Het onderzoeken van de Conformationele dynamiek van membraaneiwitten In situ Met Site-directed fluorescentie Etikettering

Het algemene doel van deze procedure is het onderzoeken van de conformationele dynamiek van membraaneiwittenen door gebruik te maken van site-directed fluorescentielabeling op het oppervlak van individuele cellen. Dit wordt bereikt door eerst afzonderlijk residuen op de interface van de extracellulaire en transmembraandomeinen te muteren naar cysteïne, zoals aangegeven door de rode C. Vervolgens is het noodzakelijk om vast te stellen of dit residu gelabeld kan worden met een met cysteïne reagerende fluorofoor. De tweede stap van de procedure is het onderzoeken of cysteïne-mutagenese en/of fluorofoor-labeling de kinetiek en/of de conformationele toestand van het eiwit beïnvloedt.

Dit wordt uitgevoerd met behulp van de getoonde opstelling. De derde stap van de procedure is het vergelijken en contrasteren van veranderingen in fluorescentie-intensiteit met de kinetische parameters van het doeleiwit. Hier wordt een typisch fluorescentiespoor getoond.

De laatste stap van de procedure is het labelen van gemuteerde cysteïne-paren met ofwel donor Fluor fours of donor-acceptor Fluor fours om fotodestructiesnelheden te meten in combinatie met voltage-clamp-metingen om afstandsbeperkingen te bepalen. Deze figuur toont donor-fotodestructiesnelheden in afwezigheid van de acceptor in het zwart; donor-fotodestructie in aanwezigheid van de acceptor is in het rood weergegeven. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die aantonen dat veranderingen in fluorescentie-intensiteit, die het resultaat zijn van conformationele veranderingen van eiwitten, kunnen worden gecorreleerd aan de functie van membraaneiwitten via voltage-clamp-fluorometrie.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van membraaniontransport, zoals de vraag hoe veranderingen in de conformationele toestand van het eiwit het transport van kleine moleculen en ionen over het plasmamembraan faciliteren. Begin de procedure door de natrium-kaliumpomp te kloneren in een vector die geschikt is voor xop posts, Lavis oocyte-expressie. De volgende stap is het aanbrengen van cysteïnemutaties op residuen die zich bevinden op de interface tussen de transmembraan- en extracellulaire domeinen, zoals beschreven in het bijbehorende artikel.

Controleer na voltooiing de insertie van de mutatie via DNA-sequencing nadat het plasma-DNA naar mRNA is getranscribeerd zoals beschreven in het bijbehorende artikel, en kwantificeer de opbrengst van mRNA met een spectrofotometer vóór de operatie. De kikker moet 12 uur vasten om braken tijdens de ingreep te voorkomen. Om de volgende dag met de operatie te beginnen, dompel je de kikker onder in de anesthesie-oplossing totdat de kikker niet meer reageert op een kneep in de teen.

Haal de kikker uit de anesthesie-oplossing en plaats deze met de rugzijde naar beneden op de absorberende zijde van een luierkussen. Plaats een natte papieren handdoek op de kikker om deze vochtig te houden. Houd daarnaast, indien de ogen van de kikker open zijn, deze vochtig met een zoutoplossing.

Maak een kleine milde incisie aan één zijde van de middenlijn van de kikker. Lokaliseer het ovarium en breng dit naar de buitenkant van de kikker. Vermijd contact tussen het ovarium en de huid.

Verwijder de eierstok en plaats deze in een Petrischaal met ringersoplossing. Controleer het resterende weefsel op bloedingen voordat u het terugplaatst in de lichaamsholte. Indien er sprake is van bloedingen, oefen dan druk uit met een steriel wattenstaafje totdat het bloeden stopt.

Voltooi de operatie door de incisie te hechten met een onderbroken hechting. Plaats de kikker met behulp van een schaar terug in de behuizing om te herstellen van de anesthesie. Verdeel de geïsoleerde eierstoklob in kleinere delen.

Breng de klompen over in ringersoplossing plus calcium met collagenase. Schud vervolgens de digestie-oplossing gedurende twee uur voorzichtig bij 18 °C. Wanneer de meeste oocyten gescheiden zijn, worden de oocyten gewassen met ringersoplossing minus calcium.

