Name: Het onderzoeken van de Conformationele dynamiek van membraaneiwitten In situ Met Site-directed fluorescentie Etikettering (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 55 s
Description: Verken de conformationele dynamiek van membraaneiwitten in situ met site-directed fluorescentie-etikettering op enkele cellen. Deze methode koppelt iontransportkinetiek aan fluorescente conformatieveranderingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

<ol><li>Cole, K. S., Moore, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potassium+Ion+Current+in+the+Squid+Giant+Axon%3A+Dynamic+Characteristic%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Potassium Ion Current in the Squid Giant Axon: Dynamic Characteristic.</a> Biophys. J. 1, 1-14 (1960).</li>
<li>Taglialatela, M., Toro, L., Stefani, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+voltage+clamp+to+record+small%2C+fast+currents+from+ion+channels+expressed+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Novel voltage clamp to record small, fast currents from ion channels expressed in Xenopus oocytes.</a> Biophys. J. 61, 78-82 (1992).</li>
<li>Dempski, R. E., Friedrich, T., Bamberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+beta+subunit+of+the+Na%2B%2FK%2B-ATPase+follows+the+conformational+state+of+the+holoenzyme%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The beta subunit of the Na+/K+-ATPase follows the conformational state of the holoenzyme.</a> J. Gen. Physiol. 125, 505-520 (2005).</li>
<li>Miller, A. J., Zhou, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+oocytes+as+an+expression+system+for+plant+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22BBA+-+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Xenopus oocytes as an expression system for plant transporters.</a> BBA - Biomembranes. 1465, 343-358 (2000).</li>
<li>Cha, A., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+Voltage-Dependent+Conformational+Changes+in+the+Shaker+K%2B+Channel+with+Fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Characterizing Voltage-Dependent Conformational Changes in the Shaker K+ Channel with Fluorescence.</a> Neuron. 19, 1127-1140 (1997).</li>
<li>Mannuzzu, L. M., Moronne, M. M., Isacoff, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Physical+Measure+of+Conformational+Rearrangement+Underlying+Potassium+Channel+Gating%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Direct Physical Measure of Conformational Rearrangement Underlying Potassium Channel Gating.</a> Science. 271, 213-216 (1996).</li>
<li>Koch, H. P., Larsson, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-scale+molecular+motions+accomplish+glutamate+uptake+in+human+glutamate+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Small-scale molecular motions accomplish glutamate uptake in human glutamate transporters.</a> J. Neurosci. 25, 1730-1736 (2005).</li>
<li>Dempski, R. E., Hartung, K., Friedrich, T., Bamberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorometric+Measurements+of+Intermolecular+Distances+between+the+%CE%B1-+and+%CE%B2-Subunits+of+the+Na%2B%2FK%2B-ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Fluorometric Measurements of Intermolecular Distances between the α- and β-Subunits of the Na+/K+-ATPase.</a> J. Biol. Chem. 281, 36338-36338 (2006).</li>
<li>Geys, S. A., Bamberg, E., Dempski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligand-Dependent+Effects+on+the+Conformational+Equilibrium+of+the+Na%2B%2CK%2B-ATPase+As+Monitored+by+Voltage+Clamp+Fluorometry%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Ligand-Dependent Effects on the Conformational Equilibrium of the Na+,K+-ATPase As Monitored by Voltage Clamp Fluorometry.</a> Biophys. J. 96, 4561-4561 (2009).</li>
<li>Geibel, S., Kaplan, J. H., Bamberg, E., Friedrich, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+Dynamics+of+the+Na%2B%2FK%2B-ATPase+Probed+by+Voltage+Clamp+Fluorometry%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Conformational Dynamics of the Na+/K+-ATPase Probed by Voltage Clamp Fluorometry.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 964-969 (2003).</li>
<li>Lorenz, L., Pusch, M., Jentsch, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heteromultimeric+CLC+chloride+channels+with+novel+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Heteromultimeric CLC chloride channels with novel properties.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 13362-13366 (1996).</li>
<li>Mruk, K., Kobertz, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+a+Novel+Activator+of+KCNQ1-KCNE1+K%2B+Channel+Complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Discovery of a Novel Activator of KCNQ1-KCNE1 K+ Channel Complexes.</a> Biophys. J. 177a, (2009).</li>
<li>Kyte, J., Doolittle, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+diplaying+the+hydropathic+character+of+a+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A method for diplaying the hydropathic character of a protein.</a> J. Mol. Biol. 157, 105-132 (1982).</li>
<li>Rakowski, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charge+movement+by+the+Na%2FK+pump+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Charge movement by the Na/K pump in Xenopus oocytes.</a> J. Gen. Physiol. 101, 117-144 (1993).</li>
<li>Tsunoda, S. P., Hegemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glu+87+of+Channelrhodopsin-1+Causes+pH-dependent+Color+Tuning+and+Fast+Photocurrent+Inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Glu 87 of Channelrhodopsin-1 Causes pH-dependent Color Tuning and Fast Photocurrent Inactivation.</a> Photochem. Photobiol. 85, 564-569 (2009).</li>
<li>Cha, A., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+implications+of+fluorescence+quenching+in+the+Shaker+K%2B+channel%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Structural implications of fluorescence quenching in the Shaker K+ channel.</a> J. Gen. Physiol. 112, 391-391 (1998).</li>
<li>Förster, T. Ann Physik. 2, 55-75 (1948).</li>
<li>Dong, X., Stothard, P., Forsythe, I. J., Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PlasMapper%3A+a+web+server+for+drawing+and+auto-annotating+plasmid+maps%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">PlasMapper: a web server for drawing and auto-annotating plasmid maps.</a> Nucleic Acids Res. 32, W660-W664 (2004).</li>
</ol>

