat lang genoeg is om alle brandvlakken te verwerven.

De maximale tijdspunten kunnen zeer hoog worden ingesteld, zodat de software afbeeldingen blijft maken tot deze handmatig wordt gestopt. Stel de software zo in dat alleen de laatst verkregen afbeelding wordt weergegeven, zodat het proces kan worden gemonitord. Geef de afbeeldingen nu een bestandsnaam en begin met het verkrijgen van de afbeeldingen.

Beeldanalyse zal aan het einde van de volgende sectie kort worden besproken. Het maken van een GFP-movie is zeer vergelijkbaar met het maken van vier D nor Musky DIC, maar er wordt een configuratiebestand gebruikt dat de softwarematige besturing van de fluorescente sluiter bevat. Zodra de embryo's zijn gelokaliseerd, dient men er zeker van te zijn dat het bovenste walstone-prisma zich niet in de lichtweg bevindt en dient de filterkubus te worden omgeschakeld naar F-I-T-C-G-F-P.

Indien dit bij het opstarten niet automatisch door de software is ingesteld, zorg er dan voor dat de cameragevin op 255 staat. Een afbeeldingsbestand wordt ingesteld op het 16-bit tiff-formaat. Schakel nu de transmissielichtbron uit en klik op live imaging.

Pas de intensiteit van de uv-lichtbron en de belichtingstijd aan om een goede signaal-ruisverhouding voor het fluorescentiesignaal te verkrijgen, maar houd de lichtbelichting minimaal om de cellen te sparen. Stel vervolgens het tijdsinterval in. Bepaal het aantal tijdspunten en het aantal brandvlakken en ga nu verder met de beeldacquisitie zoals eerder beschreven.

Gebruik opensourcesoftware om de films te analyseren. Image J met de geïnstalleerde micromanager-plugin. Zeer grote films kunnen ook in Image J worden geïmporteerd met behulp van de loci-plugin. Dit is een wild-type embryo, vastgelegd met nor masky, DIC-optiek.

Posterieur bevindt zich rechtsonder en ventraal bevindt zich linksonder. De film toont een reeks beelden in één enkel brandvlak, verzameld om de 15 seconden. De afspeelsnelheid is ingesteld op 14 frames per seconde.

Dit embryo vertoont fluorescentie tijdens de eerste embryonale deling; hier is de posterieure zijde rechtsboven. Deze film toont de veranderingen in een enkel brandvlak elke 10 seconden. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe levende embryo's worden geïmageerd met behulp van zowel DIC Naski-optiek als epi-fluorescentie om dynamische gebeurtenissen te bestuderen.

We hopen dat u nu een beter inzicht heeft in het instellen van de DIC Nomar-optica om optimale beelden te verkrijgen, en dat u beseft dat u fluorescentiegegevens van hoge kwaliteit kunt verkrijgen met behulp van epi-fluorescentie-belichting, en dat u niet altijd afhankelijk bent van geavanceerdere microscopen. U kunt deze beeldvormingstechnieken ook toepassen om embryo's te onderzoeken die een specifieke genfunctie missen, om zo de genetische vereisten voor uw favoriete processen tijdens de celdeling of ontwikkeling verder te onderzoeken.