Incubeer de oocyten vervolgens gedurende 10 minuten in ringeroplossing zonder calcium bij kamertemperatuur. Was de cellen op dit punt grondig in ringeroplossing met calcium. Breng de oocyten vervolgens over naar ringeroplossing met calcium voor bewaring voorafgaand aan de injectie.

Haal voor de volgende stap het gesynthetiseerde mRNA uit de vriezer van -20 °C. Voeg 25 nanogram van het mRNA toe tot een eindvolume van 50 nanoliter. Injecteer vervolgens het mRNA in de cytes na de injectie.

Plaats de oocyten in ringer-oplossing met 1 mg/mL gentamicin en incubeer ze gedurende drie tot zeven dagen in het donker bij 18 °C. Dit stelt de natrium-kaliumpomp in staat om tot expressie te komen in het plasmamembraan van de oocyten. Verwijder de oocyten op de dag van het experiment uit de incubator en plaats ze gedurende 45 minuten in loading buffer en vervolgens gedurende 45 minuten in post-loading buffer.

Dit verhoogt de intracellulaire natriumconcentratie om de meting van de natrium-kaliumpomp te vergemakkelijken. Voor fluorescentiemetingen worden de oocyten vijf tot 10 minuten in het donker geïncubeerd in een post-loadingbuffer die vijf micromolair van de gewenste fluorofoor bevat, zoals TMRM of FM. Na fluorofoorlabeling worden de oocyten grondig gewassen met een kleurstofvrije post-buffer.

Bewaar de oocyten in het donker om fotobleking te voorkomen. Om de voltageclamp-metingen met twee elektroden voor te bereiden, begint u met het vullen van de micro-elektroden met 3 M kaliumchloride en het testen van de weerstand. De weerstand moet tussen 0,5 en 1,5 megaohm liggen.

Voor cysteïne-scanningexperimenten wordt de fluorescentiemicroscoop uitgerust met een 5 35 DF 50 excitatiefilter, een 5 65 EFLP emissiefilter en een vijf 70 DRLP diic-spiegel. Plaats vervolgens de oocyte in een RC 10 kamer op de tafel van de fluorescentiemicroscoop. Voer daarna beide micro-elektroden voorzichtig in de oocyte in, waarbij de versterker wordt gebruikt om het membraanpotentiaal op een constante waarde te houden.

Meet de ionenstroom over het membraan door het eiwit te activeren met een geschikte techniek, zoals oplossingsuitwisseling of het wijzigen van het membraanpotentiaal. Gebruik voor gelijktijdige fluorescentiemetingen een wolfraamlichtbron van 100 watt om de donorfluorofoor te exciteren en om 0 2 2, A photo DDE te gebruiken voor het detecteren van veranderingen in fluorescentie-intensiteit bij fluorescentielabeling. Na cysteine-scanning.

Meet de verandering in fluorescentie-intensiteit bij een stationaire stroom met behulp van spanningsstappen die worden aangestuurd door P clamp 10-software. Een tweede deel van het protocol omvat het uitvoeren van anisotropiemetingen naast afstandsmetingen. Om het bereik van kappa-kwadraatwaarden te berekenen, meet anisotropie de relatieve mobiliteit van de fluorofoor als gevolg van rotatie.

Raadpleeg het bijbehorende artikel voor de details van de berekeningen. Om afstandsbeperkingen te meten, wordt een holo-enzym gebruikt, dat twee toegankelijke extracellulaire cysteïneresiduen heeft die gelabeld kunnen worden met fluorforen. Voeg post-loadingbuffer toe die 1 µM FM en 4 µM TMRM bevat.

Dit is de donor en de acceptor. Voeg aan één batch oocyten alleen 1 µM FM toe. Dit is uitsluitend de donorfluorofoor.