De experimentele aanpak die beschrijven we een combinatie van site-specific fluorofoor etikettering en de twee elektroden spanning klem om de relatie tussen structuur en functie van membraaneiwitten te onderzoeken. Deze techniek kan gebruikt worden om tijdsopgeloste informatie te verkrijgen over de conformationele dynamica van membraaneiwitten tijdens het ionen transport. Bovendien kan deze aanpak worden afgestemd op werken met verschillende eiwitten zoals ion pompen, ionenkanalen en transporteurs. In aanvulling op het onderzoek naar de conformationele dynamiek op een bepaald residu, is het ook mogelijk om de fluorescentie resonantie energie overdracht te gebruiken om op afstand beperkingen binnen een holoenzyme te bepalen. De bepaling van de afstanden tussen de residuen en het meten van de relatieve beweging tussen de subeenheden kan helpen bij het oplossen belangrijke vragen met betrekking tot gating mechanismen.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagens / Equipment </th><th> Vennootschap </th><th> Reagens / Equipment </th><th> Vennootschap </th></tr><tr><td> 100W Tungsten Light Source </td><td> Carl Zeiss microimaging </td><td> fluoresceïne-5-maleïmide </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> 1B150F-4 </td><td> Wereld precisie-instrumenten </td><td> High-Pure PCR Extraction Kit </td><td> Roche </td></tr><tr><td> 3,0-4,0 Ethicon Vicryl </td><td> Johnson &amp; Johnson </td><td> mMessage mMachine Kit </td><td> Ambion </td></tr><tr><td> 475AF40 excitatiefilter </td><td> Omega Optical </td><td> MS-222 </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr><tr><td> 505DRLP dichroic spiegel </td><td> Omega Optical </td><td> Nucleospin Plasmid Kit </td><td> Macherey-Nagel </td></tr><tr><td> Macherey-Nagel </td><td> Omega Optical </td><td> Nanodrop 2000C Sprectrophotometer </td><td> Thermo Scientific </td></tr><tr><td> 535DF50 excitatiefilter </td><td> Omega Optical </td><td> PC-10 Micropipet Puller </td><td> Narishige </td></tr><tr><td> 560DRLP dichroic spiegel </td><td> Omega Optical </td><td> pCLAMP 10 Software </td><td> Axon Instruments </td></tr><tr><td> 565ALP emissie-filter </td><td> Omega Optical </td><td> PfuTurbo DNA Polymerase </td><td> Strategene </td></tr><tr><td> 565EFLP emissie-filter </td><td> Omega Optical </td><td> PIN-022A Fotodiode </td><td> United Technologies Detector </td></tr><tr><td> 570DRLP dichroic spiegel </td><td> Omega Optical </td><td> Gepolariseerde filters </td><td> Linos Phtonics Inc </td></tr><tr><td> Linos Phtonics Inc </td><td> Omega Optical </td><td> QuickChange Site-Directed Mutagenisis Kit </td><td> Stratagene </td></tr><tr><td> Axio Examiner fluorescentie microscoop </td><td> Carl Zeiss microimaging GMBH </td><td> RC-10 fluorescentie Kamer </td><td> Warner Instruments </td></tr><tr><td> Warner Instruments </td><td> Life Technologies </td><td> tetramethylrhodamine-6-maleïmide </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> Digidata 1440A data-acquisitiesysteem </td><td> Axon Instruments </td><td> TOP10 elektrocompetente Cellen </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> DPN I </td><td> New England Biolabs </td><td> Turbo Tec-05X versterker </td><td> NPI </td></tr></tbody></table>

