Name: Fabricage van micropatterned Hydrogelen voor Neurale Cultuur Systems met behulp van Dynamic Mask Projectie Fotolithografie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-11T23:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 6 s
Description: Leer hoe je micropatterned hydrogelen fabriceert voor neurale cultuursystemen met behulp van dynamic mask projection fotolithografie. Deze methode maakt snelle patronering van hydrogels mogelijk voor het bestuderen van neuronale groei en gedrag.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen graag naar het laboratorium van prof. Anthony Windebank bedanken voor het delen van hun expertise op het gebied DRG dissectie en cultuur, evenals prof. Shaochen Chen voor nuttige discussies over de DMD setup. Dit onderzoek werd deels gefinancierd door Tulane University en subsidies van de Louisiana College van Regenten (LEQSF [2009-10]-RD-A-18) en het NIH (NS065374).

1. DMD Setup <ol><li> De DMD raad van bestuur, UV-licht gids (met collimator) en 4x objectief zijn allemaal verticaal gemonteerd op een trillingsisolerende tafel. </li><li> Het UV-licht gids moet zodanig worden ingesteld dat het licht de spiegel reeks hits op een hoek van 45 ° ten opzichte van het vlak van de spiegels, en 24 ° onder het vlak van de spiegels (figuur 1). </li><li> Het objectief is gemonteerd, zodat de afstand van de DMD aan de doelstelling lens komt overeen met de brandpuntsafstand in verband met de lens. </li><li> Een omgekeerde microscoop bevindt zich onder het objectief, zodanig dat het gericht licht wordt weerkaatst door de DMD kan worden gevisualiseerd door de microscoop. De afstand van de doelstelling lens om de polymerisatie oppervlakte moet ongeveer overeenkomen met de werkafstand van de lens. Het podium op de microscoop kan dan gebruikt worden om deze afstand aan te passen aan fijn scherp op het beeld. Deze afstand kan variëren afhankelijk van de gekozen polymerisatie oppervlak. </li></ol> 2. Dual Hydrogel Constructen voor Tissue explantatie Culturen A. DRG explantatie hechting <ol><li> Smeer de wanden van de 6-well collageen gecoate celkweek inserts (Corning) met Rain-X, en zorg ervoor dat het membraan zelf te voorkomen. (Als alternatief kan een hydrofobe barrière pen worden gebruikt.) </li><li> Hydrate inserts 's nachts met 1,5 ml van de hechting medium in een incubator bij 37 ° C en 5% CO 2. Adhesie medium is neurobasal medium met 10% foetaal runderserum, 1% penicilline / streptomycine, 0,5 mm L-glutamine, en 20 ug / ml NGF. </li><li> Oogst embryonale achterwortelganglia (DRG) van de E-15 ratten pups. DRG moet worden uitgeplaat op collageen gecoate 6-well inserts, maar liefst vier per voegen. </li><li> Incubeer inserts voor 2 uur, zodat voor de DRG de naleving van het membraan. </li></ol> B. Dynamische masker fotopolymerisatie Een digitaal Micromirror apparaat (DMD) is een 1024 x 768 reeks van individuele spiegels, vergelijkbaar met die in de projectie televisies, die selectief licht reflecteert op basis van spiegel positie. Voor ons doel is de DMD gebruikt voor het patroon ultraviolet (UV) licht op fotoverknoopbare hydrogels, het creëren van bepaalbare hydrogel geometrieën in een eenvoudige en snelle manier. Figuur 1 toont de inrichting van het DMD-en UV-licht pad. Hoewel onze DMD is een zelfstandige eenheid, kan het apparaat ook worden geïntegreerd voor gebruik met veel bestaande microscopen. <ol><li> Verwijder alle overtollige vloeistof uit te voegen, en voeg 500 ul van polymerisatie medium binnen het in te voegen. Polymerisatie medium bevat 10% PEG (MW 1000) en 0,5% Irgacure 2959 opgelost in neurobasal medium aangevuld met 20 ug / ml NGF en 1% Pen / Strep. </li><li> Leg het element onder het DMD apparaat op een Rain-X behandeld glasplaatje. </li><li> Laad het juiste zwart-wit beeld om te worden gebruikt als een "fotomasker" op de DMD, door het gebruik van de meegeleverde ALP-3 basic GUI-programma. Voor onze doeleinden, is een bifurcating vorm gekozen om voor de uitvoering van neurieten geleidingssystemen. </li><li> Met behulp van een omgekeerde microscoop voor visualisatie, lijnt het weefsel explantaten met de juiste locatie op de fotomasker met behulp van een zichtbare lichtbron weerkaatst de DMD. </li><li> Schakel het zichtbare licht bron voor de UV-lichtbron, en verlichten van de PEG-oplossing totdat verknoping is voldoende. (Voor de voorwaarden gegeven en 5,0 Watt / cm 2 incident op de DMD, verknoping kan worden voltooid in slechts 55 seconden.) Herhaal dit voor alle vier de DRG op de insert. </li><li> Was elke insert drie keer met steriele DPBS en 1% Pen-Strep. </li><li> Voeg 1,5 ml groeimedium onder de celkweek inserts, en laat in een incubator equilibreren gedurende 30 minuten. Groeimedium is neurobasal medium dat 2% B-27, 1% Pen / Strep, 0,5 mm L-glutamine, en 20 ug / ml NGF. </li></ol> C. Secundaire hydrogel Puramatrix <ol><li> Voor de neuronale toepassingen, is 1% Puramatrix verdund volgens de instructies van de fabrikant tot 0,15% in een steriele H 2 O en aangevuld met 1 ug / ml oplosbaar laminine. </li><li> Alle overtollige media moeten worden verwijderd uit de PEG vides, die de DRG explantaten bevatten, met behulp van een steriel wattenstaafje applicator, Kimwipe of micropipet. </li><li> Puramatrix wordt toegevoegd aan de PEG vides met een micropipet om de lege ruimte op te vullen, kan uitzetten. Afhankelijk van het dode volume, meestal ~ 1 ui wordt gebruikt per bouwen. </li><li> Puramatrix begint onmiddellijk het proces van zelf-assemblage na contact met een fysiologische zoutoplossing, dat wil zeggen de gezwollen PEG, maar 1,5 ml groeimedium toegevoegd onder de insert en geplaatst in de incubator gedurende een uur aan de totale gelering te verzekeren. </li><li> In eerste instantie Puramatrix is ​​licht zuur, zodat veranderingen in de media na een uur om de pH van het evenwicht. </li><li> Media veranderingen nodig ongeveer elke 48 uur. Wees voorzichtig dat alle media istoegevoegd onder de insert, om de integriteit van mechanisch zwakke Puramatrix te beschermen. </li></ol> Agarose <ol><li> Voor de neuronale toepassingen wordt agarose verdund tot een 1% oplossing in groeimedium en geplaatst in een 60 ° C waterbad tot de agarose volledig oplost (~ 1 uur). De oplossing wordt dan aangevuld met 1 ug / ml oplosbaar laminine. </li><li> Alle overtollige media moeten worden verwijderd uit de PEG vides. </li><li> Agarose wordt toegevoegd aan de PEG holtes in om de lege ruimte op te vullen, kan uitzetten. Afhankelijk van het volume van de leegte, meestal ~ 1 ui wordt gebruikt per bouwen. </li><li> 1,5 ml groeimedium is vooraf gekoeld (8 ° C) in een 6-wells plaat, en de agarose met inserts worden overgebracht naar de gekoelde media en onderhouden in een koelkast bij 8 ° C gedurende ten minste drie minuten agarose laten gel. </li><li> Ten slotte worden de inserts overgebracht naar 1,5 ml voorverwarmde groeimedium (37 ° C) en gehandhaafd in de incubator bij 37 ° C, met de media veranderingen nodig zijn om de 48 uur. </li></ol> 3. Dual Hydrogel 3D Cell Encapsulation Dual hydrogel inkapseling is geschikt wanneer het gebruik van een zelf-assemblage gel. De fotoverknoopbare gel, in dit geval PEG, fungeert als een structurele ondersteuning voor de geometrische presentatie van de zelf-assemblage gel, bijvoorbeeld Puramatrix of agarose. Sommige van de methoden, met name de aard van de gel en de keuze van fotomasker, zal afhangen van de specifieke gewenste toepassing. <ol><li> Laad een geschikt masker op de DMD. Voor onze toepassing, overleving van de cel, we simpelweg gekozen voor een cilindrische presentatie van Puramatrix om te helpen bij de beeldvorming van cellen. Onderzoekers bestuderen van cell signaling geïnteresseerd zou zijn in een compartimentele geometrie te zorgen voor de verspreiding van chemotactische moleculen. Daarnaast werd een ruwe benadering van een slagader aangetoond dat het mogelijke toepassing te vertegenwoordigen bloedvat onderzoek. </li><li> Behandel de wanden van een polyester