Voeg vier oocyten toe aan een andere batch en incubeer beide batches oocyten gedurende 30 minuten op ijs in het donker. Dit maakt het mogelijk om metingen te verrichten van hollo-enzymen die wel en niet zijn gelabeld met acceptor fluoro four. Rust vervolgens de microscoop uit met een 4 75 DF 40 excitatiefilter, een vijf 30 DF 30 emissiefilter en een 5 0 5 DRLP dichroïsche spiegel.

Plaats de oöcyt vervolgens in de kamer op de tafel van de fluorescentiemicroscoop. Meet, terwijl een continue vloeistofstroom wordt gehandhaafd, de tijdsafhankelijkheid van het bleken van de donor in aanwezigheid en afwezigheid van de acceptorflora. Vier. Deze resultaten kunnen worden gebruikt om de afstand tussen de twee residuen op de natrium-kaliumpomp te berekenen met behulp van Förster.

Metingen met een twee-elektrode spanningsklem moeten gelijktijdig worden uitgevoerd om te garanderen dat het eiwit functioneel is. Gebruik de clamp X-functie in P clamp 10 om de resultaten van de fotodestructie van de donorfluorofoor te middelen voor minimaal vier opnames op dezelfde locatie. Om de relatieve beweging van eiwitsubunits te meten, moeten dubbele cysteïne-constructen worden gebruikt die zowel acceptor- als donorfluoroforen bevatten.

De fluorescentie-intensiteit bij deze residuen is ongevoelig voor de conformationele toestand van het eiwit en zal een functie zijn van de afstand tussen de twee fluoroforen. Verander vervolgens de filterset in de microscoop naar een 475 a F 40 excitatiefilter, een 595 a F 60 emissiefilter en een 505 DRLP dichroïsche spiegel. Plaats daarna de OI in de kamer op de tafel van de fluorescentiemicroscoop.

Vervolgens wordt de donor geëxciteerd met een wolfraamlichtbron van 100 watt en wordt de fluorescentie-intensiteit van de acceptor Fluoro four gemeten met behulp van een geschikte methode, zoals voltage ligand of oplossingsuitwisseling, waarbij het membraaneiwit wordt geactiveerd en gelijktijdig de verandering in fluorescentie-intensiteit wordt gemeten. Deze figuur toont de correlatie tussen ionentransport over het celmembraan en veranderingen in de fluorescentie-intensiteit.

De bovenste curve toont current clamp-metingen in aanwezigheid van een natriumtestoplossing en een kaliumtestoplossing bij een concentratie van 10 micromolair en 10 millimolair ing. De onderste curve toont veranderingen in fluorescentie-intensiteit, gemeten gelijktijdig met de current clamp-metingen. Deze figuur toont twee oocyten gelabeld met TMRM, de acceptorfluor four.

De oöcyt links tot expressie brengt wild-type natrium-kalium-ATPase, terwijl de oöcyt rechts natrium-kalium-ATPase tot expressie brengt met één toegankelijk cysteïneresidu. De bovenste sporen van deze figuur tonen gegevens van transiënte stroom bij een spanningspuls. De onderste sporen tonen real-time registraties van veranderingen in fluorescentie-intensiteit bij een spanningspuls.

Deze figuur toont de tijdsafhankelijkheid van fotobleken; de fotodestructie van de donor wordt gemeten in afwezigheid en aanwezigheid van de acceptor fluoro four. Fotobleken vindt sneller plaats zonder een acceptor fluoro four. Elke curve is het gemiddelde van vier opnames op de oh-plaats. Deze figuur toont de relatieve beweging van subeenheden bij conformationele veranderingen.

Fluorescentiewijzigingen worden weergegeven in de rode lijnen en de stroomvloei wordt weergegeven in de zwarte lijnen. Een toename in fluorescentie-intensiteit, links weergegeven, geeft aan dat de fluorfoors dichter bij elkaar komen te staan. Geen wijziging in fluorescentie-intensiteit, in het midden weergegeven, geeft aan dat de Fluor four-afstand statisch blijft.

Een afname in fluorescentie-intensiteit, zoals rechts getoond, geeft aan dat de fluoroforen verder uit elkaar bewegen. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om veranderingen in de kinetische en steady-state fluorescentie-intensiteit te correleren aan de conformationele veranderingen in het eiwit.