het onderzoeken van de conformationele dynamiek van membraaneiwitten in situ met site-directed fluorescentie etikettering

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

Twee electrode spanning klem elektrofysiologie (TEVC) is een krachtig hulpmiddel om het mechanisme van ion transport1 te onderzoeken voor een breed scala van membraaneiwitten waaronder ion kanalen 2, ionenpompen 3, 4 en transporteurs. Recente ontwikkelingen hebben gecombineerd site-specific fluorofoor etikettering naast TEVC gelijktijdig de conformationele dynamiek te onderzoeken op specifieke residuen en de functie van deze eiwitten op het oppervlak van de individuele cellen. We beschrijven een methode om de conformationele dynamica van membraaneiwitten studie door tegelijkertijd de controle fluorescentie en huidige veranderingen met behulp van voltage-clamp fluorometrie. Deze benadering kan worden gebruikt om de moleculaire beweging van membraaneiwitten site-specifiek volgende cysteïne vervanging en site-directed fluorofoor labeling 5,6 onderzoeken. Bovendien is deze methode biedt een aanpak om de afstand tussen specifieke beperkingen residuen 7,8 vast te stellen. Dit wordt bereikt door selectief te bevestigen donor en acceptor fluoroforen om twee gemuteerde cysteïne-residuen van belang. In het kort worden deze experimenten uitgevoerd na de functionele expressie van het gewenste eiwit op het oppervlak van Xenopus Leavis eicellen. Het grote oppervlak van deze eicellen kan gemakkelijke functionele metingen en een robuuste fluorescentie-signaal 5. Het is ook mogelijk om gemakkelijk veranderen de extracellulaire voorwaarden, zoals pH, ligand of kationen / anionen, waar nadere inlichtingen kunnen verschaffen over het mechanisme van membraaneiwitten 4. Tot slot hebben de recente ontwikkelingen het ook mogelijk de manipulatie van geselecteerde interne ionen volgende co-expressie met een tweede eiwit 9. Ons protocol wordt beschreven in meerdere delen. De eerste, cysteine ​​scanning mutagenese voorafgegaan door fluorofoor etikettering is voltooid op de residuen zich op het grensvlak van de transmembraan-en extracellulaire domeinen. Latere experimenten zijn bedoeld om residuen die grote veranderingen in fluorescentie-intensiteit (&lt;5%) 3 aan te tonen op een conformationele verandering van het eiwit te identificeren. Ten tweede zijn deze veranderingen in fluorescentie-intensiteit ten opzichte van de kinetische parameters van het membraan eiwit om de conformationele dynamiek correleren met de functie van het eiwit 10. Dit maakt een rigoureuze biofysische analyse van de moleculaire beweging van het doelwit eiwit. Ten slotte kan twee residuen van de holoenzyme worden gelabeld met een donor en acceptor fluorofoor om op afstand beperkingen met behulp van donor photodestruction methoden vast te stellen. Het is ook mogelijk om de relatieve beweging van eiwitsubeenheden te controleren na het labelen met een donor en acceptor fluorofoor.

We beschrijven een methode die de kinetiek van ionen transport van membraaneiwitten maatregelen naast locatie-specifieke analyse van conformationele veranderingen met behulp van fluorescentie op enkele cellen. Deze techniek is aanpasbaar aan ionkanalen, transporteurs en ion pompen en kan worden gebruikt om de afstand tussen de beperkingen eiwitsubeenheden te bepalen.

Het onderzoeken van de Conformationele dynamiek van membraaneiwitten In situ Met Site-directed fluorescentie Etikettering

Elektrofysiologie met twee-elektrode spanningsklem (TEVC) is een krachtig instrument om het mechanisme van ionentransport te onderzoeken voor een grote verscheidenheid aan membraan...