celkweek insert met Rain-X, en plaats onder DMD op Rain-X gecoate glijbaan. </li><li> Voeg 500 ul van polymerisatie medium om het in te voegen. Induceren PEG verknoping door blootstelling aan UV-licht voor 55 seconden. </li><li> Was driemaal uit met steriel DPBS en 1% Pen-Strep. </li><li> Verwijder al het overtollige papier uit de PEG vides. </li><li> Spin down-cellen op de gewenste dichtheid in een pellet. Zorg moet worden genomen om alle medium te verwijderen uit de celpellet voorafgaand aan de mixen, zoals Puramatrix begint self-assembly onmiddellijk na contact met een zoutoplossing. Hang de cellen binnen 0,15% Puramatrix verdund in een steriele H 2 O aangevuld met 10% sucrose. </li><li> Injecteer de Puramatrix / cel / sucrose mengsel in holtes in de PEG. </li><li> Voeg 1,5 mL van de groei medium onder de insert, en laat de gel in incubator gedurende een uur. </li><li> Verandering media na een uur, en ~ om de 48 uur daarna. </li></ol> 4. Single Hydrogel 3D Cell Encapsulation Een hydrogel inkapseling geschikt zou zijn voor iedere situatie waarin de cellen binnen kan worden onderzocht van een fotoverknoopbare hydrogel. <ol><li> Laad een geschikt masker op de DMD. Voor de overleving van de cel studies hebben we opnieuw gekozen voor een basic cirkelvormig masker om een ​​cilinder te vertegenwoordigen. Maskers vergelijkbaar met die getoond in de methode 4 weer kon worden toegepast voor het juiste gebied van onderzoek. </li><li> Behandel een polyester celkweek insert met Rain-X, en plaats onder DMD op Rain-X gecoate glijbaan. </li><li> Cellen op elke gewenste concentratie kan direct worden toegevoegd aan de 10% PEG-oplossing, mengen goed om een ​​homogene verdeling te garanderen. </li><li> Voeg 500 ul van polymerisatie medium om het in te voegen. Induceren PEG verknoping door blootstelling aan UV-licht voor 55 seconden. </li><li> Was driemaal uit met steriel DPBS en 1% Pen-Strep. </li><li> Vul met groeimedium zowel onder als op de top van de insert, veranderende elke ~ 2 dagen. </li></ol> 5. Thin Film Hydrogel Polymerisatie <ol><li> Laad een geschikt masker op de DMD. </li><li> Behandel een collageen gecoat polyester celkweek insert met Rain-X, en plaats op Rain-X gecoate glijbaan. </li><li> Voeg voldoende polymerisatie medium tot net onder de bodem van de insert (~ 250-300 ul voor 6-wells plaat inserts). Laat de media om de insert membraan doordringen gedurende 30-45 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Verwijder overtollige polymerisatie medium van de insert met een micropipet of Kimwipe. Voeg een voldoende hoeveelheid UV-transparante olie volledig te bedekken de bodem van de insert. Laat de insert om voor 15-30 minuten zitten bij kamertemperatuur, lang genoeg voor de olie tot een aparte laag boven de polymerisatie medium het verzadigen van de insert membraan te vormen. </li><li> Plaats het inzetstuk en schuif onder de DMD. Induceren PEG verknoping door blootstelling aan UV-licht. Vanwege de geringe dikte van de PEG laag, kan verknopen worden afgerond in slechts 15 seconden bij 5,0 Watt / cm 2 incident op de DMD. </li><li was de insert drie keer met steriele dpbs en pen-strep. het voortbestaan een olieachtig residu is punt van zorg kan mild schoonmaakmiddel zoals tween worden toegevoegd aan wasbuffer.><li> Bewaar de insert in een 6-well weefselkweek plaat. Voeg groeimedium aan gesuspendeerd cellen, in de gewenste concentratie, en pipet een voldoende volume van de celsuspensie in de cel cultuur te plaatsen om de gewenste cel dichtheid te verkrijgen. Vervolgens voeg genoeg groeimedium onder de insert volledig behouden levensvatbaarheid van de cellen (~ 1,5 ml). </li><li> Na 48 uur zijn verstreken, was de inzet drie keer met steriele DPBS en 1% Pen-Strep aan een unadhered cellen los te maken. Verandering media ongeveer een keer per 48 uur. </li></ol> 6. Representatieve resultaten Voorbeelden van dubbele hydrogel constructen die DRG explantaten zijn weergegeven in figuur 2. Merk op dat cellulaire migratie en neurieten uitbreiding is beperkt tot de cel tolerante streek van de dubbele hydrogel bouwen. Figuur 3 toont gescheiden cellen op dezelfde ingekapseld in de dubbele hydrogel constructen. Vanwege het dynamische karakter van het DMD fotomasker, is de geometrie beschikbaar is voor inkapseling alleen beperkt door de afmetingen en resolutie van de optiek. Cel inkapseling was het ook mogelijk in een enkel fotopolymeriseerbare hydrogel, PEG, en een live / dode levensvatbaarheid test werd uitgevoerd, zoals blijkt in figuur 4. Inkapseling in PEG is alleen bedoeld als een voorbeeld, evenals PEG niet een ideale omgeving voor neurale cellen vertegenwoordigen. Daarom is de levensvatbaarheid van de cellen gerealiseerd in onze PEG construeert is begrijpelijk laag. Tot slot, zijn voorbeelden van het gebruik van dunne films PEG als een gedessineerde beperkend laag voor cel-adhesie op celkweek inserts weergegeven in figuur 5. Daarnaast zijn voorbeelden van mogelijke "slechte" resultaten aangeboden in Figuur 6. De resultaten vormen slechts een klein deel van de mogelijke toepassingen van de ontwikkelde methoden in ons lab. Ze zijn bedoeld om het gemak, veelzijdigheid en de levensvatbaarheid van onze aanpak aan te tonen, en kan worden behandeld als 'proof of principle "voor onderzoekers om hun eigen mogelijke aanpassingen te ontwikkelen. <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Schematische weergave van het lichtpad wordt gebruikt voor fotolithografie. Inzet: De UV-licht verlicht de DMD onder een hoek van 45 ° en 24 ° onder het vlak van de spiegel array. <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Gelabelde de groei en proliferatie in DRG met dual hydrogel constructen. AD) Afbeeldingen portretteren gepolymeriseerde PEG constructen (grijs) met neurieten gemerkt met Beta III tubuline (groen), DAPI gekleurde celkernen (blauw). De DRG explantaten zijn opgenomen in Puramatrix en gelegen in de circulaire regio's van de patroon, met neurieten groeien naar de splitsing (s). <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Dual hydrogel constructen die cellen gelabeld met calceïne AM, een levende cel marker, na 48 uur in groeimedium. AD) Verschillende PEG vormen, gevuld met Puramatrix met gedissocieerde DRG neuronen (~ 5x10 3 cellen / ml). <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig4.jpg" alt="Figuur 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4. Single hydrogel construct bevattende levende cellen gemerkt met Calceïne AM (groen) en dode cellen gelabeld met ethidium homodimeer-1 (rood) na 24 uur in groeimedium (5x10 3 cellen / ml). <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig5.jpg" alt="Figuur 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 5"> Figuur 5. Cell beperkende PEG gepolymeriseerd als een dunne film met behulp van een "test patroon" selectief gedissocieerde cellen zich aan het collageen gecoate membraan van doorlatend ondersteunt. A, B) Levende cellen zijn gelabeld na 48 uur met Calceïne AM (groen), terwijl de dode cellen zijn voorzien van ethidium homodimeer-1 (rood). Minimale celadhesie vindt plaats in het gebied met de dunne PEG film. <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig6.jpg" alt="Figuur 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 6"> Figuur 6. Vertegenwoordiger beelden van ongewenste resultaten. A) Gedeeltelijke polymerisatie van PEG, wat leidt tot een onbruikbaar PEG te bouwen. Onjuiste polymerisatie kan worden beïnvloed door de aanwezigheid van een meniscus in de pre-polymeer medium, onvoldoende hoeveelheden van de polymerisatie medium, onvoldoende UV-blootstelling of oneigenlijk focus van de optiek plaatsvinden. B) Image portretteren gepolymeriseerde PEG constructen (grijs) met neurieten gemerkt met Beta III tubuline (groen), DAPI gekleurde celkernen (blauw). De neurieten waren in staat om te groeien buiten het patroon PEG-kanalen. Dit gebeurt vaak in de voorwaarde dat Puramatrix overflows op de top van de PEG deel tijdens de injectie.

