Name: Western blotting Met behulp van de Invitrogen NuPage Novex Bis Tris minigels (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-08-22T00:00:00.000+00:00
Duration: 22 min 45 s
Description: Leer western blotting voor eiwitexpressie-analyse met het NuPAGE-systeem van Invitrogen. Deze methode omvat gel-elektroforese, eiwitoverdracht naar een membraan en immunodetectie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health en de George E. Hewitt Foundation fellowship (AP).

Gelelektroforese Technische noot: Voor het starten van de procedure, hebben uw eiwit monsters klaar. Tijdens deze eerste stap worden de eiwitten in het monster gescheiden op basis van hun moleculair gewicht met behulp van denaturerende polyacrylamide gel elektroforese (PAGE). De NuPAGE ® LDS Sample Buffer geladen met Lithium dodecylsulfaat (LDS) houdt Polypeptiden in een gedenatureerde toestand zodra het eiwit monster is verwarmd op 70 ° C gedurende 10 minuten. Een sterk reductiemiddel wordt gebruikt in combinatie met secundaire en tertiaire structuur (DTT, om disulfidebindingen te breken) te verwijderen. Daarnaast worden monsters eiwitten behandeld in de negatief geladen LDS en dus door de mazen van de acrylamide gel bewegen in de richting van de positief geladen elektrode. Dit maakt hun scheiding op basis van moleculair gewicht (gemeten in kilo Dalton, kDa). Gedetailleerde stap-voor-stap protocollen voor de monstervoorbereiding en de PAGE procedure is te vinden op de website van Invitrogen 2, of in de NuPAGE technische gids 3. Technische tips <ol><li> In de Invitrogen NuPAGE Bis-Tris discontinous buffer systeem, de elektroforetische mobiliteit van de eiwitten en de daaropvolgende scheiding bereik van de gel is afhankelijk van twee factoren: i) de acrylamide concentratie van de gel (met een grotere concentratie acrylamide wat resulteert in betere resolutie van de lagere moleculair gewicht eiwitten) en ii) de achterstand ion van de lopende buffer, MOPS of MES. Voor het kiezen van de juiste combinatie voor de scheiding bereik dat je wilt bereiken, verwijzen naar de Gel Migratie grafiek 1. De dikte van de gel en het aantal putten is afhankelijk van het volume en de hoeveelheid van de monsters die je van plan bent om respectievelijk laden,. </li><li> Wanneer u uw samples laden in putjes van de gel, is ten minste een rijstrook gereserveerd voor een moleculair gewicht marker (of ladder). Deze eiwitten normen zijn verkrijgbaar bij verschillende bedrijven en bestaan ​​meestal uit een mengsel van lood eiwitten met molecuulgewichten gedefinieerd, zodat de zichtbare banden waarmee u de migratie vorderingen te volgen vorm. Kies een reeks molecuulgewichten die compatibel is met uw gel resolutie. </li><li> Om tot een mooi en zelfs migratiepatroon adviseren wij het laden van al de putten van je gel met een vergelijkbaar volume van het monster of 1x LDS sample buffer. </li></ol> Overdracht Technische noot: Voordat u begint met de overdracht stap, de voorbereiding van de overdracht buffer (1x met 10% methanol) en de pre-afkoelen tot 4 ° C in een koude kamer. Om de eiwitten toegankelijk is voor opsporing van antilichamen te maken, worden ze overgebracht door electroblotting van de gel op een nitrocellulose membraan. De eiwitbinding is gebaseerd op hydrofobe interacties, evenals laden interactie tussen het membraan en eiwit. (Polyvinylideenfluoride (PVDF) membraan kan ook worden gebruikt als een alternatief. In dit geval is het PVDF membraan moet pre-nat worden in methanol minstens 30 seconden voor het gebruik.) Een gedetailleerde stap-voor-stap protocol van de overdracht procedure is te vinden in referentie 4 als u de Bio-Rad Mini Trans-Blot Elektroforetische Transfer Cell, of in referenties 2-3 als uw lab is uitgerust met de Invitrogen&#39;s XCell II ™ Blot Module. Als resultaat van dit proces worden de eiwitten blootgesteld op een dunne oppervlaktelaag en klaar voor de detectie. De uniformiteit en de algemene doeltreffendheid van de overdracht van eiwitten uit de gel op het membraan kan worden gecontroleerd door de kleurstof membraankleuring de omkeerbare Ponceau