Het algemene doel van deze procedure is het onderzoeken van de conformationele dynamiek van membraaneiwittenen door gebruik te maken van site-directed fluorescentielabeling op het oppervlak van individuele cellen. Dit wordt bereikt door eerst afzonderlijk residuen op de interface van de extracellulaire en transmembraandomeinen te muteren naar cysteïne, zoals aangegeven door de rode C. Vervolgens is het noodzakelijk om vast te stellen of dit residu gelabeld kan worden met een met cysteïne reagerende fluorofoor. De tweede stap van de procedure is het onderzoeken of cysteïne-mutagenese en/of fluorofoor-labeling de kinetiek en/of de conformationele toestand van het eiwit beïnvloedt.Dit wordt uitgevoerd met behulp van de getoonde opstelling. De derde stap van de procedure is het vergelijken en contrasteren van veranderingen in fluorescentie-intensiteit met de kinetische parameters van het doeleiwit. Hier wordt een typisch fluorescentiespoor getoond.De laatste stap van de procedure is het labelen van gemuteerde cysteïne-paren met ofwel donor Fluor fours of donor-acceptor Fluor fours om fotodestructiesnelheden te meten in combinatie met voltage-clamp-metingen om afstandsbeperkingen te bepalen. Deze figuur toont donor-fotodestructiesnelheden in afwezigheid van de acceptor in het zwart; donor-fotodestructie in aanwezigheid van de acceptor is in het rood weergegeven. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die aantonen dat veranderingen in fluorescentie-intensiteit, die het resultaat zijn van conformationele veranderingen van eiwitten, kunnen worden gecorreleerd aan de functie van membraaneiwitten via voltage-clamp-fluorometrie.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van membraaniontransport, zoals de vraag hoe veranderingen in de conformationele toestand van het eiwit het transport van kleine moleculen en ionen over het plasmamembraan faciliteren. Begin de procedure door de natrium-kaliumpomp te kloneren in een vector die geschikt is voor xop posts, Lavis oocyte-expressie. De volgende stap is het aanbrengen van cysteïnemutaties op residuen die zich bevinden op de interface tussen de transmembraan- en extracellulaire domeinen, zoals beschreven in het bijbehorende artikel.Controleer na voltooiing de insertie van de mutatie via DNA-sequencing nadat het plasma-DNA naar mRNA is getranscribeerd zoals beschreven in het bijbehorende artikel, en kwantificeer de opbrengst van mRNA met een spectrofotometer vóór de operatie. De kikker moet 12 uur vasten om braken tijdens de ingreep te voorkomen. Om de volgende dag met de operatie te beginnen, dompel je de kikker onder in de anesthesie-oplossing totdat de kikker niet meer reageert op een kneep in de teen.Haal de kikker uit de anesthesie-oplossing en plaats deze met de rugzijde naar beneden op de absorberende zijde van een luierkussen. Plaats een natte papieren handdoek op de kikker om deze vochtig te houden. Houd daarnaast, indien de ogen van de kikker open zijn, deze vochtig met een zoutoplossing.Maak een kleine milde incisie aan één zijde van de middenlijn van de kikker. Lokaliseer het ovarium en breng dit naar de buitenkant van de kikker. Vermijd contact tussen het ovarium en de huid.Verwijder de eierstok en plaats deze in een Petrischaal met ringersoplossing. Controleer het resterende weefsel op bloedingen voordat u het terugplaatst in de lichaamsholte. Indien er sprake is van bloedingen, oefen dan druk uit met een steriel wattenstaafje totdat het bloeden stopt.Voltooi de operatie door de incisie te hechten met een onderbroken hechting. Plaats de kikker met behulp van een schaar terug in de behuizing om te herstellen van de anesthesie. Verdeel de geïsoleerde eierstoklob in kleinere delen.Breng