<ol><li>Abbott, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture%3A+biology%27s+new+dimension%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell culture: biology's new dimension.</a> Nature. 424, 870-872 (2003).</li>
<li>Schindler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Living+in+three+dimensions%3A+3D+nanostructured+environments+for+cell+culture+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Living in three dimensions: 3D nanostructured environments for cell culture and regenerative medicine.</a> Cell Biochem Biophys. 45, 215-227 (2006).</li>
<li>Maltman, D. J., Przyborski, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developments+in+three-dimensional+cell+culture+technology+aimed+at+improving+the+accuracy+of+in+vitro+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Developments in three-dimensional cell culture technology aimed at improving the accuracy of in vitro analyses.</a> Biochemical Society Transactions. 38, 1072-1075 (2010).</li>
<li>Smalley, K. S., Lioni, M., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+isn%27t+flat%3A+taking+cancer+biology+to+the+next+dimension%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev+Biol+Anim%22%5BJournal%5D)">Life isn't flat: taking cancer biology to the next dimension.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 42, 8-9 (2006).</li>
<li>Irons, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+neural+constructs%3A+a+novel+platform+for+neurophysiological+investigation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neural+Engineering%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional neural constructs: a novel platform for neurophysiological investigation.</a> Journal of Neural Engineering. 5, 333-341 (2008).</li>
<li>Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+in+rotating+bioreactors+promotes+maintenance+of+cardiac+myocyte+electrophysiology+and+molecular+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Cultivation in rotating bioreactors promotes maintenance of cardiac myocyte electrophysiology and molecular properties.</a> Tissue Eng. 9, 1243-1253 (2003).</li>
<li>Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taking+cell-matrix+adhesions+to+the+third+dimension%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Taking cell-matrix adhesions to the third dimension.</a> Science. 294, 1708-1712 (2001).</li>
<li>Cushing, M. C., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Materials+science.+Hydrogel+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Materials science. Hydrogel cell cultures.</a> Science. 316, 1133-1134 (2007).</li>
<li>Kloxin, A. M., Kasko, A. M., Salinas, C. N., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodegradable+hydrogels+for+dynamic+tuning+of+physical+and+chemical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Photodegradable hydrogels for dynamic tuning of physical and chemical properties.</a> Science. 324, 59-63 (2009).</li>
<li>Geckil, H., Xu, F., Zhang, X., Moon, S., Demirci, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+hydrogels+as+extracellular+matrix+mimics%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Engineering hydrogels as extracellular matrix mimics.</a> Nanomedicine (Lond). 5, 469-484 (2010).</li>
<li>Luo, Y., Shoichet, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+photolabile+hydrogel+for+guided+three-dimensional+cell+growth+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">A photolabile hydrogel for guided three-dimensional cell growth and migration.</a> Nature Materials. 3, 249-253 (2004).</li>
<li>Wylie, R. G., Shoichet, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+micropatterning+of+amines+within+an+agarose+hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Two-photon micropatterning of amines within an agarose hydrogel.</a> Journal of Materials Chemistry. 18, 2716-2721 (2008).</li>
<li>Ji, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+three-dimensional+hyaluronic+acid+nanofibrous+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Electrospun three-dimensional hyaluronic acid nanofibrous scaffolds.</a> Biomaterials. 27, 3782-3792 (2006).</li>
<li>Moeller, H. C., Mian, M. K., Shrivastava, S., Chung, B. G., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microwell+array+system+for+stem+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A microwell array system for stem cell culture.</a> Biomaterials. 29, 752-763 (2008).</li>
<li>Xu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viability+and+electrophysiology+of+neural+cell+structures+generated+by+the+inkjet+printing+method%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Viability and electrophysiology of neural cell structures generated by the inkjet printing method.</a> Biomaterials. 27, 3580-3588 (2006).</li>
<li>Liu Tsang, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+3D+hepatic+tissues+by+additive+photopatterning+of+cellular+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Fabrication of 3D hepatic tissues by additive photopatterning of cellular hydrogels.</a> FASEB J. 21, 790-801 (2007).</li>
<li>Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+tectonics%3A+A+comprehensive+construction+platform+for+microfluidic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Microfluidic tectonics: A comprehensive construction platform for microfluidic systems.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 13488-13493 (2000).</li>
<li>Lu, Y., Mapili, G., Suhali, G., Chen, S. C., Roy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+digital+micro-mirror+device-based+system+for+the+microfabrication+of+complex%2C+spatially+patterned+tissue+engineering+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+A%22%5BJournal%5D)">A digital micro-mirror device-based system for the microfabrication of complex, spatially patterned tissue engineering scaffolds.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 77, 396-405 (2006).</li>
<li>Naiser, T., Mai, T., Michel, W., Ott, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+maskless+microscope+projection+photolithography+system+and+its+application+in+light-directed+fabrication+of+DNA+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">Versatile maskless microscope projection photolithography system and its application in light-directed fabrication of DNA microarrays.</a> Review of Scientific Instruments. 77, 063711-063711 (2006).</li>
</ol>