S. Ponceau S kleuringsprocedure (optioneel): <ol><li> Na de overdracht van de eiwitten, plaats het membraan in een incubatie tray (eiwitten naar boven). </li><li> Voeg genoeg Ponceau S Kleuring aan het membraan en van ten minste 30 seconden incuberen onder zacht schudden. </li><li> Spoel membraan met gedestilleerd water totdat de achtergrond is duidelijk. </li><li> Destain het membraan met stromend gedestilleerd water voor 2-3 minuten. </li><li> Plaats het membraan in het blokkeren van oplossing (zie hieronder). </li></ol> Technische tips: <ol><li> We raden de etikettering van uw membraan met een potlood voor de eiwit-overdracht in om de kant waar de eiwitten werden blootgesteld en de oriëntatie van uw monsters aan te duiden. </li><li> Beide Ponceau S kleuring en het moleculair gewicht markers kunnen worden gebruikt om het membraan na overdracht geknipt voor het sonderen van de resulterende delen met verschillende antilichamen </li></ol> Immunodetectie: Technische noot: Dit immunodetectie procedure wordt geleverd als slechts een richtlijn. Optimalisatie kan nodig zijn voor elke mieribody; specifieke informatie kan gevonden worden in de meeste data-sheets van de commercieel verkrijgbare antilichamen (bijvoorbeeld, werkverdunning, incubatietijd, etc.). Tijdens dit laatste proces, zal het doelwit eiwit worden gedetecteerd met behulp van een specifiek antilichaam en zal verschijnen als een band op de film. De positie van de band is afhankelijk van het molecuulgewicht van het target proteïne, terwijl de band intensiteit is afhankelijk van de hoeveelheid van target eiwit aanwezig is. Doorgaans wordt dit bereikt na drie deelstappen: <ol><li> Blocking: Om niet-specifieke interacties van het antilichaam te voorkomen met het membraan (de overtollige ruimte op het membraan is bedekt met een verdunde oplossing van een generieke eiwit). </li><li> Probing: Het eiwit van belang wordt gedetecteerd door een specifiek <a title="Primair antilichaam" href="http://en.wikipedia.org/wiki/Primary_antibody">primair antilichaam</a> . Na de ongebonden primaire antilichaam is weggespoeld, is het membraan blootgesteld aan een ander antilichaam gekoppeld aan de reporter <a title="Enzym" href="http://en.wikipedia.org/wiki/Enzyme">enzym</a> , <a title="Mierikswortelperoxidase" href="http://en.wikipedia.org/wiki/Horseradish_peroxidase">mierikswortel peroxidase</a> (HRP). Deze secundaire antilichaam is gericht tegen de soort-specifieke deel van het primaire antilichaam (bijvoorbeeld een anti-konijn secundair antilichaam zal binden aan een konijnen-source primair antilichaam). </li><li> Detectie: een chemiluminescentie middel wordt gebruikt als een substraat dat zal luminesceren wanneer ze worden blootgesteld aan de HRP op de secundaire antilichaam. Deze reactie produceert luminescentie op zijn plaats en in verhouding tot de hoeveelheid eiwit gepeild. Het licht wordt vervolgens gedetecteerd door een fotografische film. </li></ol> Een generieke stap-voor-stap procedure wordt hieronder gegeven. Andere gedetailleerde procedures zijn te vinden in de ECL Plus Western blotting Detection Reagentia handleiding 5 of in de meeste data-sheet bij de handel verkrijgbare antilichamen. Incubatietijd, antilichaamverdunning, en het blokkeren en was oplossingen moeten empirisch worden geoptimaliseerd voor elk antilichaam. Immunodetectie procedure: <ol><li> Blokkeer de niet-specifieke binding door incubatie met voldoende volume van de PBS 1% caseïne, het blokkeren van oplossing voor het hele membraan te dekken. Leg ze op een rocker gedurende minstens 30 minuten op kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C. </li><li> Incubeer het membraan met uw primaire antilichaam (specifiek voor het eiwit van belang). Het primaire antilichaam moet worden verdund in het blokkeren van oplossing. Voor de meeste antilichamen, is volledig bindend bereikt na 1-2 uur incubatie bij kamertemperatuur onder zacht schudden. Als alternatief kan de incubatie stap &#39;s nachts worden uitgevoerd bij 4 ° C om de signaal-ruisverhouding te verhogen. </li><li> Verwijder de oplossing (gooi of bij 4 ° C