de klompen over in ringersoplossing plus calcium met collagenase. Schud vervolgens de digestie-oplossing gedurende twee uur voorzichtig bij 18 °C. Wanneer de meeste oocyten gescheiden zijn, worden de oocyten gewassen met ringersoplossing minus calcium.Incubeer de oocyten vervolgens gedurende 10 minuten in ringeroplossing zonder calcium bij kamertemperatuur. Was de cellen op dit punt grondig in ringeroplossing met calcium. Breng de oocyten vervolgens over naar ringeroplossing met calcium voor bewaring voorafgaand aan de injectie.Haal voor de volgende stap het gesynthetiseerde mRNA uit de vriezer van -20 °C. Voeg 25 nanogram van het mRNA toe tot een eindvolume van 50 nanoliter. Injecteer vervolgens het mRNA in de cytes na de injectie.Plaats de oocyten in ringer-oplossing met 1 mg/mL gentamicin en incubeer ze gedurende drie tot zeven dagen in het donker bij 18 °C. Dit stelt de natrium-kaliumpomp in staat om tot expressie te komen in het plasmamembraan van de oocyten. Verwijder de oocyten op de dag van het experiment uit de incubator en plaats ze gedurende 45 minuten in loading buffer en vervolgens gedurende 45 minuten in post-loading buffer.Dit verhoogt de intracellulaire natriumconcentratie om de meting van de natrium-kaliumpomp te vergemakkelijken. Voor fluorescentiemetingen worden de oocyten vijf tot 10 minuten in het donker geïncubeerd in een post-loadingbuffer die vijf micromolair van de gewenste fluorofoor bevat, zoals TMRM of FM. Na fluorofoorlabeling worden de oocyten grondig gewassen met een kleurstofvrije post-buffer.Bewaar de oocyten in het donker om fotobleking te voorkomen. Om de voltageclamp-metingen met twee elektroden voor te bereiden, begint u met het vullen van de micro-elektroden met 3 M kaliumchloride en het testen van de weerstand. De weerstand moet tussen 0,5 en 1,5 megaohm liggen.Voor cysteïne-scanningexperimenten wordt de fluorescentiemicroscoop uitgerust met een 5 35 DF 50 excitatiefilter, een 5 65 EFLP emissiefilter en een vijf 70 DRLP diic-spiegel. Plaats vervolgens de oocyte in een RC 10 kamer op de tafel van de fluorescentiemicroscoop. Voer daarna beide micro-elektroden voorzichtig in de oocyte in, waarbij de versterker wordt gebruikt om het membraanpotentiaal op een constante waarde te houden.Meet de ionenstroom over het membraan door het eiwit te activeren met een geschikte techniek, zoals oplossingsuitwisseling of het wijzigen van het membraanpotentiaal. Gebruik voor gelijktijdige fluorescentiemetingen een wolfraamlichtbron van 100 watt om de donorfluorofoor te exciteren en om 0 2 2, A photo DDE te gebruiken voor het detecteren van veranderingen in fluorescentie-intensiteit bij fluorescentielabeling. Na cysteine-scanning.Meet de verandering in fluorescentie-intensiteit bij een stationaire stroom met behulp van spanningsstappen die worden aangestuurd door P clamp 10-software. Een tweede deel van het protocol omvat het uitvoeren van anisotropiemetingen naast afstandsmetingen. Om het bereik van kappa-kwadraatwaarden te berekenen, meet anisotropie de relatieve mobiliteit van de fluorofoor als gevolg van rotatie.Raadpleeg het bijbehorende artikel voor de details van de berekeningen. Om afstandsbeperkingen te meten, wordt een holo-enzym gebruikt, dat twee toegankelijke extracellulaire cysteïneresiduen heeft die gelabeld kunnen worden met fluorforen. Voeg post-loadingbuffer toe die 1 µM FM en 4 µM TMRM bevat.Dit is de donor en de acceptor. Voeg aan één batch oocyten alleen 1 µM FM toe. Dit is uitsluitend de donorfluorofoor.Voeg vier oocyten toe aan een andere batch en incubeer beide batches oocyten gedurende 30 minuten op ijs in het donker. Dit maakt het mogelijk om metingen te verrichten van hollo-enzymen die wel en niet zijn