De methode die hierin beschreven kunnen worden gebruikt door een onderzoeker op zoek naar eenvoudige en reproduceerbare celkweek systemen. Theoretisch, als gevolg van de grote verscheidenheid aan fotopolymeriseerbare hydrogels beschikbaar is, kan de omgeving worden afgestemd, zodat voor gebruik met elke cel type, waaronder hele weefsel explantaten. Daarnaast is de dual hydrogel systeem maakt het mogelijk voor een verbeterde ruimtelijke controle bij de presentatie van zelf-polymeriseren hydrogels, die de neiging hebben om amorfe vormen op hun eigen vorm. De resulterende &quot;2.5D&quot; micropatterned hydrogel construeert een 3D-matrix voor neurale groei gepresenteerd in een 2D-configuratie die handige microscopische evaluatie mogelijk maakt. De ondergrond waarop de gels worden gepolymeriseerd kan ook worden gevarieerd, waardoor meer controle in de experimentele design. Onze methoden zijn geoptimaliseerd voor gebruik met celkweek doorlaatbaar ondersteunt, zoals we hebben verbeterd levensvatbaarheid (figuur 4) gezien in vergelijking met de polymerisatie op glasplaatjes (gegevens niet getoond). Kunnen echter ook andere polymerisatie oppervlakken meer van toepassing zijn voor verschillende toepassingen: fabricage op glas slides gebruikt in microfluidics experimenten of mobiele aggregaat formaties, bijvoorbeeld. Onze ervaring met deze cultuur systemen heeft geleid tot de identificatie van mogelijke gebieden van problemen. Ten eerste zijn voorzichtig technieken die nodig zijn om de steriliteit van de constructen te behouden. Vanwege het volumineuze karakter van het DMD setup, is het moeilijk om polymerisatie stappen te opereren onder steriele omstandigheden. Ter bestrijding van dit probleem, de spoeling stap beschreven in de methoden is nuttig, en antibiotica moeten worden gebruikt in alle media. Daarnaast is de uiteindelijke dikte en de vorm van de gepolymeriseerde constructie is sterk afhankelijk van de vloeistof gedrag van de pre-polymeer mengsel, en de aanwezigheid van een meniscus kan resulteren in een gel constructies die te dun zijn of niet volledig gepolymeriseerd (Figuur 6). Twee stappen kunnen worden genomen om de vorming van een meniscus in de cel cultuur inserts te minimaliseren. Voor dikke hydrogels (&gt; 200 m), een eenvoudige coating van Rain-X rond de binnenwand van de insert voldoende is. Echter, kort zoals hierboven beschreven, voor dunne constructen (&lt;200 micrometer), is een olielaag nodig om zowel het minimaliseren van de meniscus en zuurstof afschrikken van de vrije radicalen polymerisatie te ontkrachten. Resolutie bleek te zijn afhankelijk van de dikte, met een daling in functie grootte gerealiseerd met steeds dikkere gels. De resolutie ook gevarieerd, afhankelijk van de vraag of de functie een positieve of negatieve reliëf vertegenwoordigd in de hydrogel. Toch behaalden we een voldoende resolutie voor de constructen met minimale functie maten op de schaal van ~ 100 micrometer met alleen microscoop doelstellingen focussen optiek. Onze experimenten hebben aangetoond dat de dual hydrogel construeert hier beschreven een uitstekende basis voor de vorming van basic in-vitro-modellen van neurieten groei en begeleiding te geven. De gebruikte techniek is micropatterning een aanpassing van de bestaande methoden 18,19, maar onze set-up benadrukte een eenvoudig te implementeren en ontwerpen was geoptimaliseerd voor de productie van dubbele hydrogel constructen op celkweek inserts; celkweek inserts zijn van vitaal belang voor het verbeteren van levensvatbaarheid van de cellen en als crosslinking rond eerder aanhangende weefsels explantaten. De omvang van de getoonde resultaten wordt beperkt door de belangen van ons lab, maar we geloven dat de methoden beschreven in deze publicatie nuttig zal blijken voor onderzoekers op zoek naar een relatief goedkoop, snel en gemakkelijk te gebruiken methode voor het vervaardigen van 3D-celkweek modellen.