tot -20 ° C voor herhaaldelijk gebruik te houden) en snel een keer wassen het membraan. Dan 3x10 minuten met PBS, 0,05% Tween 20 (PBST) bij kamertemperatuur met krachtig schudden. </li><li> Incubeer het membraan met een HRP-gekoppelde tweede antilichaam verdund in het blokkeren van oplossing. Kies een antilichaam dat de IgG gedeelte van de soort waar de primaire antilichaam werd opgewekt herkent. De incubatie wordt uitgevoerd gedurende 1 uur bij kamertemperatuur onder zacht schudden. </li><li> Gooi de oplossing weg en snel een keer wassen het membraan. Dan 3x10 minuten met PBST bij kamertemperatuur met krachtig schudden. </li><li> Ga verder naar de chemiluminescentie-detectie volgens de fabrikant instructie. We gebruiken de ECL Plus Western blotting detectie reagentia van GE Healthcare (zie referentie 5 voor specifieke instructies). </li><li> Plaats uw membraan in Saran Wrap of een zakje en leg in een autoradiografie cassette. Zorg ervoor dat er geen vocht uitlekken en alle luchtbellen te verwijderen. </li><li> Expose de fotografische film membraan in een donkere kamer. Begin met een 1 minuut belichtingstijd en aanpassen aan de gewenste intensiteit van het signaal. </li></ol> Technische tips: <ol><li> Het blokkeren van niet-specifieke binding wordt bereikt door het plaatsen van de membraan in een verdunde oplossing van eiwit. We gebruiken meestal 1% caseïne, maar <a title="Bovine serum albumine" href="http://en.wikipedia.org/wiki/Bovine_serum_albumin">bovine serum albumine</a> (~ 2% BSA) of niet-vette droge melk (~ 5%) kan worden gebruikt als een alternatief. </li><li> Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) kan gebruikt worden tijdens de gehele procedure in plaats van PBS. Wij raden u aan TBS als u van plan uw membraan sonde met phosphospecific antilichaam. </li><li> Het gebruik van een glow-in-the-dark sticker (bijvoorbeeld Stratagene&#39;s Glogos ® II Autorad Markers) tikte in de bodem van de autoradiografie cassette zal u helpen om uw film en je membraan af te stemmen tijdens de analyse stap. </li></ol> Analyse Nu dat u uw film blootgesteld, zul je beseffen dat in de praktijk, niet alle Westerns eiwitten laten zien als een leuke single band. Additional bands kunnen ook worden weergegeven als gevolg van de niet-specifieke binding van zowel de primaire en secundaire antilichamen. Deze achtergrond signaal kan worden verminderd door het optimaliseren van de immunodetectie procedure. Daarnaast zal een passende controle (bijvoorbeeld ongetransfecteerde cellen, siRNA-behandelde cellen, enz.) nuttig zijn om de specificiteit van uw antilichaam en de exacte locatie van het doelwit eiwit op het membraan te bepalen. Na markering op de film de positie van de gekleurde eiwit standaard bands uit het membraan, plot de log van elke moleculair gewicht van het eiwit normen (y-as) tegen de bijbehorende relatieve mobiliteit (x-as). Relatieve mobiliteit (Rf) is de term die gebruikt wordt voor de verhouding van de afstand die het eiwit is verhuisd van haar punt van oorsprong (top van de gel) ten opzichte van de afstand die de tracking kleurstof of een laag moleculair gewicht marker is verhuisd (de gel voorkant) . Bepaal de regressielijn van de standaard curve om waarden voor de helling en de y-as te verkrijgen. De onbekende moleculair gewicht (grootte) van uw doelgroep eiwit wordt geschat met behulp van de Rf en de volgende gewijzigde vergelijking: log moleculair gewicht = (helling) (mobiliteit of Rf van het doelwit eiwit) + y-as (Zie referentie 6 voor gedetailleerde instructies). Expressieniveau benaderingen worden genomen door het vergelijken van de band intensiteit van het doelwit eiwit aan dat van een structurele eiwit (bijvoorbeeld, tubuline of actine) of een huishoudelijke genproduct, zoals GAPDH. Deze zogenaamde &quot;loading control&quot; mag niet veranderen tussen de monsters en wordt onthuld met behulp van een specifiek primair antilichaam. Het beeld kan verder worden geanalyseerd door densitometrie om de relatieve hoeveelheid van eiwitkleuring evalueren en kwantificeren van de resultaten in termen van optische dichtheid.