gelabeld met acceptor fluoro four. Rust vervolgens de microscoop uit met een 4 75 DF 40 excitatiefilter, een vijf 30 DF 30 emissiefilter en een 5 0 5 DRLP dichroïsche spiegel.Plaats de oöcyt vervolgens in de kamer op de tafel van de fluorescentiemicroscoop. Meet, terwijl een continue vloeistofstroom wordt gehandhaafd, de tijdsafhankelijkheid van het bleken van de donor in aanwezigheid en afwezigheid van de acceptorflora. Vier. Deze resultaten kunnen worden gebruikt om de afstand tussen de twee residuen op de natrium-kaliumpomp te berekenen met behulp van Förster.Metingen met een twee-elektrode spanningsklem moeten gelijktijdig worden uitgevoerd om te garanderen dat het eiwit functioneel is. Gebruik de clamp X-functie in P clamp 10 om de resultaten van de fotodestructie van de donorfluorofoor te middelen voor minimaal vier opnames op dezelfde locatie. Om de relatieve beweging van eiwitsubunits te meten, moeten dubbele cysteïne-constructen worden gebruikt die zowel acceptor- als donorfluoroforen bevatten.De fluorescentie-intensiteit bij deze residuen is ongevoelig voor de conformationele toestand van het eiwit en zal een functie zijn van de afstand tussen de twee fluoroforen. Verander vervolgens de filterset in de microscoop naar een 475 a F 40 excitatiefilter, een 595 a F 60 emissiefilter en een 505 DRLP dichroïsche spiegel. Plaats daarna de OI in de kamer op de tafel van de fluorescentiemicroscoop.Vervolgens wordt de donor geëxciteerd met een wolfraamlichtbron van 100 watt en wordt de fluorescentie-intensiteit van de acceptor Fluoro four gemeten met behulp van een geschikte methode, zoals voltage ligand of oplossingsuitwisseling, waarbij het membraaneiwit wordt geactiveerd en gelijktijdig de verandering in fluorescentie-intensiteit wordt gemeten. Deze figuur toont de correlatie tussen ionentransport over het celmembraan en veranderingen in de fluorescentie-intensiteit.De bovenste curve toont current clamp-metingen in aanwezigheid van een natriumtestoplossing en een kaliumtestoplossing bij een concentratie van 10 micromolair en 10 millimolair ing. De onderste curve toont veranderingen in fluorescentie-intensiteit, gemeten gelijktijdig met de current clamp-metingen. Deze figuur toont twee oocyten gelabeld met TMRM, de acceptorfluor four.De oöcyt links tot expressie brengt wild-type natrium-kalium-ATPase, terwijl de oöcyt rechts natrium-kalium-ATPase tot expressie brengt met één toegankelijk cysteïneresidu. De bovenste sporen van deze figuur tonen gegevens van transiënte stroom bij een spanningspuls. De onderste sporen tonen real-time registraties van veranderingen in fluorescentie-intensiteit bij een spanningspuls.Deze figuur toont de tijdsafhankelijkheid van fotobleken; de fotodestructie van de donor wordt gemeten in afwezigheid en aanwezigheid van de acceptor fluoro four. Fotobleken vindt sneller plaats zonder een acceptor fluoro four. Elke curve is het gemiddelde van vier opnames op de oh-plaats. Deze figuur toont de relatieve beweging van subeenheden bij conformationele veranderingen.Fluorescentiewijzigingen worden weergegeven in de rode lijnen en de stroomvloei wordt weergegeven in de zwarte lijnen. Een toename in fluorescentie-intensiteit, links weergegeven, geeft aan dat de fluorfoors dichter bij elkaar komen te staan. Geen wijziging in fluorescentie-intensiteit, in het midden weergegeven, geeft aan dat de Fluor four-afstand statisch blijft.Een afname in fluorescentie-intensiteit, zoals rechts getoond, geeft aan dat de fluoroforen verder uit elkaar bewegen. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om veranderingen in de kinetische en steady-state fluorescentie-intensiteit te correleren aan de conformationele veranderingen in het eiwit.