<table><tbody><tr><td>Digital Micromirror Device</td><td>Texas Instruments</td><td>DLPD4X00KIT</td><td></td></tr><tr><td>Collageen-gecoat permeabel Transwell-steunmateriaal</td><td>Corning</td><td>3491</td><td>In het manuscript ook aangeduid als Cell Culture Insert</td></tr><tr><td>Polyester permeabel Transwell-steunmateriaal</td><td>Corning</td><td>3412</td><td>In het manuscript ook aangeduid als Cell Culture Insert</td></tr><tr><td>Neurobasal Medium</td><td>Invitrogen</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal runderserum</td><td>Invitrogen</td><td>16000-036</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>25030-164</td><td></td></tr><tr><td>Nerve Growth Factor</td><td>Invitrogen</td><td>13257-019</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Invitrogen</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>Puramatrix</td><td>BD Biosciences</td><td>354250</td><td></td></tr><tr><td>PEG 1000</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>15178</td><td></td></tr><tr><td>Irgacure 2959</td><td>Ciba Specialty Chemicals</td><td>0298913AB</td><td></td></tr><tr><td>Olie</td><td>Zowel koolzaadolie als siliconenolie gebruikt</td><td></td><td>Moet UV-transparant zijn en de vorming van een +/- meniscus minimaliseren</td></tr><tr><td>OmniCure Series 1000</td><td>EXFO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rain-X</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

fabricage van micropatterned hydrogelen voor neurale cultuur systems met behulp van dynamic mask projectie fotolithografie

Fabrication of Micropatterned Hydrogels for Neural Culture Systems using Dynamic Mask Projection Photolithography

In toenemende mate zijn patroon celcultuur-omgevingen steeds een relevante techniek om cellulaire kenmerken studie, en veel onderzoekers geloven in de noodzaak voor 3D-omgevingen te vertegenwoordigen in vitro experimenten die beter na te bootsen in vivo kwaliteiten 1-3. Studies op terreinen zoals onderzoek naar kanker 4, neurale techniek 5, hartfysiologie 6, en cel-matrix interacties 7,8 hebben aangetoond cel gedrag verschilt aanzienlijk tussen de traditionele monolaagculturen en 3D-constructies. Hydrogels worden gebruikt als 3D-omgevingen vanwege hun verscheidenheid, veelzijdigheid en het vermogen om op maat moleculaire samenstelling door functionalisering 9-12. Tal van technieken bestaan ​​voor de oprichting van constructies als cel-ondersteunende matrices, waaronder electrospinning 13, elastomeer postzegels 14, inkjet printen 15, additief photopatterning 16, statische fotomasker projectie-lithografie 17 en dynamische masker microstereolithography 18. Helaas, deze methoden omvatten meerdere productie stappen en / of apparatuur die niet gemakkelijk aan te passen aan de conventionele cel-en weefselkweek methoden. De techniek die in dit protocol past de laatste twee methoden, met behulp van een digitaal apparaat Micromirror (DMD) om dynamische fotomaskers voor de verknoping geometrisch bepaalde poly-(ethyleen glycol) (PEG) hydrogels, geïnduceerd door de UV-geïnitieerde polymerisatie van vrije radicalen te creëren. De resulterende &quot;2.5D&quot; structuren zorgen voor een beperkte 3D-omgeving voor neurale groei. We maken gebruik van een dual-hydrogel aanpak, waarbij PEG fungeert als een cel-restrictieve regio leveren structuur aan een anders vormeloze, maar cel-tolerante zelfassemblerende gel gemaakt van een Puramatrix of agarose. Het proces is een snelle eenvoudige stap fabricage die zeer reproduceerbaar en gemakkelijk aangepast voor gebruik met conventionele celcultuurmethoden en substraten. Hele weefsel explantaten, zoals embryonale achterwortelganglia (DRG), kunnen worden opgenomen in de dubbele hydrogel bouwt voor experimentele testen zoals neurietuitgroei. Bovendien kan gescheiden cellen worden ingekapseld in de fotoverknoopbare of zelf polymeriseren hydrogel, of selectief gehandeld op grond van de doorlaatbare membraan te ondersteunen met behulp van cel-restrictieve photopatterning. Met behulp van de DMD, creëerden we hydrogel constructies tot ~ 1 mm dik, maar dunne film (&lt;200 pm) PEG structuren werden beperkt door zuurstof doven van de vrije radicalen polymerisatiereactie. We vervolgens ontwikkelde een techniek gebruik te maken van een laagje olie boven de polymerisatie vloeistof die dunne PEG-structuur polymerisatie toegestaan. In dit protocol beschrijven we de snelle creatie van 3D-hydrogel-systemen voor de productie van microfabricated neurale cel-en weefselculturen. De dubbele aangetoond hydrogel bouwt hierin vertegenwoordigen veelzijdig in vitro modellen die nuttig kan zijn voor studies in de neurowetenschappen met betrekking tot overleving van de cel, migratie, en / of neurieten groei en begeleiding. Bovendien, als het protocol kan werken voor vele soorten van hydrogels en cellen, de mogelijke toepassingen zijn zowel gevarieerd en uitgebreid.

Eenvoudige technieken worden beschreven voor de snelle productie van microfabricated neurale cultuur systemen met behulp van een digitale microspiegeltjes voor dynamische masker projectie lithografie op regelmatige celcultuur substraten. Deze cultuur systemen kunnen meer representatief zijn voor natuurlijke biologische architectuur, en de beschreven technieken kan worden aangepast voor tal van toepassingen.

Fabricage van micropatterned Hydrogelen voor Neurale Cultuur Systems met behulp van Dynamic Mask Projectie Fotolithografie

Gepatroneerde celcultuur-omgevingen worden in toenemende mate een relevante techniek om cellulaire kenmerken te bestuderen, en veel onderzoekers geloven in de ...