<ol><li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gel+Migration+chart%3A+%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Gel Migration chart: .</a> , 
 
 <a target="_blank" href="http://www.invitrogen.com/etc/medialib/en/filelibrary/pdf.Par.99253.File.dat/O-063575-NuPage_fin.pdf">http://www.invitrogen.com/etc/medialib/en/filelibrary/pdf.Par.99253.File.dat/O-063575-NuPage_fin.pdf</a> Forthcoming.</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+western-blot+protocol+from+the+Invitrogen+website%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Complete western-blot protocol from the Invitrogen website.</a> , 
		
 <a target="_blank" href="https://commerce.invitrogen.com/index.cfm?fuseaction=iProtocol.unitSectionTree&treeNodeId=A2C5758BC7C3438B01378A0940376C8E">https://commerce.invitrogen.com/index.cfm?fuseaction=iProtocol.unitSectionTree&treeNodeId=A2C5758BC7C3438B01378A0940376C8E</a> Forthcoming.</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NuPAGE+technical+guide%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">NuPAGE technical guide.</a> , 
 
 <a target="_blank" href="http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/nupage_tech_man.pdf">http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/nupage_tech_man.pdf</a> Forthcoming.</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Instruction+Manual%2C+Mini+Trans-Blot+Cell%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Instruction Manual, Mini Trans-Blot Cell.</a> , 
 
 <a target="_blank" href="http://www.bio-rad.com/cmc_upload/0/000/013/280/M1703930E.pdf">http://www.bio-rad.com/cmc_upload/0/000/013/280/M1703930E.pdf</a> Forthcoming.</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ECL+Plus+Western+blotting+detection+reagents+instruction%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">ECL Plus Western blotting detection reagents instruction.</a> , 
 
 <a target="_blank" href="http://www5.gelifesciences.com/aptrix/upp00919.nsf/Content/139B41E53EDC6210C1256EB40044ACE3/$file/RPN2132PL_Rev_D_2006_web.pdf">http://www5.gelifesciences.com/aptrix/upp00919.nsf/Content/139B41E53EDC6210C1256EB40044ACE3/$file/RPN2132PL_Rev_D_2006_web.pdf</a> Forthcoming.</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+protein+molecular+weights+by+SDS+gel+electrophoresis%2C+GE+Healthcare+Website%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Estimation of protein molecular weights by SDS gel electrophoresis, GE Healthcare Website.</a> , 
 