examining-conformational-dynamics-membrane-proteins-situ-with-site

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Deze video artikel beschrijft de experimentele procedure voor het verkrijgen van de Gibbs vrije energie van membraaneiwit vouwen door tryptofaan fluorescentie.

Thermodynamica van membraaneiwit Folding Gemeten door fluorescentiespectroscopie

We beschrijven beeldvormingsbenaderingen we gebruiken om de verdeling en mobiliteit van de getransfecteerde fluorescerende eiwitten in het endoplasmatisch reticulum (ER) inwoner via de confocale beeldvorming van levende cellen te onderzoeken. We hebben ook ultrastructureel analyseren het effect van hun expressie op de architectuur van deze subcellulaire compartiment.

Visualisatie van endoplasmatisch reticulum subdomeinen bij gekweekte cellen

Ruimtelijke verdeling en temporele dynamica van plasmamembraaneiwitten en lipiden is een populair onderwerp in de biologie. Hier wordt dit probleem aangepakt door een ruimte-tijdelijke beeldfluctuatieanalyse die conceptueel dezelfde fysische grootheden levert als enkeldeeltjevolgen, maar gebruik maakt van kleine moleculaire labels en standaard microscoopopstellingen.

Van Fast Fluorescentie Imaging om moleculaire diffusie wet op de Live-celmembranen in een Commercial Microscoop

Hier presenteren we een protocol om de oriëntatie en topologie van integrale membraaneiwitten in levende cellen te bepalen. Dit eenvoudige protocol is gebaseerd op de selectieve proteasegevoeligheid van chimaeren tussen het eiwit van belang en GFP.

Het bepalen van membraaneiwit Topologie behulp Fluorescentie protease Protection (FPP)

Veel eiwitten voeren hun functie uit wanneer ze aan membraanoppervlakken zijn gehecht. De binding van extrinsieke eiwitten op nanodisc-membranen kan indirect worden afgebeeld door transmissie-elektronenmicroscopie. We laten zien dat de karakteristieke stapelvorming (rouleau) van nanodiscs, veroorzaakt door de negatieve kleuring natriumfosfowolframaat, wordt voorkomen door de binding van extrinsiek eiwit.

Methode om te visualiseren en te analyseren Membrane interagerende eiwitten door Transmission Electron Microscopy

Dit protocol presenteert een methode voor het meten van adenine nucleotide binding aan receptoren in real time in een cellulaire omgeving. Binding wordt gemeten als Förster resonantie energieoverdracht (FRET) tussen trinitrofenylnucleotidederivaten en eiwit gelabeld met een niet-canoniek, fluorescerend aminozuur.

Het meten van nucleotidebinding aan intacte, functionele membraaneiwitten in realtime

Deze studie presenteert een gedetailleerde procedure voor het uitvoeren van single-molecule fluorescentie resonantie energie transfer (smFRET) experimenten op G-eiwit-gekoppelde receptoren (GPCR's) met behulp van site-specifieke etikettering via onnatuurlijke aminozuur (OCG) incorporatie. Het protocol biedt een stapsgewijze handleiding voor smFRET-monstervoorbereiding, experimenten en gegevensanalyse.

Het visualiseren van de conformatiedynamiek van membraanreceptoren met behulp van single-molecule FRET

Dit protocol beschrijft hoe TIRF-microscopie kan worden gebruikt om individuele ionkanalen te volgen en hun activiteit in ondersteunde lipidemembranen te bepalen, waardoor het samenspel tussen laterale membraanbeweging en kanaalfunctie wordt gedefinieerd. Het beschrijft hoe de membranen moeten worden voorbereid, de gegevens moeten worden vastgelegd en de resultaten moeten worden geanalyseerd.

Single-Molecule Imaging van Laterale Mobiliteit en Ion Channel Activity in Lipid Bilayers met behulp van Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopie

Hier presenteren we het protocol om de lokale flexibiliteit en dynamiek van biomoleculen te bestuderen met behulp van tijdopgeloste fluorescentie-anisotropie op het niveau van één molecuul in confocale microscopiemodus.

Tijdopgeloste fluorescentie-anisotropie van afzonderlijke moleculen voor het karakteriseren van lokale flexibiliteit in biomoleculen

Dit artikel geeft een gedetailleerde beschrijving van hoe monsters te maken voor single-eiwittracking in solid-supported lipid bilayers. Het verklaart ook een eenvoudige fluorescentiemicroscoop met enkelvoudige moleculegevoeligheid en een hoge framerate. Tot slot beschrijven we de procedure voor het extraheren van single-protein trajecten.

Tracking van enkele eiwitten in lipide-dubbellagen met behulp van fluorescentiemicroscopie

Verken de conformationele dynamiek van membraaneiwitten in situ met site-directed fluorescentie-etikettering op enkele cellen. Deze methode koppelt iontransportkinetiek aan fluorescente conformatieveranderingen.

Het onderzoeken van de Conformationele dynamiek van membraaneiwitten In situ Met Site-directed fluorescentie Etikettering

Meer video's verkennen