Het algemene doel van deze procedure is het creëren van een micropatroon-gestuurd, duaal hydrogel-celcultuursysteem voor neuronale studies. Dit wordt bereikt door eerst weefselimplantaten, zoals embryonale dorsale wortelganglia, uit te platen op permeabele celcultuur-inserts. Vervolgens wordt er met behulp van een digital micro mirror device of DMD als dynamisch fotomasker een micropatroon gecreëerd in een fotocrosslinkbare hydrogel.Vervolgens wordt de zelfassemblerende hydrogel-like pure toegevoegd, die een suspensie van gedissocieerde cellen kan bevatten. Een juiste incubatietijd is noodzakelijk voordat de cellulaire analyse kan plaatsvinden. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de levensvatbaarheid van neuronale cellen en de uitgroei van neurieten tonen via specifieke geometrische configuraties die door de DMD zijn gedefinieerd.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is dat een dynamische fotomassa snel kan worden gecreëerd, gewijzigd en van een afstand kan worden geprojecteerd om vrijwel elk substraat te accommoderen, zoals permeabele celkweek-inserts. Hoewel deze methode inzicht kan bieden in neurale systemen, kan deze ook worden toegepast op andere systemen die baat hebben bij specificeerbare geometrische beperkingen, zoals celsignalering, celmigratie, cel-celcontact of morfogenese, om slechts enkele te noemen. De DMD-board UV-lampen, de geleider en de 4× objectieflens zijn allemaal verticaal gemonteerd op een trillingsisolatietafel.Een omgekeerde microscoop wordt onder de objectieflens geplaatst, zodat het van de DMD gereflecteerde focuslicht via de microscoop kan worden gevisualiseerd. Raadpleeg het bijbehorende geschreven protocol voor aanvullende details over de DMD-opstelling. Bereid eerst de zes met collageen gecoate celluurtuureinserts voor om X-explantculturen te ontvangen; coat de wanden van de celcultuureinserts met Rain-X, waarbij u er zorg voor draagt dat er geen Rain-X op het membraan zelf wordt aangebracht.Voeg vervolgens 1,5 milliliters aian-medium toe aan de inserts en incubeer deze overnacht bij 37 degrees Celsius en 5%carbon dioxide. Plaat de volgende dag, na het oogsten van embryonale dorsale wortelganglia van E 15 ratpups, tot vier DRG's op elke collageen-gecoate six-well insert en incubeer deze gedurende twee uur bij 37 degrees Celsius en 5%carbon dioxide om de DRG's aan het membraan te laten hechten.Na de incubatieperiode zijn de DRG's klaar voor fotopolymerisatie. Een digital micro mirror device is een array van 1024 bij 768 individuele spiegels, die licht selectief reflecteert op basis van de spiegelpositie. In deze procedure wordt de DMD gebruikt om ultraviolet licht te patroneren op foto CRO's, koppelbare hydrogels, waardoor specifieke hydrogelgeometrieën op een eenvoudige en snelle manier kunnen worden gecreëerd.Hoewel onze DMD een op zichzelf staande eenheid is, kan het apparaat ook worden geïntegreerd voor gebruik met veel bestaande microscopen. Haal eerst de DRGX-planten uit de incubator en aspireer alle overtollige vloeistof uit de insert. Voeg vervolgens 500 microliters polymerisatiemedium toe aan de binnenzijde van de insert.Breng de inserts met de DRGX-planten over naar een rain extre glazen objectglas en plaats het objectglas onder de DMD. Gebruik het ALP three basic graphical user interface-programma om het zwart-witbeeld dat als fotomasker zal dienen, op de DMD te laden. In dit geval is een vertakkende vorm gekozen om de implementatie van neurietgeleidingssystemen met behulp van een omgekeerde microscoop en een DI zichtbare lichtbron mogelijk te maken.Lijn het weefselexplantaat uit met de juiste locatie op het fotomasker, waarbij het licht dat via de DMD reflecteert als leidraad dient. Schakel vervolgens de zichtbare lichtbron om naar een UV-lichtbron. Belicht het polymerisatiemedium in de celcultuur.Plaats de insert tot de cross-linking van PEG is voltooid. Herhaal dit voor elke DRG op de insert. Was vervolgens elke insert drie keer met steriele dcos fosfaatgebufferde zoutoplossing bevattend 1% penicilline streptomycine.Voeg tot slot 1,5 milliliters groeimedium toe onder de celkweekinserts en laat dit 30 minuten equilibreren in een weefselkweekincubator bij 37 °C en 5% koolstofdioxide. Sonicate tijdens de incubatieperiode de pure matrix gedurende 30 minuten. Om de peptiden te solubiliseren, wordt de geleverde 1% oplossing verdund tot 0,15% in steriel water en aangevuld met één microgram per milliliter oplosbare laminine.Verwijder na 30 minuten de culturen uit de incubator en aspireer alle overtollige media uit de insert. Aspireer vervolgens, terwijl de holte onder een microscoop wordt gevisualiseerd, media uit de lege ruimte in het PEG-construct dat het DRGX-explantaat bevat. Pipetteer ongeveer 1 µL van de pure matrixoplossing in de holte rond het X-explantaat. Zorg ervoor dat de pure matrix niet overstroomt uit de PEG-holte.Pipetteer vervolgens 1,5 milliliters groeimedium onder de insert en plaats deze in de weefselkweekincubator bij 37 degrees Celsius en 5%carbon dioxide gedurende één uur. Om na deze tijd volledige adaptatie te garanderen, wordt het groeimedium vervangen waarna de culturen terug in de incubator worden geplaatst. Het groeimedium wordt elke 48 uur van de kweek vervangen.Hier worden voorbeelden getoond van dubbele hydrogelconstructen met DRGX-planten. De DRGX-planten zijn gelabeld voor groeimarkers en proliferatiemarkers. Het gepolymeriseerde PEG-construct verschijnt grijs, DRG-neurieten gelabeld met bèta-tubuline III verschijnen groen en DPI kleurt celkernen, zoals te zien is in het blauw.Let op dat de cellulaire migratie en retikextensie beperkt blijven tot het celpermissieve gebied van het dubbele hydrogelconstruct. Dubbele hydrogelinkapseling is geschikt bij het gebruik van elke zelfassemblerende gel en de fotocrosslinkbare gel. In dit geval dient PEG als structurele ondersteuning voor de geometrische presentatie van de zelfassemblerende gel.Bijvoorbeeld, pure matrix of aris. Het type gel en de keuze van het fotomasker zijn afhankelijk van de specifieke gewenste toepassing. Behandel de wanden van een polyester celkweekinsert met Rain-X, zoals eerder aangetoond.Breng de insert over naar een met Rain X gecoate objectglas en plaats deze onder de DMD. Voeg vervolgens 500 µL polymerisatiemedium toe aan de insert. Laad het juiste masker op de DMD voor dit overlevingsexperiment.Een cilindrische presentatie van pure matrix wordt gebruikt om de beeldvorming van cellen te ondersteunen. Stel de insert 55 seconden lang bloot aan UV-licht om peg-crosslinking te induceren na crosslinking. Was de nieuw gevormde holte met steriel DPBS en 1% pen strep.Gebruik een micropipet of een steriele wattenstaaf om alle overtollige