 <a target="_blank" href="http://www1.gelifesciences.com/aptrix/upp00919.nsf/Content/elpho_applications~elpho_applications_1d_protein_analysis~elpho_sds_page~Elpho_1D_SDS+PAGE+2+Estimation+of+protein+molecular+weights+by+SDS+gel+electrophoresis+~3.+Procedure">http://www1.gelifesciences.com/aptrix/upp00919.nsf/Content/elpho_applications~elpho_applications_1d_protein_analysis~elpho_sds_page~Elpho_1D_SDS+PAGE+2+Estimation+of+protein+molecular+weights+by+SDS+gel+electrophoresis+~3.+Procedure</a> Forthcoming.</li>
<li>Yeromin, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+identification+of+the+CRAC+channel+by+altered+ion+selectivity+in+a+mutant+of+Orai%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular identification of the CRAC channel by altered ion selectivity in a mutant of Orai.</a> Nature. 443, 226-229 (2006).</li>
<li>Zhang, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Store-dependent+and+-independent+modes+regulating+CRAC+channel+activity+of+human+Orai1+and+Orai3%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Store-dependent and -independent modes regulating CRAC channel activity of human Orai1 and Orai3.</a> J. Biol. Chem. 283, 17662-17671 (2008).</li>
<li>Penna,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CRAC+channel+consists+of+a+tetramer+formed+by+Stim-induced+dimerization+of+Orai+dimers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The CRAC channel consists of a tetramer formed by Stim-induced dimerization of Orai dimers.</a> Nature. , Forthcoming.</li>
</ol>

De procedure hier gepresenteerde maakt gebruik van een Bis-Tris gel met MES draait buffer als een voorbeeld van de denaturering PAGE het gebruik van de Invitrogen NuPAGE Novex elektroforese-systeem. Daarnaast is deze pre-cast gel systeem maakt het mogelijk scheiding van eiwitten onder denaturerende of niet-denaturerende omstandigheden en is geschikt voor een breed scala aan moleculaire gewichten (1-200 kDa voor de Bis-Tris gels naar 36-400 kDa voor de Tris- Acetaat gels). Afhankelijk van uw experiment, kunt u ervoor kiezen om slechts een de...

western blotting met behulp van de invitrogen nupage novex bis tris minigels

Western Blotting Using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels

Western Blotting (of immunoblotting) is een standaard laboratorium procedure die de onderzoekers om de expressie van een eiwit te controleren, bepalen de relatieve hoeveelheid van het eiwit aanwezig is in verschillende monsters en analyseren van de resultaten van co-immunoprecipitatie experimenten. In deze methode, is een doelwit eiwit gedetecteerd met een specifiek primair antilichaam in een bepaald monster van weefsel homogenaat of het uittreksel. Eiwit scheiding volgens moleculair gewicht is bereikt door het gebruik denaturerende SDS-PAGE. Na overdracht aan een membraan, is het doelwit eiwit gemerkt met een specifiek primair antilichaam en gedetecteerd door chemiluminescentie. Sinds de eerste beschrijving, heeft de westerse-blotting techniek ondergaan verschillende verbeteringen, waaronder pre-cast gels en gebruiksvriendelijke apparatuur. In ons laboratorium hebben we gekozen voor de commercieel beschikbare NuPAGE elektroforese systeem van Invitrogen. Het is een innovatief neutrale pH, discontinue SDS-PAGE, pre-cast mini-gel systeem. Dit systeem biedt verschillende voordelen ten opzichte van de traditionele Laemmli techniek zoals: i) een langere houdbaarheid van de pre-cast gels, variërend van 8 maanden tot 1 jaar; ii) een brede scheiding reeks molecuulgewichten 1 tot 400 kDa, afhankelijk van het type van de gel gebruikt, en iii) een grotere veelzijdigheid (range van acrylamide percentage, de aard van de gel, en de ionische samenstelling van de lopende buffer). De procedure zoals beschreven in deze video artikel maakt gebruik van de Bis-Tris discontinu buffersysteem met 4-12% Bis-Tris gradiënt gels en MES draaien buffer, als een illustratie van hoe een western blot-uit te voeren met behulp van de Invitrogen NuPAGE elektroforese-systeem. In ons laboratorium hebben wij goede en reproduceerbare resultaten voor diverse biochemische toepassingen het gebruik van deze western-blotting methode.