vloeistof uit de holte te verwijderen. Bereid zuivere Matrixx voor door 30 minuten te soniceren, verdun tot 0,15% in steriel water, aangevuld met 1 µg/mL oplosbaar laminine en 10% sucrose. Pellet vervolgens de te cultiveren cellen door middel van centrifugatie.Aspireer het medium grondig van het celpellet en resuspendeer het pellet in de 0,15% pure matrix-oplossing tot een concentratie van ongeveer 5 × 10³ cellen per milliliter. Het is cruciaal dat al het medium uit het celpellet wordt geaspireerd, aangezien pure matrix begint met zelfassemblage zodra het in contact komt met een zoutoplossing. Pipetteer vervolgens ongeveer 1 µL van het aangevulde pure matrix-celmengsel in de opening van de peg.Dit volume is doorgaans voldoende om de lege ruimte te vullen zonder dat pipette 1,5 milliliter groeimedium onder het insert overloopt. Plaats vervolgens de pure matrix secundaire hydrogel in de weefselkweekincubator bij 37 °C en 5% CO₂ gedurende één uur om volledige gelering te waarborgen. Aspireer na deze tijd het medium en voeg vers medium onder het insert toe, waarbij u er zorg voor draagt dat de mechanisch zwakke pure matrix niet wordt beschadigd.Plaats de culturen terug in de weefselkweekincubator en ververs het medium elke 48 uur tijdens de kweek. Hier zijn voorbeelden van levende DRG-neuronen die zijn ingekapseld in verschillende duale hydrogelconstructen. Na 48 uur in groeimedium werden de cellen gelabeld met calcium am, een marker voor levende cellen die groen oplicht.Vanwege de dynamische aard van het DMD-fotomasker is de geometrie die beschikbaar is voor inkapseling hier uitsluitend beperkt door de afmetingen en resolutie van de optica. Een enkele hydrogel-inkapseling is geschikt wanneer de cellen kunnen worden onderzocht in een fotovernette hydrogel, vergelijkbaar met polyester-celculturen. Breng Rain-X aan en plaats dit onder de DMD op een met Rain-X gecoate objectglas.Pipette, zoals voorheen, de te kweken cellen bij de gewenste concentratie direct in het polymerisatiemedium en meng goed om een homogene distributie te waarborgen. Pipette vervolgens 500 microliters van het mengsel van polymerisatiemedium en cellen in de insert. Kies het juiste masker, laad dit op de DMD en induceer de PEG-crosslinking door blootstelling aan UV-licht gedurende 55 seconden.Voor celoverlevingsstudies wordt een basis cirkelvormig masker gebruikt om een cilinder weer te geven; was de insert drie keer met steriele DPBS en 1% pen strep, pipetteer vervolgens 1,5 milliliters groeimedium onder de insert en voldoende groeimedium bovenop om de insert volledig onder te dompelen; incubeer bij 37 degrees Celsius en 5% carbon dioxide met mediumverversingen elke 48 uur. Hier is een voorbeeld van levende gedissocieerde corticale neuronen ingekapseld in peg. Levende cellen zijn gelabeld met calcium am en verschijnen groen, terwijl dode cellen zijn gelabeld met ahy homodimer one en verschijnen rood.Inkapseling in PEG is enkel bedoeld als voorbeeld, aangezien PEG geen ideaal milieu vormt voor neurale cellen. De gekozen geometrie is een eenvoudige methode om de celviabiliteit te bestuderen, maar kan worden aangepast aan een breed scala aan structuren. Dunfilmhydrogels kunnen worden gebruikt om specifieke patronen van beperkte cellen te genereren.Behandel de polyester celkweek-insert opnieuw met Rain X zoals voorheen en plaats deze op een met Rain X behandelde objectglas. Pipetteer vervolgens 250 tot 300 µL polymerisatiemedium in de bodem van de behandelde celkweek-insert. Dit volume is voldoende om de bodem van de insert net te bedekken. Incubeer gedurende 30 tot 45 minuten bij kamertemperatuur om het medium door het membraan van de insert te laten dringen. Aspireer het overtollige medium uit de insert met een micropipet.Pipetteer vervolgens een voldoende hoeveelheid UV-transparante olie in de bodem van de insert om het oppervlak volledig te bedekken. Incubeer de insert gedurende 15 tot 30 minuten bij kamertemperatuur, wat lang genoeg is om de olie een duidelijke laag boven het polymerisatiemedium te laten vormen. Nadat het membraan van de insert is verzadigd, wordt een passend masker op de DMD geladen.Plaats de insert en het objectglas onder de DMD en induceer de crosslinking van de PEG door blootstelling aan UV-licht. Was de insert drie keer met steriele DPBS en 1% pen strap; breng de insert na het wassen over naar een weefkweekplaat met zes putjes om de te kweken cellen te oogsten en te pelletteren. Aspireer het medium en resuspendeer de celpellet in groeimedium bij de gewenste concentratie tussen 10⁴ en 10⁶ cellen per milliliter.Pipetteer vervolgens een voldoende volume van de cel-suspensie in de celluulteel-insert om de gewenste celdichtheid te verkrijgen. Voeg onder de insert voldoende groeimedium toe om de levensvatbaarheid van de cellen volledig te behouden. Incubeer bij 37 °C en 5% koolstofdioxide gedurende 48 uur.Was de insert drie keer met steriele DPBS en 1% pen strep om alle niet-gehechte cellen te verwijderen. Voeg vervolgens vers groeimedium toe aan de wells. Plaats de plaat terug in de weefselkweekincubator en ververs het medium elke 48 uur.Hier is de celrestrictieve PEG gepolymeriseerd als een dunne film met behulp van een testpatroon om gedissocieerde cellen selectief te laten hechten aan het met collageen gecoate membraan van permeabele supports. De cellen werden gelabeld na 48 uur incubatie. Levende cellen gelabeld met calc am verschijnen groen, terwijl dode cellen zijn gelabeld met atherium homodimer one en rood verschijnen.Er is te zien dat er minimale celadhesie optreedt in het gebied met de dunne PEG-film. Dit is een voorbeeld van een ongewenst resultaat. Gedeeltelijke polymerisatie van PEG heeft geleid tot een onbruikbaar PEG-construct.Onjuiste polymerisatie kan optreden door de aanwezigheid van een meniscus in het prepolymeermedium, onvoldoende hoeveelheden polymerisatiemedium, onvoldoende UV-blootstelling of een onjuiste focus van de optiek. Dit is een voorbeeld van een gebrekkige duale hydrogel 3D-inkapseling van A-D-R-G-X plantencultuur. Op deze afbeelding is te zien dat de in het groen zichtbare neurieten in staat waren om buiten de gepatrooneerde peg-kanalen te groeien.Dit gebeurt vaak als zuivere matrix tijdens de injectie over het PEG-gedeelte stroomt. Volg deze procedure. Andere standaardmethoden, zoals patchclamping of immunohistochemie, kunnen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden over bijvoorbeeld de elektrofysiologie of fenotypische expressie.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u dynamische maskerprojectie-fotolithografie kunt gebruiken om de geometrische presentatie van enkelvoudige of dubbele hydrogelsystemen te specificeren voor de studie van neuronale celculturen.