Deze technische artikel beschrijft een standaard western-blot procedure met behulp van de commercieel verkrijgbare NuPAGE elektroforese Mini-Gel systeem van Invitrogen.

Western blotting Met behulp van de Invitrogen NuPage Novex Bis Tris minigels

Western blotting (of immunoblotting) is een standaard laboratoriumprocedure waarmee onderzoekers de expressie van een eiwit kunnen verifiëren, de ...

Hallo, mijn naam is OB Pena. Ik werk in het Michael Car Lab van de afdeling fysiologie en biofysica van de University of California. Vandaag laat ik u zien hoe u een western blot uitvoert met behulp van het nieuwe page-systeem van Individual Gene.Dit is een basistechniek om de eiwitexpressie te analyseren en zo de resultaten van precipitatie-experimenten te controleren. Western blot-technieken bestaan uit drie basistappen: het laden en runnen van de gel, het overbrengen van het eiwit van de gel naar een nitrocellulosemembraan en het immunologisch sonderen van het membraan. Vandaag zal ik deze techniek gebruiken om de expressie van een eiwit in getransfecteerde cellen te analyseren.Ik bereid het monster voor, zodat de eiwitmonsters altijd worden opgelost in een monsterbuffer voor X. Deze monsterbuffer bevat een kleurstof om u te helpen bij het laden van uw monster en glycerol om het monster naar de bodem van de put te laten zakken. Het bevat daarnaast buffer en LDS. Dit is een detergent met een negatieve lading waarmee we het eiwit kunnen laden, zodat het eiwit in het elektrisch veld migreert op basis van het molecuulgewicht en ongeacht de lading.U moet ook reductiemiddelen zoals DT

western-blotting-using-the-invitrogen-nupage-novex-bis-tris-minigels

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

In deze video, beschrijven we de karakterisering van multiprotein complexen (MPL), door blauwe inheemse polyacrylamide gel elektroforese (BN-PAGE). In een eerste dimensie, worden gedialyseerd cellulaire lysaten gescheiden door BN-PAGE om individuele Mediterrane partnerlanden te identificeren. In een tweede dimensie SDS-PAGE, zijn mediterrane partnerlanden van belang verder onderverdeeld naar hun kiezers te analyseren door immunoblotting.

Blauwe Inheemse polyacrylamidegelelektroforese (BN-PAGE) voor de Analyse van multiprotein complexen van Cellular Lysaten

Western blotting is een analytische techniek die gebruikt wordt om specifieke eiwitten te detecteren in een monster van weefsel homogenaat of het uittreksel.

Western Blotting: Monstervoorbereiding naar Detectie

Ons protocol legt uit hoe meerdere eiwitten gels gieten in een tijd van recycling Invitrogen Nupage Novex MiniGel cassettes, en goedkope materialen die zijn aangeschaft bij een bouwmarkt te vinden. Deze voordelige gestroomlijnd werkwijze omvat een manier om de gels bewaren bij 4 ° C gedurende enkele weken. Door hergebruik van kunststof gel cassettes uit de handel verkrijgbare gels, laboratoria dat frequent eiwit gels draaien kan besparen aanzienlijke kosten en help het milieu.

Gieten en runnen van een eiwitgel door hergebruik van Commercial Cassettes

This video describes multimeric PAGE for separating native protein complexes from tissue homogenates. The technique is a hybrid of blue native-PAGE and SDS-PAGE techniques. The separated complexes can be characterized and studied for their role in cell functioning.

Multimer-PAGE for Separating Native Protein Complexes: A Hybrid Separation Technique Consisting of Blue Native-PAGE and SDS-PAGE to Separate Intact Multimeric Proteins From Tissue Lysate

V3 workflow is een westerse vlek procedure met behulp van vlekvrije gels. De vlekvrije technologie stelt onderzoekers in staat om de kwaliteit van eiwitscheiding te visualiseren, de overdrachtsefficiëntie te verifiëren en vooral om de verandering in het eiwit van belang te valideren met behulp van totale eiwitkwantificering als een betrouwbare belastingscontrole.

V3 Vlekvrije workflow voor een praktische, handige en betrouwbare totale eiwitbelastingscontrole in Western Blotting

Dit protocol verkent de nieuwste ontwikkelingen in het uitvoeren van Western blot analyses. Deze nieuwe modificaties maken gebruik van een Bis-Tris gel systeem met een 35 min elektroforese looptijd, een 7 minuten droge blotting transfersysteem en infrarood fluorescerend eiwit en beeldvorming dat hogere resolutie, kwaliteit, gevoeligheid en verbeterde nauwkeurigheid van Western gegevens genereert.

De snelste West in de stad: Een eigentijdse variant op de klassieke Western Blot analyse

Een gemeenschappelijke eiwitextractie protocol met behulp van ureum / thioureum / SDS buffer voor menselijke en muizen hersenweefsel maakt het identificeren van eiwitten door 2D-DIGE en de daaropvolgende karakterisering door mini 2DE immunoblotting. Deze methode maakt een meer reproduceerbare en betrouwbare resultaten te verkrijgen van menselijke biopsies en experimentele modellen.

Consensus Brain-afgeleide eiwit, Extraction Protocol voor de studie van mensen en muizen Brain Proteome behulp Zowel 2D-DIGE en Mini 2DE Immunoblotting

De vooruitgang van westerse blotting met behulp van fluorescentie heeft de detectie van subtiele veranderingen in eiwitexpressie mogelijk gemaakt, waardoor kwantitatieve analyses mogelijk zijn. Hier beschrijven we een robuuste methodologie voor de detectie van een reeks eiwitten in verschillende soorten en weefselsoorten. Er wordt ook een strategie geboden om veelvoorkomende technische problemen te overwinnen.

A Guide to Modern Kwantitatieve TL Western Blotting met Troubleshooting Strategies

Hier presenteren we protocollen voor affiniteitszuivering van eiwitcomplexen en hun scheiding door blauwe natieve PAGE, gevolgd door proteïne correlatie profilering middels label vrije kwantitatieve massaspectrometrie. Deze methode is nuttig voor interactomen in verschillende proteïnecomplexen lossen.

Het oplossen van Affiniteit gezuiverde eiwit complexen door Blue inheemse PAGE en Protein Correlatie Profiling

Hier presenteren we een protocol voor het analyseren van de samenstelling van de eiwitten van groot eiwit: eiwit en eiwit: nucleïnezuur complexen van koolzaad (B. napus) floëem afgescheiden met behulp van een 3D polyacrylamide-gel elektroforese (pagina) aanpak combineren blauw native (BN) met twee denatureren pagina's, gevolgd door massaspectrometrische identificatie.

Floëem Sap bemonstering van Brassica napus voor 3D-pagina van eiwit en Ribonucleoprotein complexen

Een protocol voor het ontrafelen van plant thylakoïde eiwit complexe organisatie en samenstelling met blauwe inheemse polyacrylamide gel elektroforese (BN-pagina) en 2D-SDS-pagina wordt beschreven. Het protocol is geoptimaliseerd voor Arabidopsis thaliana, maar kan worden gebruikt voor andere plantensoorten met kleine wijzigingen.

Analyse van eiwitcomplexen thylakoïde membraan door blauwe inheemse gelelektroforese

Leer western blotting voor eiwitexpressie-analyse met het NuPAGE-systeem van Invitrogen. Deze methode omvat gel-elektroforese, eiwitoverdracht naar een membraan en immunodetectie.

Western blotting Met behulp van de Invitrogen NuPage Novex Bis Tris minigels

Meer video's verkennen