fabrication-micropatterned-hydrogels-for-neural-culture-systems-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

In dit protocol, tonen we de fabricage van een Microactuator reeks van verticaal verschoven berichten op de technologie gebaseerd is, en hoe deze basistechnologie kunnen worden gewijzigd om high-throughput mechanisch dynamische celkweek te voeren in zowel twee-dimensionale en drie-dimensionale cultuur paradigma's.

Microfabricated Platforms voor Mechanisch Dynamic Cel Cultuur

Protocollen voor enkel neuron microfluïdische arraying en water maskeren voor de in-chip plasma patroonvorming van biomateriaal coatings worden beschreven. Sterk verbonden co-culturen kan worden bereid met minimale cel ingangen.

Voorbereiding van Neuronale Co-culturen met Single Cell Precision

We beschrijven de fabricage van microgepatternde hydrogelvellen met behulp van een eenvoudig proces, dat kan worden geassembleerd en gemanipuleerd in een zelfstandige vorm. Met behulp van deze modulaire hydrogelvellen kan een eenvoudig macro-geschaald 3D-celkweeksysteem worden gegenereerd met een gecontroleerde cellulaire micro-omgeving.

Bouw van modulaire Hydrogel Sheets voor micropatterned Macro-schaal 3D Cellular Architecture

Hier presenteren we een protocol voor het isoleren en kweken van enkele cellen met een microfluïdische platform, dat een nieuw microwell-ontwerpconcept gebruikt om hoogwaardige isolatie van enkele cellen en langdurige klonale kweek mogelijk te maken.

Een microfluïdische platform voor High-throughput Single-cell Isolatie en Cultuur

We beschrijven een sequentieel proces voor lichtgemedieerde vorming en daaropvolgende biochemische patroonvorming van synthetische hydrogelmatrices voor toepassingen in driedimensionale celcultuur. De constructie en modificatie van hydrogels met cytocompatibele fotoclick-chemie wordt gedemonstreerd. Bovendien worden eenvoudige technieken gepresenteerd om patronen te kwantificeren en observeren en de celviabiliteit binnen deze hydrogels te bepalen.

Light-gemedieerde Vorming en patroonvorming van hydrogels voor Cultuur van de Cel Applications

Protocollen zijn beschreven voor de fabrikatie van afbreekbaar thermoresponsive hydrogels op basis van het hydrazon cross-linking van polymere oligomeren op de schaal van de bulk, microscale, en nanoscale, de laatste voorbereiding van zowel de nanofibers als de gel nanodeeltjes.

Fabriceren van afbreekbaar Thermoresponsive Hydrogels op meerdere lengte schalen via reactieve extrusie, Microfluidics, zelf-assemblage en Electrospinning

Dit protocol introduceert een lithografievrije micropatroonmethode die eenvoudig en toegankelijk is voor mensen met een beperkte bio-engineeringachtergrond. Deze methode maakt gebruik van aangepaste laser-cut stencils om micropatroon extracellulaire matrix eiwitten in een vorm van belang voor het moduleren van cel morfologieën. De procedure voor micropatterning wordt aangetoond met behulp van geïnduceerde pluripotente stamcel afgeleide cardiomyocyten.

Eenvoudige lithografie-vrije single cell micropatterning met behulp van Laser-Cut Stencils

Het hier gepresenteerde protocol maakt geautomatiseerde fabricage van micropatterns mogelijk die de celvorm standaardiseert om cytoskeletstructuren in zoogdiercellen te bestuderen. Deze gebruiksvriendelijke techniek kan worden opgezet met in de handel verkrijgbaar beeldvormingssystemen en vereist geen gespecialiseerde apparatuur die niet toegankelijk is voor standaard celbiologielaboratoria.

Controle van celgeometrie door infrarood laserondersteunde micropatterning

We beschrijven verbeteringen aan een standaardmethode voor het meten van cellulaire tractiekrachten, gebaseerd op microcontactprinten met een enkele subtractieve patroonstap van puntarrays van extracellulaire matrixeiwitten op zachte hydrogels. Deze methode zorgt voor een eenvoudigere en consistentere fabricage van eilandpatronen, essentieel voor het regelen van de vorm van de celcluster.

Patroongeneratie voor micropatterntractiemicroscopie

Traditioneel wordt celkweek uitgevoerd op vlakke substraten die de natuurlijke omgeving van cellen in vivo slecht nabootsen. Hier beschrijven we een methode om celkweeksubstraten te produceren met fysiologisch relevante gebogen geometrieën en micropatterned extracellulaire eiwitten, waardoor systematisch onderzoek naar cellulaire detectie van deze extracellulaire signalen mogelijk is.

Generatie van multicue cellulaire micro-omgevingen door UV-fotopatterning van driedimensionale celcultuursubstraten

3D-printen op micrometerschaal maakt snelle prototyping mogelijk van polymere apparaten voor neuronale celculturen. Als proof-of-principle werden structurele verbindingen tussen neuronen beperkt door barrières en kanalen te creëren die de uitgroei van neurieten beïnvloedden, terwijl de functionele gevolgen van dergelijke manipulatie werden waargenomen door extracellulaire elektrofysiologie.

Twee-foton polymerisatie 3D-printen van neuronale celkweekapparaten op microschaal

Leer hoe je micropatterned hydrogelen fabriceert voor neurale cultuursystemen met behulp van dynamic mask projection fotolithografie. Deze methode maakt snelle patronering van hydrogels mogelijk voor het bestuderen van neuronale groei en gedrag.

Fabricage van micropatterned Hydrogelen voor Neurale Cultuur Systems met behulp van Dynamic Mask Projectie Fotolithografie

Meer video's verkennen